针对口腔医学专业的医学微生物学实验教学改革尝试

为了将华西医学基础实验教学中心提出的“以学生为中心、以质量为核心、以能力为导向”的实验教学理念更好融合到医学实践教学环节中,我们针对口腔医学的专业特点对医学微生物学实验课进行了大胆改革。在改革后的课程中设置了名为“认识你所不知道的自己”的全新教学单元,让学生在生动的自我探索过程中,全面了解口腔微生物的特点及其与口腔常见疾病的关系,掌握口腔微生物学研究的常用技术手段、科研思路,也培养了同学们良好的团队合作意识。医学微生物实验课个性化、专业化的巧妙课程设计,大大提高了学生们的学习兴趣,也收获了更加优秀的教学成效。     

流感病毒受体结合表位真核载体的构建及表达

目的构建甲型流感病毒血凝素(HA)信号肽(SP)与HA唾液酸受体结合部位(RB)所含T、B表位的基因片段(RBT、RBB)真核表达质粒,研究其在真核细胞中的表达与免疫特性。方法通过重叠延伸PCR法(overlap-PCR)将HA的SP分别与RB、RBT、RBB通过一段多肽接头Gly4Ser融合为SP-RB、SP-RBT和SP-RBT,将其分别插入pcD-NA3.1(+)载体,构建质粒,鉴定正确后转染MDCK细胞,RT-PCR、免疫荧光、MTT检测该质粒的表达和分泌。结果融合基因真核表达质粒构建成功,在MDCK细胞中成功表达,转染细胞培养上清能刺激淋巴细胞增殖。结论SP-RB、SP-RBT、SP-RBB真核表达载体成功构建,表达产物能刺激淋巴细胞增值,为流感病毒唾液酸受体结合部位的T、B细胞表位免苗研究提供初步依据,也为流感核酸疫苗的研制奠定了基础。     

甲型流感病毒M2蛋白胞外功能区真核表达质粒的构建和表达分析

目的 构建流感病毒M2蛋白胞外功能区（M2e）真核表达质粒，并研究其在真核细胞中的表达。方法 根据Genbank（NCBI ISDN13425）中查得的M2e编码序列，设计并合成两条DNA单链;在两条链两端添加碱基构成酶切位点的粘性末端，退火后使之互补结合成为M2e编码序列；然后将其插入到经双酶切的真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-M2ef经酶切和DNA测序鉴定后，转染HEK293细胞。用免疫荧光技术检测pcD—NA3．1（＋）-M2e在HEK293细胞的表达。并通过MTT检测刺激淋巴细胞增殖及M2e蛋白的分泌情况。结果 合成的寡核苷酸链经退火形成双链，插入酶切的真核表达载体后构建成pcDNA3．1（＋）-M2e。免疫荧光技术证实该质粒表达的M2e蛋白定位于细胞膜上，转染细胞的培养上清经MTT实验证实能刺激淋巴细胞增殖，表明表达的M2e蛋白也可分泌至细胞外。结论成功构建了流感病毒M2e的真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-M2e，表达的M2e蛋白不仅存在于绳胞膜上，也可分泌到细胞外。流感病毒M2e基因真核表达质粒的构建及成功表达为流感病毒基因工程疫苗、通用疫苗和核酸疫苗的研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌重组蛋白PLGA微球和PLGA-壳聚糖复合微球的制备及其释放性能研究

  目的  制备载有幽门螺杆菌重组蛋白（BIB蛋白）的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid, PLGA）微球和PLGA-壳聚糖复合微球,优化微球制备参数,并分析两种微球在体外胃、肠液中的释放性能。  方法  采用双乳化-溶剂挥发法（W1/O/W2）制备BIB-PLGA微球和BIB-PLGA-壳聚糖复合微球;通过单因素分析方法,研究水相/油相（W1/O）比例、PLGA质量分数、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol, PVA）浓度等对微球外观、粒径、分散指数（polydispersity index, PDI）、包封率和载药率的影响,确定最优参数,采用BCA法测定蛋白浓度,计算微球累计释放率。  结果  本研究的最佳参数条件为:W1/O为1∶2,PLGA质量分数5%,PVA质量分数0.2%。BIB-PLGA微球包封率（78.20±1.73）%,载药率（10.58±0.23）%,粒径（2.11±0.08） μm,PDI（0.35±0.18）;BIB-PLGA-壳聚糖复合微球包封率（78.87±1.30）%,载药率（15.50±0.25）%,粒径（2.28±0.52） μm,PDI（0.39±0.54）。BIB-PLGA微球和BIB-PLGA-壳聚糖复合微球在体外胃、肠液中均能缓慢释放,BIB-PLGA-壳聚糖复合微球的缓释效果更明显。  结论  采用双乳化-溶剂挥发法制备的BIB-PLGA微球和BIB-PLGA-壳聚糖复合微球载药率和包封率都较高,粒径可控,外观分散,对胃肠液有缓释作用。     

金黄色葡萄球菌肠毒素与耐药性分析

目的:检测2015年-2021年贵阳市食源性致病菌中的金黄色葡萄球菌肠毒素与耐药性,为有效防控贵阳市金黄色葡萄球菌食物中毒提供基础数据及参考.方法:将2015年-2021年贵阳市收集并分离出的27株金黄色葡萄球菌采用微孔板酶联免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)来检测肠毒素,并使用革兰阳性药敏板对27株金黄色葡萄球菌进行22种抗生素耐药检测.结果:本研究发现27株金黄色葡萄球菌中有17株产生肠毒素,其中13株产肠毒素SEA,3株产肠毒素SEB,1株产肠毒素SED;药物敏感实验发现,24株金黄色葡萄球菌产生了耐药性并且为多重耐药,占总菌株的85.2％,青霉素与氨苄西林的耐药率最高,占85.2％.不产肠毒素的金黄色葡萄球菌株对四环素的耐药率高于产肠毒素的金黄色葡萄球菌(P<0.01),而不产肠毒素的菌株及产肠毒素的菌株对其余抗菌药物的耐药率比较差异无统计学意义(P>0.05).结论:2015年-2021年贵阳市爆发的食源性疾病与食品安全风险监测中所分离出的金黄色葡萄球菌只有部分产生肠毒素,但是金黄色葡萄球菌的耐药率较高,多重耐药现象严重,耐药性与肠毒素的关系需进一步探究.     

诺维氏梭菌对小鼠移植性肝癌的抑制作用

目的 评估无毒诺维氏梭菌对小鼠移植性肝癌的抑瘤效应,及其在肿瘤和重要器官的定植情况,并确定瘤内注射的最佳剂量。方法 建立H22皮下移植瘤BALB/c小鼠模型后称小鼠重量、测肿瘤大小,并按随机原则分为生理盐水组、无毒诺维氏梭菌低剂量组（1.0×107 mL-1,0.5 mL）、中剂量组（1.0×108 mL-1,0.5 mL）和高剂量组（1.0×109 mL-1,0.5 mL）。每天观察小鼠的一般情况,每周3次定时测量小鼠重量,每周2次测肿瘤大小,评估细菌的抑瘤效应。采用革兰染色法、细菌培养法、PCR技术,了解肿瘤和重要器官中诺维氏梭菌的定植情况。利用HE染色、脾脏指数、胸腺指数,了解细菌干预后荷瘤鼠炎症反应、免疫功能及肿瘤转移的情况。结果 无毒诺维氏梭低、中、高剂量组抑瘤率分别为8.49%、44.59%、14.84%,高剂量组小鼠一般情况最差,中剂量组小鼠一般情况最好。肿瘤中有诺维氏梭菌定植,主要脏器无该菌定植。高剂量组和中剂量组荷瘤鼠脾脏质量明显增大,两组脾脏质量和指数与生理盐水组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。高剂量组胸腺显著缩小,但胸腺指数各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 无毒诺维氏梭菌能选择性地定植于肝癌区,中剂量（1.0×108 mL-1,0.5 mL）无毒诺维氏梭菌能有效抑制免疫正常小鼠H22皮下移植瘤,可能与抗肿瘤免疫和炎症反应有关。     

小鼠β防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗菌作用的初步研究

目的构建小鼠β防御素3（mouse βdefensin3,mBD3）基因的原核表达载体pET-32a（＋）／mBD3,诱导mBD3融合蛋白在大肠杆菌中的表达,并融合蛋白的抗菌活性。方法运用PCR技术从质粒pcDNA3．1（＋）／mBD3中扩增mBD3基因片段,将该片段插入pET-32a（＋）原核表达载体,并对构建的重组质粒进行PCR、酶切和测序鉴定。将鉴定正确的质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta-gami（2）,用畀丙基-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE和WesternBlot鉴定融合蛋白。通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白,用微量液体稀释法测定融合蛋白鼠B防御素3（fmBD3）的抗菌活性。结果mBD3的原核表达载体PET-32a（＋）／mBD3构建成功,在大肠杆菌中表达出fmBD3并提取获得纯化的融合蛋白。fmBD3对单细胞真菌具有较好的抑制和杀灭作用,可抑制革兰阳性菌的生长,而对革兰阴性菌元作用。结论构建的原核表达载体在大肠杆菌中成功表达fmBD3,该融合蛋白显示出较强的杀真菌作用和一定的抗细菌作用,为进一步研究鼠防御素的抗微生物活性奠定了实验基础。     

幽门螺杆菌BIB原核表达工程菌的构建及微生物学特性分析

目的构建融合了幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白（Ure I）、尿素酶B亚单位（UreB）的表位基因及霍乱毒素B亚单位（CTB）的原核表达质粒pET28a（＋）／ct B／ure I-B（简称BIB）及其原核表达工程菌,并研究其生物学特性。方法参考基因库中ure l、ure B、ct B的基因序列,合成不舍信号肽的ct B基因及ure I、ure B优势表位基因,串联融合,形成多靶点重组ct B／ure I-B基因（简称BIB基因）,并构建pET28a（＋）／BIB原核表达质粒,经限制性内切酶Nco I、Xho I酶切以及DNA测序鉴定正确后,将重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）中,构建含BIB基因的原核表达工程菌。经乳糖诱导后,SDS-PAOE电泳检测重组蛋白（rBIB）,Western blot及肌注BALB／c小鼠实验检测rBIB的免疫反应性和免疫原型。结果构建的原核表达质粒pET28a（＋）／BIB,经双酶切和测序分析显示,构建的BIB基因与设计序列100％一致。乳糖诱导后,SDS-PAGE电泳显示在33kD左右出现一条明显蛋白条带,Western blot检测在33kD左右出现特异反应条带,肌注免疫BALB／c小鼠产生了较高的抗体水平。结论成功构建了pET28a（＋）／BIB原核表达质粒及BIB原核表达工程菌,该工程菌可表达重组蛋白rBIB,且该重组蛋白具有良好的免疫反应性及免疫原性。     

环境因素对新型冠状病毒传播影响的研究现状

由新型冠状病毒感染所引起的2019冠状病毒病在全球大流行,对各国的公共卫生、社会和经济带来了巨大的挑战.目前已有研究从温湿度、空气污染物和一些社会因素的角度,探究这些因素对新型冠状病毒传播和2019冠状病毒病死亡率的影响.本文总结了影响新型冠状病毒传播的气候因子、空气污染因素和其他可能因素的相关研究成果,介绍了目前的研究进展,为后续2019冠状病毒病流行趋势的预测及防控提供参考.     

流感病毒诱导肿瘤细胞凋亡及其机制的研究

目的：观察流感病毒对肿瘤细胞是否具有凋亡诱导作用,并进一步研究FasL在此过程中的作用．方法：流感病毒以20m．o．i．感染Hela、Raji、SMMC-7721和SPC-A-1等肿瘤细胞,于诱导后不同时间观察细胞超微结构改变,DNA琼脂糖凝胶电泳检测梯状条带,PI染色流式细胞仪检测细胞DNA含量,Annexin-V FITC／PI流式细胞仪进行凋亡定量分析,并用生物素-亲和素ELISA测定流感病毒诱导后细胞培养上清中sFasL浓度的变化。结果：经流感病毒诱导后,四种肿瘤细胞均显示凋亡的形态学改变,细胞DNA电泳出现梯状条带,流式细胞仪测定表明细胞凋亡率增高,且显示一定的时间效应;在上述过程中,细胞培养上清中sFasL浓度有明显增高。结论：流感病毒可诱导上述肿瘤细胞发生凋亡,其发生机制可能与FasL表达增加有关。