幽门螺杆菌CagA基因的原核表达及抗原性测定

目的：合成胃癌相关幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的 CagA基因片段,建立原核表达系统,鉴定重组表达产物的抗原性。方法：选取前期研究确定的与胃癌相关的H.pylori CagA基因片段,优化设计并合成CagA基因,将合成的CagA基因从pUC57-CagA质粒中切出,用表达载体pET32a携带该基因转化宿主菌BL21(DE3),通过氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR挑选出阳性克隆pET32a-CagA;以IPTG诱导含pET32a-CagA的宿主菌表达融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析CagA蛋白表达情况,用Western印迹鉴定融合蛋白的抗原性。结果：设计并人工合成了CagA基因片段,序列测定结果显示,合成的CagA基因序列与设计的序列（AF289435）基本一致;成功构建pET32a-CagA原核表达质粒,对应蛋白序列与AAG09884同源性为100%;含pET32a-CagA的BL21(DE3)宿主菌经IPTG诱导后能表达CagA融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析结果表明,融合蛋白相对分子质量大小与预期一致(45 kD);Western印迹检测结果显示该融合蛋白可与抗H.pylori全菌抗体结合反应。结论：本实验构建的原核表达系统表达的CagA融合蛋白具有良好的抗原性,为临床胃癌相关H.pylori菌株的筛选和针对性治疗奠定了基础。     

人肠三叶肽在大肠杆菌中的表达

目的 构建三叶肽(TFF)原核重组质粒pET32a-TFF3,实现TFF3融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达并鉴定表达产物.方法 用Trlzol试剂提取人结肠组织mRNA,逆转录后经PCR扩增得到不含信号肽的TFF3编码序列,插入原核表达载体pET32a,构建pET32a-TFF3重组质粒,转化大肠杆菌BL-21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白.结果 酶切和测序证实pET32a-TFF3重组质粒构建成功.SDS-PAGE分析表明在IPTG浓度为1 mmol/L时,诱导6 h后蛋白表达量最大.Western blot分析表明,TFF3融合蛋白相对分子质量约为24×10~3,其能与兔源TFF3抗体特异性结合.结论 成功构建了pET32a-TFF3重组质粒,实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达,为后续深入研究TFF3奠定了基础.     

人颗粒溶素的原核表达

目的克隆人颗粒溶素基因并进行原核表达。方法体外培养外周血单个核细胞并抽提总RNA,RT．PCR扩增人颗粒溶素的基因片段,鉴定正确后构建原核表达质粒pET—GNLY9K和pET—GNLYl5K,并将其转入大肠杆菌Rosetta（DE3）,IPTG诱导表达融合蛋白,SDS—PAGE和Western—blotting鉴定融合蛋白的正确性。结果成功构建了原核表达载体pET—GNLY9K和pET—GNLY15K,经诱导在原核表达系统中高效表达了相应分子质量分别约为31和37kD的融合蛋白。结论利用原核表达体系成功表达了不同相对分子质量的颗粒溶素融合蛋白。     

人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶hAPE1融合蛋白的构建、纯化及其功能的初步研究

目的 构建人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(hAEP1)原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,对其活性进行初步分析.方法 用PCR法扩增hAEP1基因,克隆入pET28a载体中,获得重组质粒pET28a-hAPE1.将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达并鉴定.用His亲和层析技术进行蛋白纯化,得到hAPE1融合蛋白.用Western blot及电泳迁移率变动分析实验分析hAPE1融合蛋白的抗原性及活性.结果 所构建的重组质粒pET28-hAPE1经双酶切及DNA测序鉴定表明构建正确.IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE及Western blot鉴定均在预期位置出现阳性条带,His亲和层析纯化后得到hAPE1融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确.Western blot及电泳迁移率变动分析实验证明hAPE1融合蛋白具有抗原性、AP修复及氧化还原活性.结论 成功构建了人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶的原核表达载体pET28a-hAPE1,并在E. coli BL21(DE3)中高效表达和纯化得到有抗原性及活性的hAPE1融合蛋白.     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及其高效表达

目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法利用PCR技术，扩增出357bp的HCV核心蛋白基因片段，双酶切后将其插入到原核表达载体pET-32a，构建重组表达质粒pET-32a／HCVc。转化到大肠杆菌BL21中，IPTG诱导表达。SDS-PAGE鉴定表达情况，Western blot鉴定表达产物的抗原性。结果 经IPTG诱导后获得了目的蛋白的融合表达；SDS—PAGE电泳显示其在32000处有一条融和表达条带；Western blot结果显示其具有HCV抗原特异性。结论 HCV核心蛋白在大肠杆菌中获得高效表达，而且表达产物有良好的抗原性。     

HPV16 E7蛋白编码基因原核表达与鉴定

目的研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其细胞转化机制，对HPV16E7蛋白原核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板，采用PCR方法扩增HPV16E7基因，经BamH Ⅰ和Hind Ⅱ双酶切后插入相同酶切pET32a（＋）载体，转化JM109感受态细胞，并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达，SDS—PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32／E7，HPV16E7-TRX融合蛋白在BL21（DE3）菌株中高效表达，在1mmol／L IPTG、30℃诱导条件下融合蛋白表达量占菌体总蛋白的30％左右。结论pET32／E7原核表达质粒的构建、HPV16E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础。     

弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区在大肠杆菌中的表达

目的：克隆并表达弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区片段，为下一步表达蛋白纯化奠定基础方法：将弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区片段克隆入高效融合表达载体pET32α，转化大肠杆菌B121(DE3)，37℃、IPTG诱导表达，SDS—PAGE分析表达产物结果：成功构建重组质粒pET32α—SAG1，经诱导后表达出含外源基因的融合蛋白，SDS—PAGE分析表达产物分子质量约44kDa，结论：弓形虫SAG1成熟蛋白编码区在原核表达系统pET32α/BL21(DE3)中获得成功表达，为下一步表达蛋白纯化提供试验依据。     

ULBP3胞外段分子伴侣10融合蛋白的构建与表达

[目的] 研究ULBP3基因的功能,构建、表达ULBP3胞外段分子伴侣10重组融合蛋白。[方法] 将ULBP3胞外段cDNA连接在重组原核表达质粒pET28a-chaperonin 10中chaperonin 10基因的下游,构建chaperonin10-ULBP3融合基因的pET28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Western blot鉴定。[结果] 酶切鉴定证实,chaperonin10-ULBP3融合基因的pET28a原核表达载体构建正确,该原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经筛选获得的阳性重组菌稳定表达chaperonin10-ULBP3重组融合蛋白。[结论] 成功表达了ULBP3胞外段重组融合蛋白,可进一步用于ULBP3功能实验研究。     

FAAP的原核表达、纯化与抗体制备

目的 构建pET28a-FAAP-His原核表达载体,表达His-FAAP融合蛋白,制备FAAP蛋白的多克隆抗体.方法 构建pET28a-FAAP-His原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21中并诱导表达His-FAAP融合蛋白,用纯化的FAAP蛋白免疫昆明小白鼠后,制备多克隆抗体,通过Western blotting检验抗血清的特异性和灵敏性.结果 成功构建pET28a-FAAP-His原核表达栽体.在大肠杆菌BL21中经1mM的异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(isopropy-β -D-thiogalactoside,IPTG)37℃诱导4h后,融合蛋白有很高水平的表达.Western blotting结果显示FAAP抗体能够有效地检测人血管内皮脐静脉细胞内FAAP蛋白的表达.结论 成功地对FAAP进行了原核表达、纯化,抗FAAP小鼠的多克隆抗体具有较好的特异性,为进一步研究FAAP的结构与功能奠定了坚实的基础.     

人ICOS-Linker-Ig真核表达载体构建及二级结构分析

目的构建人重组ICOS-Linker-Ig真核表达载体并预测其二级结构及Linker的合理性。方法扩增人ICOS胞外域及IgG Fe段，设计一段柔性Linker将二者连接。经测序分析得到融合基因序列。应用核酸和蛋白质序列分析软件EditSeq^TM对融合基因及Linker部位翻译后二级结构水平的一些生物学特性，诸如柔性、抗原性、亲水性及表位等加以预测分析。结果ICOS-Linker-Ig融合基因的氨基酸序列经软件分析，并分别与ICOS和IgG单独分析结果比较，发现在二级结构水平未出现新的抗原性，同时Linker部位具有很低的抗原性，亲水性无改变，Linker部位呈中性且柔性良好，不影响两端蛋白质二级结构和融合蛋白空间构象。ICOS和Ig具有各自原来的表位特征，无新表位出现。结论本研究构建的ICOS-Linker-Ig能够保留ICOS和Ig各自生物活性和功能，计算机分析表明翻译后不影响蛋白质空间结构的形成，适合融合蛋白功能的发挥。     

丙型肝炎病毒F蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的:构建丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)F蛋白的原核表达载体,表达pET32a(+)-HCVF融合蛋白.方法:根据丙型肝炎病毒F基因的全序列设计引物,以HCV1a型cDNA质粒H/FL为模板,通过PCR方法扩增得到F基因的编码区序列,将其定向克隆于含有6×His tag的原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌JM109,经菌落PCR筛选,双酶切和测序鉴定阳性克隆后,转化大肠杆菌BL21,采用IVTG诱导表达融合蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测鉴定,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化.结果:F基因以正确的方式插入到pET32a(+)载体中,重组质粒转化大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达,出现了与预期分子量相符的蛋白条带,该蛋白通过Western blot检测具有6×His tag蛋白的免疫学活性.结论:成功构建了丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达载体pET32a(+)-HCVF并表达和纯化出重组融合蛋白,为进一步研究F蛋白的生物学功能奠定了基础.     

小鼠OX40原核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠OX40胞外段基因的原核表达载体并进行诱导表达。方法PCR扩增OX40胞外段基因并将其插入原核表达质粒pET32a（＋），重组pET32a—OX40经测序鉴定后转入表达菌株BL21（DE3）进行融合蛋白的小量诱导表达。结果出现新增蛋白条带，融合蛋白主要存在于包涵体中；Western Blotting分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合。结论构建了小鼠OX40基因的原核表达载体，获得OX40胞外段融合蛋白。     

IL-32原核表达载体的构建及表达

目的 构建人IL-32原核表达载体,并进行初步诱导表达.方法 PCR扩增IL-32基因并将其与原核表达质粒pET32a(+)连接,重组pET32a- IL-32经PCR、酶切及测序鉴定后转入表达菌株BL21(DE3)进行融合蛋白的少量诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting检测目的蛋白表达及水平.结果 含有重组质粒的表达菌株经IPTG诱导后获得高效表达,融合蛋白主要存在于包涵体中,重组蛋白表达水平占总蛋白的27.5%;Western Blotting分析表明该蛋白可与特异性抗体发生结合.结论 构建了人IL-32基因的原核表达载体,获得IL-32融合蛋白.     

M istic融合蛋白促进ω-3脂肪酸去饱和酶 Fat-1在大肠埃希菌中高效表达

目的：构建真核膜蛋白ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1基因在大肠埃希菌中的高效表达质粒。方法利用分子克隆技术构建携带Fat‐1基因的重组原核表达质粒pET32a‐Fat‐1和插入膜蛋白表达分子伴侣Mistic基因的pET32a‐Mistic‐Fat‐1;将两种重组质粒转化大肠埃希菌株BL21（DE3）,IPTG诱导表达Fat‐1蛋白和M110‐Fat‐1蛋白,通过十二烷基‐聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS‐PAGE）灰度分析其表达量,蛋白免疫印迹法（Western blot）进一步鉴定蛋白表达。结果经酶切鉴定和测序证实成功构建了pET32a‐Fat‐1和pET32a‐Mistic‐Fat‐1原核表达载体;SDS‐PAGE和Western blot证实ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1在原核表达系统中没有明显诱导表达,而M 110‐Fat‐1融合蛋白在大肠埃希菌中获得了高效表达,占全细胞蛋白总量的15％。结论ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1基因与Mistic基因融合表达,实现了在原核宿主中高效表达真核膜整合蛋白ω‐3脂肪酸去饱和酶Fat‐1。     

脑源性神经营养因子原核表达载体的构建及其生物学活性分析

目的：构建含有脑源性神经营养因子（BDNF）的原核表达质粒pET28a（＋）／BDNF及相应的原核表达菌,经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后研究其生物学活性。方法按照大肠杆菌BL21（DE3）的密码子偏好性进行密码子优化,人工合成大鼠BDNF的基因序列并构建原核表达质粒pET28a（＋）／BDNF。经限制性内切酶（Bam HI ,Hind Ⅲ）酶切鉴定及DNA测序鉴定后导入大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,用SDS‐PAGE检测重组蛋白的表达情况,以BDNF特异性抗体采用Western blot法鉴定BDNF蛋白抗原性,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测BDNF蛋白对 PC12细胞活力的影响。结果构建的pET28a（＋）／BDNF经双酶切和测序鉴定与设计序列100％一致;工程菌经IPTG诱导后在相对分子质量17×103左右有1条明显蛋白条带,Western blot显示目的蛋白能够与特异性BDNF抗体反应;不同浓度BDNF蛋白处理组与对照组比较细胞活力均有不同程度的增加,其中50 ng／mL BDNF处理组效果最优。结论成功构建原核表达质粒pET28a（＋）／BDNF及相应的原核表达菌,该工程菌表达的BDNF蛋白具有良好的生物学活性。     

人泛素偶联酶UBE2C／UbeH10基因的克隆、原核表达载体的构建及表达

目的获取泛素偶联酶家族成员之一的UBE2C／UbcH10的基因,构建具有His标签的原核表达载体,在大肠杆菌中表达UBE2C／UbcH10蛋白。方法利用RT—PCR的方法从肝癌细胞HepG2中获得UbcH10的基因,克隆到pMD-19T载体中并测序鉴定,酶切回收后插入原核表达载体pET32a（＋）中,构建重组表达载体pET32a—UbcH10,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达。结果重组表达载体pET32a—UbcH10在大肠杆菌BL21中经IFFG诱导4h获得稳定高效的融合表达。重组蛋白以可溶形式存在,大小在29．0kD左右。结论UbcH10重组表达载体的成功构建以及重组蛋白的表达,为进一步其结构和功能的研究奠定了基础,有望揭示该蛋白在癌症发生发展过程中的作用。     

人端粒酶逆转录酶与热休克蛋白70融合表达载体的构建及原核表达

目的:构建热休克蛋白70(HSP70)与人端粒酶逆转录酶融合表达载体,在大肠杆菌进行表达.方法:利用PCR方法扩增hTERT基因片段(532aa～637aa),双酶切后插入原核表达载体pET32a的Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ位点之间,形成pET32a-hTERT质粒.通过PCR方法扩增人HSP70全长cDNA.双酶切后插入pET32a-hTERT的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ位点之间,构建hTERT与HSP70的N端融合基因原核表达质粒pET32a-hTERT-HSP70.含有该质粒的大肠杆菌BL21经异丙醛-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.结果:成功的扩增了HSP70基因与hTERT基因片段;测序结果表明成功的构建了pET32a-hTERT-HSP70原核表达载体.含有该质粒的大肠杆菌BL21经诱导后表达约110 kD的蛋白.结论:HSP70与人端粒酶逆转录酶融合表达质粒构建成功,并成功获得了融合蛋白hTERT-HSP70.     

mFSHR基因N端片段的序列分析、原核表达载体构建及其表达

目的：克隆小鼠卵泡刺激素受体（FSHR）基因N-端部分片段（28—90aa）（mFSHRn）;预测其编码蛋白作为候选避孕疫苗的可行性;构建原核表达重组质粒,并在大肠杆菌中表达。方法：提取小鼠睾丸组织总RNA,利用逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）技术反转录成cDNA,按照GeneBank中小鼠FSHRN．端序列设计引物,扩增基因片段并插入pET32a载体,测序鉴定后做生物信息学分析;质粒转化E．coli BL21（DE3）感受态菌株诱导表达蛋白。结果：扩增片段长度为186bp,测序结果与预期结果完全一致,生物信息学分析其编码蛋白具有良好的抗原性;重组原核表达质粒经鉴定获得正确重组子并诱导表达。结论：mFSHRn蛋白可作为良好的候选避孕疫苗,成功构建了pET32a—mFHSRn原核表达重组质粒,获得可表达mFHSRn的大肠杆菌菌株,为后续的相关研究奠定了基础。     

新型重组免疫抑制蛋白B7-2-L-PE40KDEL的分子构建与生物活性及结构特性

目的：构建重组B7－2－L－PE40KDEL融合蛋白,特异性杀伤CD28高表达的T细胞,选择性阻断T淋巴细胞活化过程中的B7：CD28／CTLA－4共刺激信号系统,由此诱导免疫耐受,特异性防治移植物抗宿主疾病（GVHD）和宿主抗移植物疾病（HCGD）。方法：采用基因融合序列重叠延伸（SOE）策略,构建新型重组pRSETA-B7-2-L-PE40KDEL外毒素融合蛋白的原核表达载体,实现融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,利用亲和层析等方法进行蛋白质纯化。对该融合蛋白的结构特征诸如等电点、柔性等进行模拟分析。采用MTT法对其特异性杀伤高表达CD28受体的T细胞的活性进行测定。结果：构建并高效表达了B7－2－L－PE40KDEL融合蛋白,所获融合蛋白的纯度大于95％。该融合蛋白的结构特征模拟分析的结果显示,其柔性及抗原性、亲水性表位均未显著改变。活性测定显示,该重组融合蛋白能有效特异性地杀伤高表达CD28的人T淋巴瘤细胞系,而对未来表达CD28的人白血病细胞系则无任何杀伤。结论：具有靶向性免疫抑制活性的新型重组B7－2－L-PE40KDEL毒素融合蛋白的构建、表达对特异性防治GVHD和HVGD可能产生积极的影响。     

甲型流感病毒核蛋白的表达与鉴定及其B细胞表位的预测

目的构建甲型流感病毒核蛋白(nucleoprotein,NP)的原核表达载体,诱导NP融合蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定;预测人NP蛋白的B细胞抗原表位。方法以pcDNA3.1(+)/NP为模板,利用PCR方法扩增目的片段NP,再将此片段插入原核表达载体pET-32a(+),并进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定,将鉴定正确的质粒转入表达菌Rosetta-gami(2)中,用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达,用SDS-PAGE和Western Blot检测表达产物。按Chou-Fasman和Gamier-Robson方法预测其编码蛋白的二级结构,采用Karplns-Schulz方法预测蛋白骨架区的柔韧性;用Kyte-Doolittle方法预测其亲水性,Emini方法预测蛋白质表面可能性及Jameson-Wolf方法预测抗原性指数。结果成功构建了流感病毒核蛋白(NP)的原核表达载体,经SDS-PAGE检测NP蛋白得到了表达,Western Blot证明表达的重组蛋白具有免疫活性。在蛋白质第6～11、79～91、241～248和319～326区段附近很可能为B细胞表位优势区域。结论流感病毒核蛋白的表达及B细胞表位的预测为流感病毒的快速诊断试剂的研发工作提供了基础。