新趋化因子DMC对顺铂致HT-29细胞凋亡的影响

目的:研究新DMC基因高表达对人结肠癌HT-29细胞凋亡及抗肿瘤药物敏感性的影响.方法:将DMC蛋白融合表达载体pcDNA3.1(-)/DMC和对照质粒分别转染细胞,顺铂诱导细胞凋亡,荧光显微镜和电子显微镜观察细胞形态,以流式细胞术检测细胞凋亡率变化.结果:pcDNA3.1(-)/DMC转染细胞株凋亡率均明显低于空白细胞株(P<0.05);电子显微镜结果与流式细胞术检测结果一致.结论:pcDNA3.1(-)/DMC转染HT-29细胞后,能够使肿瘤细胞对化疗药物的敏感性降低.     

RN181过表达影响SMMC7721肝癌细胞凋亡的初步研究

目的构建过表达RN181基因的SMMC7721重组细胞株,研究RN181对顺铂诱导肝癌细胞凋亡的影响,并初步探讨其凋亡机制。方法构建高表达RN181逆转录病毒感染SMMC7721细胞,显微镜观察其细胞株荧光强弱,Western blot鉴定RN181蛋白表达水平;采用DAPI染色法、Western blot检测RN181对顺铂诱导SMMC7721细胞株凋亡的变化情况。结果重组细胞株荧光表达良好,7721RN181细胞中RN181蛋白表达量高于其对照,差异有统计学意义(P0.05)。DAPI染色法观察到在顺铂作用下,7721RN181的细胞凋亡阳性率高于其对照,差异有统计学意义(P0.05);Western blot检测到7721RN181的activated caspase-3、cleaved PARP的表达量高于对照组,procaspase-6,pro-caspase-8的表达量低于对照组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 RN181表达能促进肝癌细胞的凋亡,其可能通过参与死亡受体凋亡途径来促进肝癌细胞凋亡。进而推测RN181基因可能成为肝癌靶向治疗的一个新靶点。     

HE4基因表达载体的构建及对卵巢癌细胞HO8910生长侵袭的影响

目的 探讨卵巢癌基因HE4对卵巢癌细胞增殖及侵袭能力的影响.方法 构建针对HE4基因的PcDNA3.1/HFA载体,脂质体法介导PcDNA3.1/HE4载体转染人浆液性卵巢癌细胞系HO8910,WESTERN-BLOT检测转染前后细胞内HE4蛋白的表达效果.用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、平板克隆形成实验观察HE4基因对细胞增殖能力的影响,经细胞粘附实验、体外侵袭力实验比较转染前后细胞侵袭能力的变化.结果 Western-blot结果显示PcDNA3.1/HFA载体成功转染HO8910细胞并显著提高该细胞HE4基因的表达,细胞增殖能力较前无明显变化,侵袭能力明显下降.结论 通过增强HEA基因表达,可降低其侵袭能力,有望成为卵巢癌基因治疗的新的候选基因.     

抗凋亡蛋白Fortilin基因的克隆、表达与鉴定

目的在大肠杆菌中表达一种新近发现的抗凋亡蛋白Fortilin。方法用RT-PCR方法,从肺腺癌细胞中扩增出编码Fortilin蛋白的基因(GenBank中编码该蛋白的基因名为TPT1),克隆入pGEX-4T-1表达载体;重组质粒转入E.coliBL21(DE3),诱导表达Fortilin蛋白,并对表达产物进行免疫印迹鉴定。结果经双酶切及核酸序列分析鉴定,重组质粒pGEX-4T-1/TPT1成功构建,诱导后能高效表达可溶性Fortilin融合蛋白,SDS-PAGE及Western-blot验证该蛋白,表达的融合蛋白分子量为45000,与预期理论值相符。结论Fortilin蛋白在大肠杆菌中以融合蛋白形式进行表达,可提高其在宿主细胞中的稳定性和可溶性,且在大肠杆菌中获得高效表达,获得了充足的活性蛋白,这为进一步了解该蛋白的生物学功能,研究其抗凋亡机制奠定了基础。     

FcεR Ⅰ受体α亚基的重组表达、单克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的 通过基因重组的方法表达IgE高亲和力受体FeεR Ⅰα亚基,并用重组蛋白制备单克隆抗体.方法 用RT-PCR的方法从过敏性疾病病人外周血嗜碱性粒细胞调取FcεR Ⅰα蛋白基因,经T-A克隆、亚克隆至pET28a( )原核表达载体,将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR(DE3),IPTG诱导表达FeεR Ⅰα亚基蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白;并用其免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗FcεR Ⅰα亚基单克隆抗体,用细胞免疫荧光法对单克隆抗体的特异性进行鉴定.结果 成功调取了人IgE高亲和力受体FcεRⅠα亚基的基因,且测序正确;构建原核表达质粒FcεR Ⅰα-pET28a( );成功建立4株稳定分泌抗FcεR Ⅰα亚基的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为G101、C22、G113、G42.通过细胞免疫荧光实验证实,4株单克隆抗体均能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεR Ⅰα亚基.结论 成功利用基因重组技术制备了FcεR Ⅰα亚基蛋白,制备了4株效价高、特异性好的抗FcεR Ⅰα亚基单克隆抗体,为FeεR Ⅰα亚基及其抗体在过敏性疾病中的生物学功能研究奠定了基础.     

人泛素偶联酶UBE2C/UbcH10基因的克隆、原核表达载体的构建及表达

目的 获取泛素偶联酶家族成员之一的UBE2C/UbcH10的基因,构建具有His标签的原核表达载体,在大肠杆菌中表达UBE2C/UbcH10蛋白.方法 利用RT-PCR的方法 从肝癌细胞HepG2中获得UbcH10的基因,克隆到pMD-19T载体中并测序鉴定,酶切回收后插入原核表达载体pET32a(+)中,构建重组表达载体pET32a-UbcH10,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达.结果 重组表达载体pET32a-UbcH10在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导4h获得稳定高效的融合表达.重组蛋白以可溶形式存在,大小在29.0 kD左右.结论 UbcH10重组表达载体的成功构建以及重组蛋白的表达,为进一步其结构和功能的研究奠定了基础,有望揭示该蛋白在癌症发生发展过程中的作用.     

RNA干扰对乳腺癌细胞株MCF-7/Adr多药耐药性的逆转

目的研究小分子干扰RNA对乳腺癌耐药细胞株MCF7/Adr多药耐药性的逆转作用。方法设计针对mdrl基因的SiRNA,转染进MCF-7/Adr细胞;用荧光定量PCR检测mdrlmRNA的表达,流式细胞仪分析Pgp表达,MTT法检测阿霉素对MCF-7/Adr细胞的半数抑制浓度(IC50)。结果该SiRNA能使耐药细胞株MCF-7/Adr的mdrlmRNA和Pgp表达水平分别显著下调(P<0.01),并使阿霉素对MCF7/Adr的IC50显著降低(P<0.01)。结论RNA干扰可逆转乳腺癌MCF7/Adr细胞株的多药耐药性。     

INHBA基因多克隆抗体的制备与鉴定

目的INHBA的表达、纯化及多克隆抗体的制备;对纯化的抗原的初步鉴定。方法利用基因重组技术获得INHBA基因,将其构建到原核表达系统,并分离纯化得到分子量为64 kD的带有组氨酸标签的重组INHBA融合蛋白,用分离纯化后的INHBA融合蛋白作为抗原免疫,获得抗INHBA的多克隆抗体。结果成功地获得INHBA基因,并且以包涵体的形式表达于大肠杆菌中,用间接酶联免疫吸附(ELISA)方法,Western blot检测结果显示,该抗体能特异性地与胎盘组织产生明显免疫亲和反应。结论建立原核高效稳定INHBA表达系统,并对其做了初步的鉴定,为进一步获得高特异性的抗体奠定基础。     

新趋化因子VCC-1小干扰RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建对VCC-1基因有特异性抑制作用的小干扰RNA(siRNA)表达载体.方法 根据VCC-1 mRNA序列,按照siRNA设计原则设计4条特异性的寡核苷酸序列及阴性对照,分别克隆到pGPU6/GFP/Neo载体中.酶切鉴定和测序验证阳性克隆.用脂质体转染SMMC7721细胞,以RT-PCR分析其对VCC-1 mRNA表达的影响.结果 经酶切、测序鉴定均证实重组质粒构建成功.pGPU6/GFP/Neo-siRNA、B、C、D载体均能抑制SMMC7721细胞VCC-1基因mRNA的表达,其中重组质粒C抑制作用最强.结论 成功构建了靶向人VCC-1的小干扰RNA表达载体,为进一步研究VCC-1的功能奠定了基础.     

NNMT真核表达载体的构建并转染SMMC7721肝癌细胞株

目的构建peDNA3．1（-）／NNMT（尼克酰胺-N-甲基化酶）真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC7721中。方法采用PCR法从PGEX4T-1／NNMT重组质粒中克隆得到NNMT cDNA全长序列,并将扩增的eDNA片段与pMD19-T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（-）中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC7721,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用RT—PCR检测转染前后该细胞株NNMT基因的mRNA表达水平。结果真核表达载体构建成功．经RT-PCR检测,重组质粒转染株的NNMT基因mRNA表达水平高于对照组,证实NNMT基因已经稳定转染到SMMC7721细胞中并得到表达。结论成功建立了人基因NNMT的稳定转染细胞株,为进一步研究NNMT的功能奠定了基础。