人CCR5Delta32基因的克隆及其重组慢病毒载体的构建

目的:克隆人CCR5Delta32基因并构建含目的基因的重组慢病毒载体pLenti-CCR5Delta32,用于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的基因治疗研究. 方法:从CCR5Delta32突变个体外周血单个核细胞(PBMCs)内提取人基因组DNA,利用PCR技术扩增CCR5Delta32全长基因,经EcoRI单酶切后与pUCm-T载体连接,随后转化感受态E.coli DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序. 再将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析. 结果:经PCR扩增获得约650 bp的DNA片段,测序结果与GenBank上的序列完全一致,克隆的目的基因已经正确插入到慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO中. 结论:成功克隆了人CCR5Delta32基因并构建了含目的基因的重组慢病毒载体pLenti-CCR5Delta32,为进一步AIDS基因治疗研究奠定基础.     

人CCR5Delta32基因重组慢病毒载体的构建及表达

目的:构建含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒载体并鉴定其表达性能。方法:从CCR5Delta32突变个体外周血单个核细胞(PBMCs)内提取人基因组DNA,利用PCR技术扩增CCR5Delta32全长基因,经EcoRI单酶切后与pUCm-T载体连接,随后转化感受态E.coliDH5α,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序。再将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析。最后用pLP1、pLP2、pLP/VSVG及pLenti-CCR5Delta32四种质粒共转染293T细胞,产生重组慢病毒并通过Western blot鉴定目的基因在靶细胞内的表达。结果:经PCR扩增获得约650bp的DNA片段,测序结果与发表于GenBank上的序列完全一致。经酶切鉴定,克隆的目的基因已经正确插入到慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO中。四种质粒共转染293T细胞,产生出5×105TU/ml高滴度的重组慢病毒。用其感染靶细胞,Western blot结果显示有目的蛋白表达。结论:成功构建了含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒载体并将其在293T细胞内表达,为进一步AIDS基因治疗研究奠定基础。     

微小RNA miR-26a的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的 克隆微小RNA hsa-miR-26a并构建其慢病毒表达载体.方法 将PCR扩增得到的miR-26a前体序列和pIVTHM载体经双酶切后连接产生pIVTHM-miR-26a慢病毒表达载体,双酶切后测序鉴定,筛选阳性克隆.用pIVTHM-miR-26a、psPAχ2和pMD2.G 3质粒共转染包装细胞293FT,包装产生慢病毒.以293FT细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达水平测定病毒滴度.结果 经双酶切鉴定和测序证实,成功构建了miR-26a的慢病毒表达载体pIVTHM-miR-26a.倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293FT呈绿色荧光,并测得病毒滴度为5×105TU/ml.成功构建hsa-miR-26a的慢病毒表达载体.为深入研究miR-26a的生物学功能奠定了基础.     

人miR-106b的克隆及其慢病毒表达载体构建

目的克隆微小RNAhsa—miR-106b并构建其慢病毒表达载体。方法将PCR扩增得到的miR-106b前体序列和pLVTHM载体经双酶切后连接,产生pLVTHM—miR-106b慢病毒表达载体,双酶切后测序鉴定,筛选阳性克隆。用pLVTHM—miR-106b、psPAX2和pMD2．G质粒共转染包装细胞293FT,包装产生慢病毒。结果经双酶切鉴定和测序证实,成功构了miR-106b的慢病毒表达载体pLVTHM—miR-106b。倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293FT呈绿色荧光。结论成功构建了has—miR-106b的慢病毒表达载体,为深入研究miR-106b的生物学功能奠定基础。     

miR-TH克隆及慢病毒载体的构建

目的：克隆microRNA-酪氨酸羟化酶（TH）,构建慢病毒载体。方法：根据TH基因序列（NM_009377.1）,设计并合成4对微小RNA（miRNA）的Oligo DNA,退火形成双链后与pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miRNA载体相连,用Gateway技术将构建好的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-TH载体先后与中间载体pDONRTM221、慢病毒载体pLenti6/V5-DEST连接,构建慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-TH,用脂质体2000（lipofectamine 2000）将慢病毒载体以及包装质粒（pLP1,pLP2和pLP/VSVG）共转染HEK-293FT细胞,收集上清,感染293T细胞株进行滴度鉴定。结果：测序结果表明,4对pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miR-TH表达载体序列与参考序列一致,构建出来的慢病毒载体在293FT细胞中包装成功,并通过293T细胞测得慢病毒滴度为5×106 TU/ml。结论：成功构建了TH的慢病毒干扰载体pLenti6/V5-DEST-TH,为利用RNA干扰技术进一步研究TH基因的功能和作用奠定了基础。     

Hsa-microRNA-138慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的:构建hsa-microRNA-138慢病毒表达载体。方法:PCR扩增pri-miR-138-2前体序列,克隆至plenti-GFP慢病毒表达载体,双酶切及测序鉴定正确后进行慢病毒包装与滴度检测;构建成功后感染人胰腺癌细胞PANC-1,48 h后Real-time Q-PCR检测miR-138的表达。结果:酶切、测序鉴定证明插入序列正确,测定病毒滴度为1×109TU/ml,病毒感染48 h后的PANC-1胰腺癌细胞观察可见绿色荧光,Real-time Q-PCR显示被感染细胞的miR-138表达量较未感染细胞显著增高。结论:建立了高效稳定表达hsa-miR-138的慢病毒转染系统。     

HIF-1α基因miR RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建人HIF-1α的miR RNAi慢病毒载体.方法 利用已经构建成功的针对人HIF-1α基因的miRNA干扰质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-HIF-1α miR,通过BP/LR反应,将EmGFP-HIF-1α-miR表达框整合重组到产毒质粒pLenti6/V5-DEST中测序鉴定,用PLP1、PLP2和PLP/VSVG质粒共转染包装293FT细胞产毒,并利用GFP蛋白表达水平进行滴度测定.结果 经测序鉴定证实成功构建针对人HIF-1α基因的miRNA慢病毒干扰载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-HIF-1α miR.结论 成功构建针对人HIF-1α基因的miRNA慢病毒RNA干扰载体.     

miR-181a真核表达载体的构建及鉴定

目的: 构建miR-181a真核表达载体,获得食管癌细胞TE11在其中稳定表达的细胞系,为研究miR-181a的功能以及其在食管癌细胞TE11中的作用机理奠定基础。方法: 根据miR-181a成熟序列在基因组中的位置及其上下游250个碱基序列,以293T细胞基因组DNA为模板设计PCR引物,扩增包含miR-181a前体的序列,连接到线性化的pMD18-T Simple载体中,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后亚克隆到pcDNA3. 1 ( + )中,并对重组质粒进行双酶切和测序分析;鉴定完全正确的重组质粒转染食管癌细胞TE11,用G418 ( 350 mg/L )筛选4周获得miR-181a稳定表达细胞系TE11-miR-181a,提取TE11-miR-181a细胞总RNA,用real-time PCR鉴定pcDNA3. 1 ( + )-miR-181a可在真核细胞中稳定过表达。结果: 成功构建了miR-181a的真核表达载体,并获得了在TE11细胞中稳定表达重组质粒的细胞系TE11-miR-181a。结论: miR-181a真核表达载体在食管癌细胞TE11中稳定高表达,为进一步研究miR-181a在食管癌细胞TE11中的功能及基因调控机制奠定了基础。     

人FAM172A基因慢病毒载体的构建及其在巨噬细胞中的表达

目的 构建人FAM172A基因慢病毒载体,并包装慢病毒FAM172A感染人巨噬细胞予以鉴定.方法 以PDC315-FAM172A为模板扩增FAM172A基因全长序列后,与慢病毒载体pLenti6.3/V5-GFP经酶切、连接转化大肠杆菌,挑取阳性克隆,行菌液PCR、酶切及测序鉴定.将鉴定正确的FAM172A基因慢病毒载体和病毒包装质粒共转染FT293细胞包装慢病毒FAM172A,测定病毒效价.Western blot和QPCR验证慢病毒FAM172A感染巨噬细胞效果.结果 菌液PCR、酶切及测序结果显示FAM172A基因成功插入到慢病毒载体中.病毒包装后荧光显微镜观察到FT293细胞中有大量绿色荧光,病毒效价为1.2×108TU/ml.Western blot和QPCR结果显示,慢病毒FAM172A侵染靶细胞后可明显增加目的基因FAM172A的表达.结论 成功构建慢病毒FAM172A,为后续FAM172A基因功能研究奠定了基础.     

miR-148a克隆及逆转录病毒载体构建

目的 克隆微小RNA hsa-miR-148a并构建逆转录病毒表达载体.方法 将PCR扩增得到的miR-148a前体序列和pMSCV载体经双酶切连接产生pMSCV-miR-148a逆转录病毒表达载体,双酶切后测序鉴定,筛选阳性克隆.用pMSCV-miR-148a和PIK packaging质粒以磷酸钙共沉淀法转染包装细胞293FT,包装产生逆转录病毒.将病毒感染NIH3T3细胞进行滴度测定.结果 经双酶切鉴定和测序证实,成功构建了miR-148a的逆转录病毒表达载体pMSCV-miR-148a.并测得病毒滴度为5×108CFU/ml.结论 以miR-148a前体序列构建的逆转录病毒表达载体pMSCV-miR-148a能够产生高滴度的逆转录病毒,为深入研究miR-148a的生物学功能奠定了基础.     

大鼠δ阿片受体基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建大鼠δ阿片受体(delta opioid receptor,DOR)基因小发卡RNA(shRNA)及人前脑啡肽原基因(hu-man preproenkephalin gene,hPPE)双表达慢病毒载体并鉴定。方法根据大鼠DOR mRNA序列设计shRNA并合成包含正、反义靶序列的互补DNA链,退火后插入至shRNA表达载体pENTR/U6vector中,构建shRNA表达质粒,并转化至感受态细胞DH5α,抽提质粒后进行测序。合成hPPE基因序列并插入到表达载体pcDNA3.1(+)中,转化至感受态细胞DH5α,挑取多个单克隆进行测序验证。将hPPE插入已构建成功的pENTR/U6-shRNA载体中,再与慢病毒载体pLenti7.3/V5-DEST重组,构建慢病毒载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA并转化DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆并测序验证,保留测序验证正确的LR重组质粒。用构建的慢病毒表达载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA和包装质粒共转染293T细胞,包装病毒,并测定滴度。结果经测序验证重组质粒pENTR/U6-shRNA、pcDNA3.1(+)-hPPE和慢病毒载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA均构建成功。大鼠δ阿片受体基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒包装成功,病毒滴度为1×107 TU/mL。结论大鼠DOR基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒载体构建成功,为研究DOR和hPPE在吗啡耐受中的作用机制及探求更加合理的镇痛方式奠定了基础。     

前列腺癌免疫治疗中质粒pLenti6／V5-D-TOPO-TβRⅡDNglytk构建的意义及相应慢病毒的产生

目的构建含有TβRⅡDNglytk的慢病毒质粒载体,生产出相应的慢病毒,用于对TGF—β失敏感的CTL的制备。方法先以原始质粒为模板,PCR扩增TβRⅡDN和HSV—tk基因,用重组PCR方法获得TβRⅡDNglytk融合基因,用PCR扩增出TRANSglytk基因;再用TOPO克隆技术将其连接到慢病毒表达质粒,经测序验证;最后用Invitrogen公司提供的ViraPowerTMLentiviralSystem和293细胞合成慢病毒,并用293细胞完成其滴度测定。结果完成慢病毒质粒TβRⅡDNglytk的构建,经测序验证序列正确;生产的慢病毒具有感染能力,其滴度达到实验要求,叮用于对TGF—B不敏感的肿瘤特异性CTL的制备。结论运用重组PCR技术合成TβRⅡDNglytk及TRANSglytk两个融合基因,并用TOPO克隆技术连接到pLenti6／V5-D-TOPO载体,成功构建了慢病毒表达载体,说明此方法用于病毒载体的构建是快捷可行的;用ViraPowerTMLentiviralSystem和293FT细胞成功制备了慢病毒,为生产TGF—B不敏感的人肿瘤特异性CTL提供了基础。     

PRL-3基因RNA干扰慢病毒载体的构建及在SW480细胞中的表达

目的 构建PRL-3基因慢病毒干扰载体及建立PRL-3基因稳定干扰的结直肠癌细胞亚系.为PRb-3基因功能研究奠定基础.方法 设计PRL-3基因特异性RNAi靶序列,与pENTRTM/U6线性载体定向连接,构建pENTRTM/U6真核入门表达载体.通过与pENTRTM/U6 entry clone与pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST载体进行重组,获得pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体.利用包装细胞293FT获得重组的慢病毒,感染大肠癌细胞株SW480细胞,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰PRL-3基因的细胞亚系.结果 成功构建PRL-3 pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为6×105U/L.RT-PCR、Western blotting结果 表明,克隆1 PRL-3mRNA及蛋白显著降低.结论 成功构建人PRL-3基因特异性的慢病毒干扰载体,获得PRL-3基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系.     

miR-29c过表达载体的构建及其对95D肺癌细胞增殖的影响

目的构建miR-29c真核表达载体并转染95D肺癌细胞,观察miR-29c过表达对95D细胞增殖能力的影响。方法克隆miR-29c片段插入质粒pcDNA3．1,构建miR-29c表达质粒pcDNA3．1-miR-29c;通过脂质体瞬时转染人肺癌细胞株95D,荧光PCR检测细胞miR-29c表达水平,MTT法检测过表达miR-29c对细胞增殖能力的影响。结果重组质粒pcDNA3．1-miR-29c经酶切及测序证明构建成功,荧光PCR证实转染后95D细胞miR-29c表达水平显著升高,是对照组的36倍。MTT检测结果表明,过表达miR-29c的95D细胞增殖受到显著抑制,至72h抑制率最高,达38．63％。结论成功构建miR-29c真核表达质粒pcDNA3．1-miR-29c,初步观察显示过表达miR-29c显著抑制95D肺癌细胞增殖效应。为进-步深入研究miR-29c对肺癌的作用打下良好基础。     

携带hTERT基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在HeLa细胞中的表达.方法 采用Gateway技术使克隆载体pENTR221-hTERT与慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST进行重组反应,构建重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT;将重组慢病毒载体与病毒包装质粒混合物pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染人胚肾293FT细胞,制备重组慢病毒颗粒;将重组慢病毒感染HeLa细胞,利用杀稻瘟菌素筛选阳性细胞克隆,PCR法检测外源hTERT基因在阳性细胞中的染色体整合状况,RT-PCR检测重组慢病毒感染对细胞hTERT基因mRNA表达的影响.结果 经鉴定,重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT携带hTERT基因,hTERT基因包装至病毒颗粒.重组慢病毒感染HeLa细胞后,得到具有杀稻瘟菌素抗性的细胞克隆,其染色体DNA整合有外源hTERT基因,细胞内hTERT基因mRNA的表达水平高于未感染慢病毒的对照细胞.结论 成功构建了携带hTERT基因的重组慢病毒载体,能够提高HeLa细胞hTERT基因mRNA的表达量.     

前列腺癌免疫治疗中质粒pLenti6/V5-D-TOPO(R)-TβRⅡDNglytk构建的意义及相应慢病毒的产生

目的 构建含有TβRⅡDNglytk的慢病毒质粒载体,生产出相应的慢病毒,用于对TGF-β失敏感的CTL的制备.方法 先以原始质粒为模板,PCR扩增TβRⅡDN和HSV-tk基因,用重组PCR方法获得TβRⅡDNglytk融合基因,用PCR扩增出TRANSglytk基因;再用TOPO克隆技术将其连接到慢病毒表达质粒,经测序验证;最后用Invitrogen公司提供的ViraPowerTM Lentiviral System和293FT细胞合成慢病毒,并用293细胞完成其滴度测定.结果 完成慢病毒质粒TβRⅡDNglytk的构建,经测序验证序列正确;生产的慢病毒具有感染能力,其滴度达到实验要求,可用于对TGF-β不敏感的肿瘤特异性CTL的制备.结论 运用重组PCR技术合成TβRⅡDNglytk及TRANSglytk两个融合基因,并用TOPO克隆技术连接到pLenti6/V5-D-TOPO(R)载体,成功构建了慢病毒表达载体,说明此方法用于病毒载体的构建是快捷可行的;用ViraPowerTM Lentiviral System和293FT细胞成功制备了慢病毒,为生产TGF-β不敏感的人肿瘤特异性CTL提供了基础.     

pLenti6/V5-DEST-TAZ载体的构建及其对成骨前体细胞MC3T3-E1分化的影响

目的：构建人真核表达的TAZ慢病毒载体pLenti6/V5-DEST-TAZ,转染293FT 细胞获得重组慢病毒颗粒,探讨TAZ对成骨前体细胞MC3T3-E1 分化的调控作用。方法：将已经过测序验证的含有TAZ基因慢病毒入门质粒pENTR(tm)221-TAZ通过LR反应克隆到慢病毒载体pLenti6/V5-DEST中。对重组质粒进行酶切鉴定,并在细胞中验证表达。将该重组载体和其他PackingMix 3 个质粒载体充分混合,用阳离子脂质体转染293FT 细胞,培养和待细胞完全裂解后收集富含TAZ基因的病毒颗粒上清液,取适量上清液感染MC3T3-E1细胞,采用杀稻瘟菌素Blastcidin 筛选,建立稳定过量表达 TAZ 蛋白的 MC3T3-E1/TAZ细胞系。用条件培养基诱导 MC3T3-E1和 MC3T3-E1/TAZ细胞系向成骨细胞定向分化,von Kossa 和茜素红染色观察MC3T3-E1和MC3T3-E1/TAZ细胞的成骨分化。结果：凝胶电泳和测序结果均证明TAZ重组慢病毒载体pLenti6/V5-DEST-TAZ构建正确,并能在细胞中正确表达。与辅助质粒共转包装细胞获得慢病毒颗粒,并成功感染MC3T3-E1细胞。Von Kossa 染色和茜素红染色, MC3T3-E1/TAZ细胞系中生成的磷酸钙比MC3T3-E1细胞系中生成的磷酸钙多。结论：成功构建了人真核表达的质粒载体pLenti6/V5-DEST-TAZ,并能在细胞中正确表达;成功包装了TAZ病毒,并获得过表达TAZ的MC3T3-E1细胞;过表达TAZ促进MC3T3-E1向成骨细胞分化。     

人CDH22基因RNAi慢病毒载体的构建及稳定干扰CDH22基因的表达

目的 构建人CDH22基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默大肠癌细胞的CDH22基因表达,为研究CDH22在大肠癌转移中参与的信号转导机制提供研究基础.方法 利用在线软件设计人CDH22基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核酸后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端,测序.得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组,获得真核表达慢病毒干扰载体.在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助质粒和CDH22基因重组慢病毒载体导入293FT细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染大肠癌细胞SW480,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰CDH22基因的细胞亚系.结果 成功构建CDH22真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒滴度为8×105U/ml.荧光定量PCR结果表明,所获得的细胞克隆11中CDH22 mRNA水平的表达显著降低.结论 成功构建出CDH22基因慢病毒RNAi表达载体,并获得CDH22基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系,为研究CDH22在大肠癌转移中的作用机制提供了研究基础.     

人中性粒细胞多肽1,3真核表达载体的构建与鉴定

目的：扩增人中性粒细胞多肽1，3(HNP1，3)基因片段，构建真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1，3。方法：从健康人中性粒细胞中提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出HNP1，3基因完整的cDNA片段，应用TA克隆插入pMD18-T载体，经酶切鉴定及序列分析确证后，将其亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中。结果：从人中性粒细胞中克隆出人HNPl1，3基因，经测序分析与GenBank公布的人HNP1，3核苷酸序列同源性为100％，成功地构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1，3。结论：真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1，3的成功构建，为后续重组基因的真核／表达及其对HIV-1抑制作用的研究奠定了实验基础。