噬菌体展示技术筛选卵巢癌细胞表面转移相关分子结合肽

目的：利用噬茵体7肽库筛选高转移潜能卵巢癌细胞株HO-8910PM表面转移相关分子结合肽。方法：利用噬茵体展示技术体外快速差减筛选（biopanning and rapid analysis of selective inter-activeligands,BRASIL）卵巢癌细胞株HO-8910和HO-8910PM,经过连续5轮生物淘洗,随机挑选14个噬茵体单克隆进行DNA测序,并进行ELISA、噬茵体竞争结合实验验证阳性噬茵体的亲和性。结果：噬菌体克隆Z3（短肽LRLRNTR）对高转移潜能卵巢癌细胞株HO-8910PM有较高的亲和性。结论：噬茵体展示技术筛选的短肽LRLRNTR可望为卵巢肿瘤早期诊断、转移复发及治疗提供新的方向。     

噬菌体展示技术应用于肿瘤的研究进展

噬菌体肽库展示技术是一种用于筛选功能性多肽的生物技术.编码多肽的外源DNA片段与噬茵体表面蛋白的编码基因重组后,以融合蛋白的形式在噬菌体表面表达出多肽序列,通过与特定的靶标反应.使展示特定蛋白的噬菌体从佑表达有各种外源性蛋白的噬茵体肽库中筛选出来,通过感染大肠杆菌使选择出的噬茵体扩增,然后进行序列测定,获得相应的结构和功能信息,实现了高通量筛选,成为一种有效的分子筛选方法.     

噬菌体展示肽表位的免疫原性研究

目的研究模拟表位TAPDLRP的噬菌体展示肽的免疫原性.方法用我们筛选获得的展示MUC1抗原模拟表位的噬茵体阳性克隆免疫小鼠.以最大OD450值之纯化血清做为一抗行蛋白印迹分析.检测小鼠脾脏淋巴细胞增殖率.结果3次免疫小鼠后,血清(1:1000)中能检测到较强的MUC1抗体阳性.纯化血清可识别MUC1蛋白.噬菌体展示肽表位可在无佐荆存在情况下,大大促进小鼠的脾淋巴细胞的增殖.结论噬茵体是一种较好的生物载体.该模拟抗原免疫小鼠后能激发体液及细胞免疫应答,具有良好的免疫原性.     

CD28噬菌体展示载体的构建及鉴定

目的：构建CD28分子胞外区噬菌体展示载体，并对其展示的CD28抗原性进行检测。方法：采用RT-PCR方法扩增CD28胞外区，将其重组于噬菌粒栽体pComb3HSS，构建的重组载体与辅助噬菌体VCSMl3共转染受体菌，使CD28胞外区展示在噬菌体表面。用ELISA和流式细胞仪检测展示在噬菌体上CD28的抗原性。结果：成功构建了CD28的重组噬菌体展示载体pComb3HSS．CD28。噬菌体展示的CD28可与抗CD28抗体结合，也可与Jurkat T细胞表面的CD28竞争性结合抗CD28的抗体。结论：噬菌体展示的CD28具有抗原性。     

人源性胃癌抗体IgG1Fab噬菌体表面展示文库的构建

目的　利用噬菌体表面展示技术 ,构建人源性胃癌抗体 Ig G1Fab噬菌体表面展示文库 .方法　从胃癌手术患者胃一级站淋巴结中提取总 RNA,反转录成 c DNA后 ,用PCR扩增人 Ig G1Fd段及κ轻链 ,并克隆至噬菌粒载体p COMB3中 ,转化宿主菌株 XL 1- Blue,以辅助噬菌体M13K0 7超感染噬菌粒文库 ,构建成人源性胃癌抗体 Ig G1Fab噬菌体表面展示文库 .结果　得到一个含克隆数为 1.2× 10 6 ,实际滴度约为 2 .5 6× 10 1 5 pfu· L- 1的 Ig G1Fab片段的噬菌体表面展示文库 .结论　Ig G1Fab片段的噬菌体表面展示文库的成功构建 ,为下一步利用亲和富集筛选技术 ,获得具有胃癌表面抗原结合活性的融合抗体及可溶性抗体奠定了基础     

小鼠microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体的构建及鉴定

目的 构建microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体.方法 设计针对microRNA-150前体的过表达基因片段及针对microRNA-150成熟体的反义片段,应用基因重组技术将目的 基因片段克隆到pWPI慢病毒载体中,并进行DNA测序鉴定重组克隆.结果 菌落PCR筛选鉴定出构建正确的慢病毒载体,DNA测序证实插入的基因序列正确.结论 成功构建microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体,为研究microRNA-150在肝再生中的作用及其机制提供了稳定的细胞转染载体.     

噬菌体展示技术构建重组人TNF-α单链抗体库

目的 应用噬菌体展示技术构建抗重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)的单链抗体库.方法 利用噬菌体表面展示技术、绕过杂交瘤技术,提取经免疫BALB/c小鼠淋巴细胞总RNA,用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白VH基因和VL基因,构建VH、VL抗体库.由Linker-primer mix经重叠延伸反应将重链可变区基因与轻链可变区基因拼接成单链抗体.再用RS primer mix以单链抗体为模板进行第二次聚合酶链反应,从而获得全套抗rhTNF-α的单链抗体基因.以SfiⅠ/NotⅠ,位点定向插入pCANTAB-5E噬菌粒载体,转化大肠杆菌TG1后,经M13KO7辅助噬菌体拯救,构建成全套抗rhTNF-α单链抗体表面展示文库.结果 成功构建了rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库.经M13KO7超感染后,噬斑计数滴度为2.1×1011 pfu.结论 rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库的构建,为研究rhTNF-α抗体结合位点,了解其结构与功能的关系以及研究用于临床免疫治疗的新型抗体打下了基础.     

自噬相关基因LC3B真核表达载体构建及胃癌细胞自噬的观察

目的:构建人自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)真核表达载体,并鉴定其生物学功能.方法:通过RT-PCR方法扩增得到人LC3B cDNA,应用基因重组技术构建pEGFP-C1-LC3B真核表达载体,通过酶切和测序进行鉴定.将pEGFP-N1-LC3B表达载体转染胃癌细胞MKN1,倒置荧光显微镜观察饥饿诱导后细胞中EGFP-LC3B的表达及分布变化.结果:通过测序鉴定,pEGFP-N1-LC3B真核表达载体序列正确,编码框正确.转染后的MKN1细胞经饥饿诱导后,检测发现EGFP-LC3B由散在分布向点状分布改变,即生成细胞自噬体.结论:成功构建了人自噬相关基因LC3B真核表达载体,并证实饥饿诱导胃癌细胞自噬的发生,为进一步研究自噬在肿瘤中的作用机制奠定了基础.     

靶向Bi-1基因的重组慢病毒载体构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 慢病毒载体技术已被广泛应用于基因功能分析、信号转导通路和基因治疗的研究.文中应用慢病毒系统构建凋亡抑制基因Bi-1的慢病毒表达载体并检测其在NIH3T3细胞中的表达,为后续的以Bi-1基因为靶点的肿瘤基因治疗研究奠定基础. 方法 根据慢病毒表达载体酶切位点的特征序列设计PCR扩增引物并扩增人Bi-1cDNA,并采用DNA重组技术定向克隆至pLCMV-IG质粒中,构建重组慢病毒载体质粒pLCMV-IG-Bi-1,经PCR、双酶切和测序鉴定后,包装慢病毒感染至小鼠成纤维细胞株NIH3T3中,RT-PCR及Western-blot 分别检测NIH3T3细胞中Bi-1基因和蛋白的表达. 结果 PCR、酶切及测序结果 表明重组慢病毒载体构建成功;NIH3T3细胞感染重组载体包装的慢病毒后出现明显的Bi-1基因高表达. 结论 成功构建靶向Bi-1基因的重组慢病毒载体,为进一步研究Bi-1基因对细胞生长转化的影响提供了实验依据.     

靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的嵌合体抗原受体慢病毒载体构建及病毒包装滴定的实验研究

目的 构建靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (glypican-3,GPC3)的慢病毒载体,并进行慢病毒载体的鉴定、包装及病毒滴度测定.方法 设计靶向GPC3抗原的嵌合性抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)分子重组基因及特异性引物,用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)对CAR分子重组基因进行体外扩增及PCR反应片段搭桥,双酶切后定向插入到pCDH质粒,构建pCDH-anti-GPC3-CAR慢病毒表达载体,经菌落PCR、DNA凝胶电泳及测序鉴定.将目的 质粒与包装质粒共转染293T细胞,收集上清液按不同比例稀释后感染293T细胞,流式细胞术检测anti-GPC3-CAR表达并计算病毒滴度.结果 经菌落PCR及测序证实,正确构建重组慢病毒载体pCDH-anti-GPC3-CAR,包装后的病毒滴度为(1.50～3.24)×106 TU/ml.结论 本研究成功构建携带不同共刺激分子的pCDH-anti-GPC3-CAR慢病毒表达载体,可在293T细胞中表达并产毒,为后续构建CAR免疫细胞提供技术储备.     

miR-610的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的:克隆微小RNA hsa-miR-610并构建其慢病毒表达载体.方法:将PCR扩增得到的miR-610前体序列和pcDNA6.2-GW/EmGFP载体经双酶切后连接产生pcDNA6.2-miR-610真核表达载体,双酶切后测序鉴定,筛选阳性克隆.通过BP反应及LR反应将pre-miR-610克隆至慢病毒目的载体pLenti6/V5-DEST,构建miR-610的慢病毒表达载体pLenti6/V5-miR-610.结果:将构建好的慢病毒表达载体导入大肠杆菌Stb13进行扩增,测序表明所构建的载体与预期的完全一致.结论:成功构建了miR-610的慢病毒表达载体pLenti6/V5-miR-610,为深入研究miR-610的生物学功能奠定了基础.     

HBV-TR重组腺病毒载体的构建

目的: 构建乙肝病毒靶向核糖核酸酶(HBV targeted ribonuclease, TR)基因的重组腺病毒载体. 方法: 将HBV-TR基因及其对照组基因分别克隆入质粒载体pDC316得到pDC316/TR等穿梭质粒,然后将所得的穿梭质粒和辅助质粒pBHGlox(delta)E1, 3Cre以磷酸钙法共转染HEK293细胞得到重组腺病毒Ad/TR及对照组重组病毒,并以空斑形成实验(Plaque Assay)测定病毒滴度. 结果: 成功构建了HBV-TR重组腺病毒载体Ad/TR及其对照组病毒并获得了高滴度的病毒颗粒. 结论: HBV-TR重组腺病毒载体成功构建.     

新型噬菌粒展示载体pCANTAB5L的构建

目的：将柔性多肽接头和多克隆位点引入噬菌粒载体pCANTAB5X中，构建适用于展示各种随机肽库、功能靶蛋白、功能靶蛋白变异体库和大分子量（＞300个氨基酸）功能蛋白的新型噬菌粒展示载体。方法：应用5′端含XbaⅠ、StuⅠ、SalⅠ、KpnⅠ识别序列的引物，PCR扩增获得XbaⅠ－StuⅠ-SalⅠ-KpnⅠ－[G4S]3-NotⅠ衔接片段，将该PCR产物克隆到pMD-18T中，再将该片段插入pCANTAB5X中构建成新型噬菌粒展示载体pCANTAB5L。结果：限制性内切酶酶谱及DNA序列分析证明[G4S]3多肽接头和限制性内酶切位点XbaⅠ、StuⅠ、SalⅠ、KpnⅠ序列被引入到新构建的噬菌粒载体pCANTAB5L中。结论：成功构建了新型噬菌粒展示载体pCANTAB5L，并能有效展示功能靶蛋白、功能靶蛋白变异体库和大分子量功能蛋白。     

HPV6bL1短发夹shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的 用pSilencer2.1质粒载体构建人类乳头瘤病毒6b型L1衣壳蛋白HPV6bL1短发夹shRNA质粒重组体,并进行序列分析,为探索尖锐湿疣基因抗体防治研究治疗的新途径打好基础.方法 用DNA重组技术将针对人HPV6bL1基因的不同部位所设计的3对设计有小发夹结构的2对DNA序列.经退火成互补双链,再克隆至pSilencer2.1-U6 neo质粒载体中构建重组体,转化DH5a菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析.结果 成功构建了HPV6bL1shRNA质粒重组体.结论 HPV6bL1 shRNA质粒重组体的成功构建为研究尖锐湿疣基因靶向抗体打下基础.     

慢病毒携带shRNA对内皮细胞组织因子表达的抑制作用

目的:构建RNA干扰慢病毒栽体,研究慢病毒携带的短发夹干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)对内皮细胞中组织因子(tissue factor,TF)表达的抑制作用.方法:将靶向人TF基因的2条shRNA表达序列克隆到慢病毒栽体pENTRTM/U6的黏性末端,测序鉴定后,与目标栽体pLenti6/BLOCKiTTM-DEST vector进行位点特异性重组,再测序;经脂质体导入293 FT细胞,包装成慢病毒,收集病毒上清并测定病毒滴度.RT-PCR和ELISA检测干扰后内皮细胞TF的表达.结果:将目的序列成功连接到裁体上,并经测序分析证实载体构建成功;在293FT细胞中进行慢病毒包装,收集上清并检测病毒滴度为5×105/TU.RT-PCR和ELISA检测结果证实构建的携带shRNA的慢病毒可显著抑制内皮细胞TF的表达.结论:成功构建了携带人TF基因的RNAi慢病毒载体,慢病毒携带的短发夹干扰RNA能干扰内皮细胞中TF的表达,可为血栓栓塞性疾病的防治提供一种有效的方法.     

角质细胞生长因子噬菌体活性肽的构建及其对表皮细胞增殖的作用

目的 构建展示角质细胞生长因子(KGF)噬菌体活性肽,检测其促表皮细胞增殖的作用.方法 选择4个KGF序列,设计引物;用反转录-PCR法获得3个KGF序列(P1、P2和P4),直接合成1个KGF序列(P3);将KGF序列亚克隆至噬菌粒pComb3中;用噬菌体展示技术,将KGF基因片段展示于噬菌体表面;用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测KGF噬菌体活性肽促表皮细胞增殖的作用,测定其在570 nm的吸光度(A)值,用免疫荧光法检测其细胞亲和力.结果 获得4种KGF基因,构建在噬菌粒pComb3中;通过噬菌体展示技术将其表达于噬菌体的表面.MTT检测的吸光度(A)值结果显示阴性对照组(0.293±0.017)与KGF对照组(0.520±0.043)及4种KGF噬菌体活性肽组(P1 ～ 4) (0.469±0.057、0.441±0.048、0.438±0.035、0.446±0.037)间差异均有统计学意义(均P＜0.01),免疫荧光检测结果显示KGF和4种KGF噬菌体活性肽与表皮细胞具有较好的亲和力.结论 构建展示的KGF噬菌体活性肽能够显著促进表皮细胞增殖.     

一种靶向HER2嵌合抗原受体CAR THP-1细胞系的构建

目的 获得稳定转染靶向人类表皮生长因子2(HER2)的嵌合抗原受体巨噬细胞(CAR-M)。方法 构建靶向HER2的CAR慢病毒载体并感染人单核细胞白血病细胞系(THP-1)。通过分选流式细胞仪分选出含有绿色荧光标记的CAR THP-1细胞并在体外继续培养。将此靶向HER2的CAR THP-1细胞与HER2表达阴性(-)及阳性(+)的子宫内膜癌细胞系Ishikawa分别共培养，通过成像流式细胞仪检测其对HER2表达阳性肿瘤细胞的靶向吞噬，通过流式细胞仪检测其对HER2表达阳性肿瘤细胞的靶向吞噬比例。结果 CAR慢病毒感染THP-1细胞效率较低；与癌细胞共培养后，流式细胞术及成像流式细胞术结果显示，CAR THP-1组与空载体组相比，CAR THP-1细胞对HER2阳性的Ishikawa细胞吞噬能力增强(P<0.01)。结论 通过构建CAR慢病毒载体并转染THP-1细胞，成功建立了靶向HER2的CAR THP-1细胞系，且其能通过特异性靶向吞噬HER2阳性Ishikawa细胞。     

A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库的构建

目的　构建A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库。　方法　利用全套噬菌体抗体表面展示技术 ,从A型流感病毒核蛋白免疫的BALB/c小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA ,利用抗体可变区PCR混合引物进行全套抗体重、轻链基因的扩增。经重叠延伸反应 ,在体外随机装配成单链抗体。将其克隆到噬菌粒载体PCANTAB5E中 ,电转化TG1细菌 ,以辅助噬菌体M13 K0 7超感染噬菌体文库 ,构建全套ScFv抗体库。　结果　成功利用噬菌体表面展示技术 ,构建了A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库 ,库容量达到 8 2× 10 7。　结论　构建全套A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库 ,为利用亲和富集筛选技术 ,获得具有A型流感病毒核蛋白结合活性的完整重组噬菌体克隆奠定了基础。     

VEGF基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建血管内皮生长因子(VEGF)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,为其体内外实验研究提供依据.方法 将靶向VEGF基因的shRNA表达序列连接到慢病毒载体pRNAT-U6.2/Lenti中,获得pRNAT-shVEGF质粒,经PCR和测序鉴定后,与慢病毒包装质粒pPACKHl通过Lipofectamine 2000共转染至包装细胞293T,包装产生病毒液,测定其滴度.结果 PCR扩增和测序结果证实,VEGFshRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为3x107pfu/ml.结论 成功构建人VEGF基因RNAi慢病毒载体,为研究其在白血病细胞中的生物学功能和基因治疗奠定基础.     

靶向血管内皮细胞因子受体3小干扰RNA腺病毒表达载体的构建

目的构建靶向血管内皮细胞因子受体3(VEGFR-3)的小干扰RNA重组腺病毒表达载体。方法将构建的靶向VEGFR-3特异性小干扰RNA真核表达载体pGenesil-siRNA的启动子及siRNA序列克隆入穿梭质粒pAdTrack,将质粒线性化处理后转化入pAdEasy。重组腺病毒载体线性化处理后转染HEK293细胞,包装重组腺病毒,并进行PCR鉴定、病毒滴度测定;扩增后感染结肠癌LoVo细胞并进行Western blotting检测VEGFR-3蛋白的表达。结果双酶切鉴定及测序证实pAdTrack-pG-siRNA及pAd-VEGFR3-siRNA质粒构建正确,扩增纯化测定重组病毒pAd-VEGFR3-siRNA的滴度为5.6×109pfu/mL。病毒感染结肠癌LoVo细胞后测定VEGFR-3蛋白表达明显降低。结论靶向VEGFR-3小干扰RNA的腺病毒载体构建成功。