T7噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白3的相互作用蛋白

目的 用T7噬菌体筛选系统筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白（NS）3的相互作用蛋白。方法 应用T7噬菌体展示技术，以通过原核表达的方式得到的丙型肝炎病毒NS3为靶分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行筛选，对筛选到的克隆进行DNA序列分析及同源性研究。结果 经鉴定得到2个阳性克隆，并确定能与丙型肝炎病毒NS3相互作用的蛋白质为serine peptidase inhibitor，cladeA，member 1（SERPINA1）和cyclophilin-LC。结论 T7噬菌体筛选系统是筛选相互作用蛋白的一种简单、快速和有效的手段，筛选到的相互作用蛋白为进一步探讨NS3的致病、致癌机制提供了重要依据。     

丙型肝炎病毒P7蛋白体外原核表达状况的研究

目的:扩增丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)P7蛋白基因,克隆到多个原核表达系统,观察P7蛋白在体外表达的情况,获取具有生物学活性的HCV P7重组蛋白.方法:设计扩增全长HCVP7基因片段的特异引物,以H/FL质粒DNA(含HCV 1acDNA全长序列)为模板,通过PCR扩增全长HCVP7基因...     

重组GST-HBx蛋白在表达过程中断裂状况的研究

目的 在对乙型肝炎病毒非结构蛋白HBx研究的过程中,发现体外表达HBx蛋白产物的稳定性存在差异.为了了解其中的原因,拟通过原核表达方式进行分析.方法 以包含全长HBV DNA的质粒pEco63为模板,通过PCR反应,扩增HBV X基因全长序列(1～154氨基酸)和截短序列(48～104氨基酸,48～146氨基酸,98...     

含临床病毒株聚合酶逆转录酶区的乙肝病毒DNA稳定复制细胞系的构建

目的构建含有临床病毒株聚合酶逆转录酶(RT)区的乙肝病毒(HBV)DNA稳定复制细胞系。方法采用巢式PCR从患者血清扩增HBV DNA片段,利用片段置换反应将该片段克隆到HBV DNA复制载体,并在该载体上引入新霉素抗性基因,在确认该重组DNA体外可复制后,将其转染HepG2细胞,G418筛选,采用real-time PCR结合ELISA及Southern blot检测初筛和鉴定HBV DNA稳定复制细胞系。结果从患者血清扩增出的HBV DNA片段nt55～1654被成功置换到HBV复制质粒pLL相应区域,得到质粒p11;新霉素抗性基因表达片段被克隆到p11中HBV DNA下游,获得质粒p11-neo,Southern blot检测证实p11-neo可支持体外复制;p11-neo转染HepG2后,经筛选鉴定,获得了可支持HBV DNA稳定复制的细胞系3-10。结论建立了含有临床病毒株聚合酶RT区的HBV DNA稳定复制细胞系,real-time PCR结合ELISA有助于HBV DNA稳定复制细胞系的快速初筛鉴定。     

低拷贝HBV病毒全长DNA的制备和体外复制水平的鉴定

目的：从乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）低拷贝的血清样本中提取病毒DNA并通过PCR扩增得到全长DNA片段。将全长片段经过环化处理后转染HuH7细胞,体外评价病毒的复制水平。方法：设计含有BspQⅠ酶切位点的HBV全长扩增引物和分段扩增引物,选择HBV低拷贝的临床病人血清样本,经抽提纯化后的病毒DNA作为模板,用巢式PCR结合分段扩增的方法扩增得到HBV全长DNA,PCR产物经BspQⅠ酶切后自连环化,将环化的HBV DNA转染HuH 7细胞,经5 d细胞培养,提取细胞中的病毒复制中间体,通过Southern blot分析病毒复制水平。结果：通过PCR扩增得到5个HBV全长DNA,经过酶切连接全长基因后转染HuH7细胞,Southern blot检测均有复制表达。结论：本实验成功构建能够有复制表达的HBV环化全长,为研究血清中低拷贝HBV病毒的不同病人复制水平与DNA序列关系打下基础。     

乙肝病毒核心相关抗原检测试剂盒的研发及临床检测

目的：研发一种检测乙肝病毒核心相关抗原(hepatitis B core-related antigen,HBcrAg)的定量检测试剂盒并评价其性能。方法：通过研究原材料抗体、优化制备工艺和调整反应体系建立HBcrAg化学发光免疫检测方法,组装成试剂盒后利用重组HBcrAg和临床血清进行检测性能评估,数据处理使用IBM SPSS Statistics 20软件。结果：该试剂盒标准曲线为y=143.37x+344.91,R²=0.999 8;检测灵敏度为1.43 pg/mL;健康人参考区间≤25.595 pg/mL;检测208例慢性乙型肝炎患者血清,所有(18/18)乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)DNA10⁸～10⁴IU/mL血清HBcrAg检出值都在这个临界值以上;92.31%(24/26)HBV DNA10³～10²IU/mL血清HBcrAg检出阳性;44.51%(73/164)HBV DNA低于检出限血清HBcrAg检出阳性。结论：本试剂盒能较好...     

利用基因敲入技术在肝癌细胞系中稳定表达HBV的X抗原

目的利用基因诱捕载体整合到人类肝癌细胞系SMMC7721细胞的染色体基因中,建立稳定表达HBx蛋白的细胞系。方法通过电击转染将基因诱捕载体pU17导入人类肝癌细胞系SMMC7721细胞,经G418筛选,报告基因X-gal染色,PCR,Western印迹等方法检测HBxDNA的存在和蛋白质的表达。结果得到永久性高表达诱捕载体报告基因X-gal的阳性克隆;用Cre-LoxP置换系统,将构建好的HBx全长片段与诱捕载体的报告基因部分交换,HBx全长片段完整地整合在SMMC7721细胞的染色体基因中,并能从该细胞系中检测到HBx抗原。结论本实验提供了一种新的稳定表达蛋白的方法。该细胞系为制备、纯化X抗原和研究X基因调控提供了实验材料。     

丙型肝炎病毒F蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的:构建丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)F蛋白的原核表达载体,表达pET32a(+)-HCVF融合蛋白.方法:根据丙型肝炎病毒F基因的全序列设计引物,以HCV1a型cDNA质粒H/FL为模板,通过PCR方法扩增得到F基因的编码区序列,将其定向克隆于含有6×His tag的原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌JM109,经菌落PCR筛选,双酶切和测序鉴定阳性克隆后,转化大肠杆菌BL21,采用IVTG诱导表达融合蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测鉴定,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化.结果:F基因以正确的方式插入到pET32a(+)载体中,重组质粒转化大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达,出现了与预期分子量相符的蛋白条带,该蛋白通过Western blot检测具有6×His tag蛋白的免疫学活性.结论:成功构建了丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达载体pET32a(+)-HCVF并表达和纯化出重组融合蛋白,为进一步研究F蛋白的生物学功能奠定了基础.     

抗CP4-EPSPS单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

目的制备可用于胶体金快速检测试条的抗CP4-EPSPS(5-enolpyruvlshimimate-3-phosphate synthase)单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法以重组蛋白CP4-EPSPS免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗CP4-EPSPS的mAb,以间接ELISA法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA法鉴定mAb的Ig亚类,检测mAb的效价及相对亲和力,并进行mAb结合表位分析。结果获得2株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞(Ⅲ5A3,Ⅲ13A2)。其抗体亚类均为IgG1;腹水效价分别为1∶106和1∶108;相对亲和力Ⅲ5A3在105以上,Ⅲ13A2在106以上。ELISA相加实验结果显示2株mAb识别相同或相近的抗原表位。结论成功地制备出抗CP4-EPSPS的2株mAb,为建立快速特异检测转基因植物(GMO)的实验方法提供了有力的工具。