纳米血管生成素-2小干扰RNA质粒制备及功能研究

[目的]制备血管生成素-2小干扰RNA(Ang-2siRNA)质粒纳米微粒，并观察其基因转染能力和基因沉默效果。[方法]应用分子克隆的方法构建Ang-2siRNA质粒，将其与聚乳酸、O-羧甲基壳聚糖用水／油／水(W／O／W)双乳化溶剂蒸发法制备纳米微球，扫描电镜观察其形态和粒径。然后转染原代人脐带静脉内皮细胞，观察纳米Ang-2siRNA微粒干扰Ang-2基因表达的效果及其细胞保护功能。[结果]扫描电镜观察到Ang-2siRNA纳米微球呈球形和椭球形，粒径150～200nm，大小分布均匀，包封完整，分散性良好。有较强转基因能力，良好的RNA干扰效果和血管内皮细胞保护功能。[结论]成功制备纳米Ang-2siRNA微粒，并证实其载基因能力和RNA干扰效果，对血管内皮细胞损伤因素有良好保护作用，为进一步研究心肌梗死的血管修复机制奠定了坚实的基础。     

靶向血管内皮生长因子的纳米颗粒制备及其对大肠癌细胞株SW620的作用

目的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在肿瘤新生血管形成过程中起关键性调控作用,是肿瘤靶向治疗的重要靶点之一。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是RNA序列特异性转录后的基因沉默现象。小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)可介导同源mRNA降解。纳米颗粒黏附性强、体积小,可随血液循环进入细胞内,提高药物的生物利用度。在纳米颗粒表面整合精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)小肽配体可增加纳米颗粒与表达整合素的肿瘤细胞的特异性结合。聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)-聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)是构建纳米颗粒的材料。文中利用RGD-PEG-PEI纳米材料构建载有靶向VEGF mRNA的siRNA质粒(psiRNA),并检测其转染大肠癌细胞株SW620的效率。方法制备由U6启动子驱动、可在哺乳动物细胞内稳定表达的VEGF靶向性质粒,与RGD修饰的PEG-PEI纳米载体结合后形成纳米复合物。测定所制备的纳米复合物的粒径、包封率和体外释放特性,并检测其对大肠癌细胞株SW620的作用。结果所制备的纳米复合物平均粒径为(142.3±21.6)nm,包封率为(83.5±5.8)%,大部分质粒在2周内释放,转染大肠癌细胞株SW620后72 h转染效率达最高,VEGF mRNA的抑制效率为78.4%。结论 RGD-PEG-PEI纳米基因载体转染效率较高,RGD-PEG-PEI/psiRNA可有效降低大肠癌细胞株SW620中VEGF mRNA的表达量,具有着良好的应用前景。     

小干扰RNA沉默组织因子基因对肝癌侵袭转移能力的影响

目的 应用RNA干扰(RNAi)技术抑制人类肝癌细胞内组织因子(TF)基因表达,从而探讨对其侵袭转移能力的影响。方法 本实验以人类肝癌细胞系HepG2细胞株为实验对象,将携带有针对TF小干扰RNA( siRNA)序列的质粒pGPU6/GFP/Neo-TF siRNA,转染HepG2细胞株,以适当浓度的G418筛选获得阳性克隆,通过RT-PCR和蛋白质印迹法比较转染TF siRNA(+)质粒、转染TF siRNA( -)质粒以及未转染任何质粒的HepG2细胞内源性TF在基因及蛋白质表达水平的差异,进而应用Transwell体外侵袭实验检测三者的侵袭转移能力,探讨TF对肿瘤细胞侵袭转移能力的影响。结果 (1) RT-PCR结果 显示,转染TF siRNA(+)质粒的HepG2细胞其内源性TF表达水平低于转染TF siRNA（-）质粒和未转染质粒的表达水平。(2)蛋白质Western印迹法结果 显示,转染TFsiRNA(+)质粒的HepG2细胞其内源性TF蛋白表达水平低于转染TF siRNA( -)质粒和未转染质粒的表达水平。(3) Transwell体外侵袭实验结果 显示,转染TF siRNA(+)质粒的HepG2穿膜细胞数[(14±10)个]少于转染TF siRNA（-）质粒的HepG2穿膜细胞数[(128±18)个],经t检验比较,两组差异有统计学意义（P＜0.05）。这提示应用RNA干扰技术抑制肿瘤细胞TF表达可以使HepG2细胞侵袭转移能力显著下降。结论 TF与肝癌细胞的侵袭转移能力密切相关,应用RNA干扰技术抑制其表达可以明显降低细胞HepG2体外侵袭转移能力。     

维生素D受体特异性siRNA表达载体的构建

目的通过构建维生素D受体（VDR）基因特异性siRNA（small interfering RNA）真核表达载体,检测其对血管内皮细胞（EC）中VDR基因的沉默作用,为进一步探讨VDR与心血管疾病发生发展关系的研究奠定基础。方法构建小鼠VDR特异性siRNA表达载体并测序,进行人EC/鼠EC的培养,进行siRNA转染试验,倒置荧光显微镜下观察细胞转染效率,Western blot进行鉴定。结果针对VDR基因的4个不同位点,设计、构建了4个siRNA干扰载体,经测序,序列全部正确。成功完成了人EC/鼠EC的培养及转染,荧光显微镜观察发现转染的重组质粒在EC内出现不同的转染效率,1号质粒的转染效率约为65%,2号质粒的转染效率约为50%,3、4号质粒的转染效率比较低。取转染效率较高的1、2号质粒做进一步转染干预,转染72h后,采用Western blot方法检测人EC/鼠EC内VDR蛋白质表达,与空白对照组比较1,、2号质粒在人EC中对VDR的表达无明显抑制作用,而在鼠EC中则有明显抑制作用,其中以1号质粒抑制效果最为明显,目的蛋白IOD/内参蛋白IOD比值发现两干扰组在人EC中对VDR的表达无明显抑制作用,而在鼠EC中则有明显抑制作用,其中以1号干扰质粒抑制效果最明显,抑制率达到了70%。结论成功完成了人EC/鼠EC的培养、转染及转染干预,并行Western blot鉴定,发现抑制效率明显的为鼠EC 1号质粒组。表明针对鼠VDR基因的siRNA表达载体有很强的特异性,并且对VDR基因干扰的位点不同表现的抑制效应不一。     

bcl-xL纳米微粒的制备及其对大鼠心肌细胞的高效转染

目的:制备包载含人类抗凋亡基因bcl-xL的纳米微粒,评价其转染大鼠心肌细胞的能力. 方法:用超声双乳化蒸发法制备包载bcl-xL的纳米微粒,扫描电镜观察纳米的形态和大小,DNase I消化酶试验检测其抗核酸酶能力;转染体外培养的大鼠心肌细胞后RT-PCR和Western-blot法检测基因表达. 结果:制备的纳米微粒直径约200～260 nm,包封完好,性能稳定并对基因有缓释作用;转染1 wk后bcl-xL表达高于对照组(P<0.05). 结论:成功制备包载真核表达质粒的纳米微粒,并能够高效转染大鼠心肌细胞. 纳米微粒是心肌细胞转染较理想的基因载体之一.     

纳米tPA基因和PDGF-B小干扰RNA预防兔实验性再狭窄

目的 探讨联合应用纳米组织型纤溶酶原激活物(tPA)基因质粒和血小板衍化生长因子B(PDGF-B)小干扰RNA预防血管再狭窄.方法 建立兔髂动脉再狭窄模型;构建壳聚糖纳米tPA基因载体和PDGF-B siKNA表达载体并在球囊损伤髂动脉同时在超声波的辅助下转染血管壁细胞和血管周围骨骼肌组织.实验分4组.对照组:单纯行内膜剥脱术;实验组A:内膜剥脱术+纳米tPA质粒;实验组B:内膜剥脱术+PDGF-B sigNA质粒;实验组C:内膜剥脱术+纳米tPA质粒+PDGF-B siRNA质粒.采用常规病理、免疫组织化学、原位杂交以及形态测量方法 观察对再狭窄血管血栓形成、血管内膜细胞增殖细胞核抗原(PCNA)和PDGF-B mRNA表达以及血管病变的影响.结果 成功转染tPA基因和PDGF-B mRNA小干扰RNA;两种基因单独应用和联合使用均显著抑制血管内膜细胞表达PCNA和PDGF-B mRNA;显著减少内膜厚度、内膜面积;使吻合口狭窄率显著减少实验A组54.12%、B组74.08%和C组79.09%.转染tPA基因组血管内血栓形成显著减少.联合应用两种基因效果优于单独使用.结论 联合应用纳米tPA基因和PDGF-B mRNA小干扰RNA在一定程度上抑制实验性免髂动脉再狭窄.     

载ACEshRNA表达质粒壳聚糖纳米转染培养的大鼠血管内皮细胞实验性研究

目的研究载血管紧张素转化酶短发卡RNA(ACEshRNA)表达质粒壳聚糖纳米颗粒对体外培养大鼠血管内皮细胞的转染效率。方法采用离子交联法制备壳聚糖纳米粒,喷金扫描电子显微镜鉴定;通过静电吸附复合ACEshRNA表达质粒,采用琼脂糖凝胶电泳分析载体与DNA结合能力;用体外培养大鼠血管内皮细胞转染实验,评价体外壳聚糖颗粒的转染能力。结果体外对培养的大鼠血管内皮细胞的转染实验显示,绿色荧光蛋白的表达,说明该壳聚糖有一定的转染效率,且在壳聚糖与质粒体积比为1∶3时转染率最高。结论本研究制备的载ACEshRNA表达质粒壳聚糖纳米载体,能在体外培养的大鼠血管内皮细胞实现有效转染,并且为进一步转染条件的优化奠定实验基础。     

RNA干扰VEGF-C基因下调COX-2、Bcl-2表达对乳腺癌细胞凋亡的影响

 目的 利用人血管内皮生长因子-C（vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C）小RNA干扰（siRNA）表达载体——重组质粒pSilencer3.0-VEGF-C/siRNA,研究VEGF-C基因下调抑制COX-2、Bcl-2表达及对人乳腺癌细胞株MDA-MB-435的体外作用。方法 pSilencer3.0-VEGF-C/siRNA表达质粒和阴性对照质粒稳定转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-435、RT-PCR和Western blot检测转染前后VEGF-C、COX-2基因和VEGF-C、COX-2、Bc1-2蛋白的表达;MTT法和流式细胞仪检测VEGF-C RNA干扰对细胞的作用。结果 pSilencer3.0-VEGF-C/siRNA转染乳腺癌细胞MDA-MB-435、VEGF-C基因和蛋白水平表达量明显降低,COX2和Bcl-2表达下调,细胞体外活性下降,72 h后凋亡率达60%。结论 针对人VEGF-C基因的siRNA表达载体抑制VEGF-C表达的同时下调COX-2和Bcl-2的表达,促进乳腺癌细胞MDA-MB-435的凋亡。     

整合素β1基因剔降血管内皮细胞株的建立及其增殖活力研究

目的 构建人整合素(integrin)β1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体(pGenesil-integrinβ1),建立integrin β1剔降血管内皮细胞株,观察integrin β1对EA.hy926细胞株增殖的影响.方法 合成integrin β1 siRNA模板,经退火后插入到pGenesil-1荧光载体.阳性重组质粒经DoTAP转染至EA.hy926细胞中.蛋白印迹观察pGenesil-integrinβ1表达载体对目的蛋白integrin β1 表达的抑制效率,绘制转染基因前后细胞生长曲线.结果 经酶切、测序验证,pGenesil-integrinβ1重组质粒构建成功.转染细胞后,可明显抑制integrin β1的表达.整合素β1基因剔降血管内皮细胞株细胞增殖减慢,与EA.hy926细胞株相比,生长曲线右移.结论 成功构建了pGenesil-integrin β1 重组质粒,建立了integrin β1下调细胞株,下调integrin β1表达对血管内皮细胞增殖产生负调控作用.     

磁性小干扰RNA纳米微粒的制备及其转染人膀胱癌细胞对沉默survivin基因表达影响的研究(英文)

目的研究磁性小干扰RNA（silkNA）重组质粒纳米微粒的制备及其在外磁场协同作用下转染人膀胱癌细胞对膀胱癌细胞凋亡和沉默survivin基因表达的影响。方法利用化学共沉淀法制备葡聚糖磁性纳米微粒（DMN）并作为基因载体，通过多聚赖氨酸静电吸附作用制备磁性siRNA—survivin—DMN重组质粒纳米微粒，并在外磁场的协同作用下体外转染人膀胱癌BIU-87细胞，分别采用四甲基偶氮唑蓝比色法、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术法、半定量逆转录聚合酶链反应和Westem Blotting检测BI—U-87细胞的生长抑制率（IR）、凋亡指数（AI）、survivinmRNA及其蛋白的相对表达水平。结果构建成功的siRNA-DMN直径、有效粒径、比饱和磁化强度分别为10-12nm、94．8nm、0．19emu／g。DMN在外磁场的协同作用下转染siRNA重组质粒入BIU-87细胞后的IR（39．60％）、AI（28．72％）均分别显著高于对照组和无磁场协同作用的siRNA—DMN组（1．99％、3．75％和20．96％、16．71％）（均P〈0．05），survivin mRNA及其蛋白相对表达水平均显著低于后2组。结论磁性siRNA—DMN纳米微粒在外磁场的协同作用下转染BIU-87细胞后可有效抑制survivin基因表达并诱导细胞凋亡，为膀胱肿瘤的磁靶向基因治疗提供实验依据。     

抑制FoxO1基因表达的siRNA重组腺病毒载体的构建及功能鉴定

目的 构建针对转录因子FoxO1的siRNA腺病毒载体，并鉴定重组腺病毒在人肝癌细胞系HepG2中对内源性FoxO1基因表达的影响。方法 设计并合成针对FoxO1的siRNA的靶DNA序列，克隆于穿梭载体pAdTrack-CMV中，与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组，转染293细胞，包装得到含si-FoxO1的重组腺病毒，体外转染人肝癌细胞系HepG2，Western blot检测FoxO1蛋白表达水平的变化。结果 成功构建针对FoxO1的siRNA重组腺病毒载体，该重组腺病毒能显著抑制HepG2细胞中FoxO1蛋白的表达（P〈0．01）。结论 成功构建了针对FoxO1的siRNA重组腺病毒载体，能有效抑制HepG2细胞中FoxO1的表达。     

靶向Rab9 GTPase siRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向Rab 9 GTPase siRNA表达载体。方法设计有小发夹RNA结构靶向Rab9GT-Pase的68个碱基的寡核苷酸,克隆入表达载体pSUPER.neo EGFP,得到重组质粒pSUPER.neo EGFP-R1和pSUPER.neo EGFP-R2,通过限制性核酸内切酶酶切和DNA序列测定对重组质粒进行鉴定。结果经酶切鉴定寡核苷酸已成功插入表达载体pSUPER.neo EGFP,DNA序列分析表明插入片段序列与合成的siR-NA序列相同。结论成功构建了靶向Rab9 GTPase siRNA表达载体,为进一步研究Rab9 GTPase与麻疹病毒复制之间的关系奠定基础。     

小鼠MK基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建小鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的死亡受体(Mouse killer,MK)基因干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)重组腺病毒并在小鼠子宫基质细胞中鉴定其干扰作用.方法:人工合成靶向MK的siRNA干扰序列,将其克隆到穿梭载体psES-HUS上,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,得到pAdeasy-SES-HUS-MKsiRNA,在HEK293细胞中包装并扩增腺病毒颗粒.用纯化后的腺病毒混合液感染原代培养的小鼠子宫内膜基质细胞,RT-PCR及Western Blot检测基质细胞中MK的mRNA及蛋白表达水平.结果:Adeasy-SES-HUS-MKsiRNA混合液均效价为6.8 X 10~(11)pfu/ml,感染原代培养的小鼠子宫内膜基质细胞48h后,MK的mRNA及蛋白水平均显著下调.结论:构建的MK干扰表达腺病毒能有效地抑制MK基因的表达,为进一步研究MK在小鼠子宫基质细胞的功能提供了有效的工具.     

VEGF特异siRNA重组腺病毒构建及其对K562细胞增殖的抑制作用

目的 构建重组腺病毒Ad5-VEGFsi观察其抑制人红白血病K562细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达及其对K562细胞增殖抑制作用的影响.方法 ①合成针对人VEGF mRNA的特异性siRNA;将其插入穿梭质粒psES-HUS,命名为pSES-VEGFsi;后者与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组.酶切鉴定成功后,于HEK293细胞中包装、扩增,氯化铯超速梯度离心后得到滴度较高的重组腺病毒Ad5-VEGFsi;②Ad5-VEGFsi以最适感染复数(multiplicity of infection,MOI)感染K562细胞72 h后,RT-PCR及ELISA方法检测VEGF mRNA及细胞培养液上清VEGF蛋白表达、MTT法检测细胞增殖、流式细胞仪测定细胞凋亡率.结果 成功构建重组腺病毒Ad5-VEGFsi,氯化铯梯度离心纯化获得重组腺病毒滴度约4.6×1011pfu/ml;Ad5-VEGFsi感染K562细胞72 h后,VEGF mRNA水平与对照组相比下降了66.55%(P＜0.01),蛋白浓度下降了 86.03%(P＜0.01).感染Ad5-VEGFsi后K562细胞生长明显受到抑制,且细胞的凋亡率也较对照组增加了13.89%(P＜0.01).结论 重组腺病毒腺Ad5-VEGFsi可明显抑制人白血病K562细胞VEGF的表达,从而抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡.     

血管内皮细胞生长因子RNA干扰真核表达载体的构建

目的构建特异性的人血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因siRNA真核细胞表达载体，为探索RNA干扰（RNM）分子靶向治疗非小细胞肺癌（NSCLC）的作用奠定基础。方法根据GenBank数据库提供的VEGF基因核苷酸序列，按照Keynolds设计原则，针对VEGF的序列及二级结构选择靶序列，设计双链小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA），再转化为能表达其小发卡结构RNA（Small hairpin RNAs，shRNA）的DNA序列，并与pRNAi-H1质粒定向连接，构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子Hl的真核表达载体pRNAi-H1VEGF siRNA，经限制性内切酶酶切、PCK和DNA测序进行鉴定。结果构建针对人VEGF的RNM真核细胞表达载体经限制性内切酶酶切、PCK和DNA测序证实与设计完全一致。结论针对人VEGF的RNM真核细胞表达载体构建成功。     

CD147 RNA干扰对前列腺癌细胞生长的影响

目的观察针对CD147RNA干扰对前列腺癌PC-3细胞生长的影响。方法用针对CD147分子的3个RNA干扰片段构建的表达载体转染PC-3细胞,获得稳定表达株。通过RT-PCR检测转染后CD147分子mRNA的表达水平变化;MTT法检测各组PC-3细胞增殖变化。结果RT-PCR结果发现第1、3干扰片段可以较好的封闭前列腺癌PC-3细胞CD147分子mRNA表达水平;MTT法显示CD147分子封闭后对前列腺癌PC-3细胞的生长无影响(P>0.05)。结论封闭CD147分子对前列腺癌PC-3细胞的生长无影响。     

乙酰肝素酶基因siRNA表达载体的构建及其沉寂作用

目的:构建针对人乙酰肝素酶(HPSE)基因的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对HPSE基因的干扰作用。方法:设计HPSE靶向的发夹状siRNA,合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pRNATU6.1载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹转染人恶性黑素瘤细胞A375,采用半定量PCR测定HPSE基因RNA水平变化,Western blot检测HPSE蛋白表达的变化。结果:将针对HPSE基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆到pRNATU6.1载体,经过阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确;转染A375细胞后,半定量PCR和Western blot检测显示,HPSE基因和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。结论:成功构建了针对HPSE基因的siRNA载体,转染细胞后可抑制HPSE的表达。     

Skp2-siRNA重组腺病毒载体构建及鉴定

目的:构建针对Skp2的siRNA腺病毒载体。方法:合成针对Skp2的siRNA靶DNA序列及相应阴性对照序列,退火成DNA双链,然后亚克隆穿梭质粒pShuttle-H1,Pme I线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,转染AD293细胞,包装得到pAd-Skp2-siRNA和pAd-Skp2-siRNA-NC重组腺病毒。用病毒体外感染结肠癌SW480细胞,Western blot检测Skp2蛋白表达水平。结果:重组腺病毒载体经酶切、鉴定正确,制备的病毒感染效率高,能显著抑制Skp2蛋白表达。结论:细菌内同源重组成功构建了Ad-Skp2-siRNA重组腺病毒及阴性对照病毒。     

CMV启动子调控的VEGF-shRNA表达载体的构建及有效干扰序列的筛选

目的:构建针对人VEGF基因的小干扰RNA(siRNA)的表达载体,实现CMV启动子调控,转染肿瘤细胞后观察其对VEGF基因的干扰作用,并筛选出有效的VEGF-shRNA.方法:设计三对VEGF靶向的发夹状shRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入质粒pDC311-SV40-RC中,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人骨肉瘤细胞U-2 OS,分别培养3d和7d后收集细胞培养上清液,ELISA检测上清中VEGF蛋白的表达.结果:将针对VEGF基因的siRNA的双链寡核苷酸片段成功克隆到pDC311-SV40-RC载体,经过阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确;转染U-2 OS细胞后,ELISA方法检测蛋白表达水平证实干扰序列3能有效降低VEGF的表达.结论:成功构建了CMV启动子调控的针对VEGF基因的siRNA载体,转染肿瘤细胞后可抑制VEGF的表达,并筛选出有效的干扰序列.     

PTTG靶向siRNA表达载体构建及其沉默效率评价

目的：构建针对人脑胶质瘤细胞系U251的高效率沉默垂体瘤转化基因(PTTG)的小分子干扰RNA(siRNA)表达载体。 方法：合成特异性干扰PTTG 的siRNA片段,并与pGenesil2 载体连接,构建PTTG干扰载体（pGenesil2-PTTG siRNA）。利用脂质体将其转染U251细胞,分为正常细胞对照组、HK阴性对照组和3个siRNA干扰组（pGenesil2-PTTG siRNA1、pGenesil2-PTTG siRNA2和pGenesil2-PTTG siRNA3）,应用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法和流式细胞术对转染后U251细胞中PTTG 的mRNA和蛋白表达水平进行分析。 结果：酶切证实PTTG-siRNA表达载体构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致;转染pGenesil2-PTTG siRNA后,3个干扰组的U251 细胞中PTTG基因和蛋白表达水平均较正常对照组显著降低（P<0.01）。 结论：成功构建了能高效率沉默PTTG 的RNAi表达载体;pGenesil2-PTTG siRNA高效地抑制了胶质瘤U251细胞中PTTG基因的表达。