LRIG3基因特异性siRNA腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定针对LRIG3 基因的小干扰RNA(LRIG3-siRNA)腺病毒表达载体,为膀胱癌基因治疗的研究提供有效的实验工具.方法 设计可形成小发夹结构的LRIG3-siRNA模板cDNA 序列,克隆至缺陷型腺病毒质粒pSilencer-U6neo,构建LRIG3-siRNA表达质粒pSilencer-LRIG3.鉴定正确后,将pSilencer-LRIG3转染至HEK293细胞,包装成复制缺陷型腺病毒pAd-LRIG3.大量扩增pAd-LRIG3,氯化铯梯度离心纯化,测病毒滴度.pAd-LRIG3 感染人膀胱癌细胞T24,RT-PCR法检测LRIG3 mRNA的表达.结果酶切分析、测序鉴定表明pSilencer-LRIG3构建成功,PCR分析表明pAd-LRIG3含有LRIG3-siRNA 序列.pAd-LRIG3可抑制 LRIG3 mRNA的表达.结论 含有LRIG3-siRNA 的重组腺病毒构建成功,且具有抑制LRIG3基因mRNA 表达的功能.     

慢病毒Lenti-CXCR4-siRNA载体的构建

目的构建介导CXCR4 RNA干扰的Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒载体。方法将人工合成的CXCR4 siRNA经PCR扩增聚合后与线化的载体GV115连接,XhoI酶切及测序鉴定该表达质粒pLenti-CXCR4-siRNA,按Lenti-X Bicis-tronic Expression System操作手册构建Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒,纯化后测定其滴度。结果凝胶电泳显示PCR扩增聚合产物大小正确(约60 bp)。表达质粒pLenti-CXCR4-siRNA可被XhoI内切酶线化。碱基测序证实碱基序列与设计序列一致。重组Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒的包装细胞293T可见绿色荧光,纯化后测定其滴度,病毒滴度为2×109TU/ml。结论成功构建了高滴度的重组Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒。     

CXCR4-siRNA重组腺病毒载体沉默人卵巢癌细胞株CXCR4基因表达的研究

目的:研究CXCR4-siRNA重组腺病毒载体对人卵巢癌细胞株SKOV3的CXCR4基因表达的影响.方法:Pac Ⅰ酶切CXCR4-siRNA重组腺病毒载体使其线性化,应用HEK293细胞大量包装扩增病毒,收集病毒液,转染人卵巢癌细胞株SKOV3.细胞分为3组:siRNA组,转染空病毒载体的阴性对照组,细胞不做任何处理的空白对照组.通过PCR、Western blot、免疫组化检测CXCR4基因沉默效果.结果:包装扩增后病毒滴度为6×108 PFU/ml,荧光显微镜下可观察到SKOV3细胞中绿色荧光蛋白的大量表达,重组腺病毒能够有效抑制SKOV3细胞中CXCR4的表达.结论:CXCR4-siRNA重组腺病毒载体可高效转染靶细胞和沉默CXCR4基因的表达,为RNA干扰技术应用于卵巢癌的临床基因治疗奠定基础.     

Skp2-siRNA重组腺病毒载体构建及鉴定

目的:构建针对Skp2的siRNA腺病毒载体。方法:合成针对Skp2的siRNA靶DNA序列及相应阴性对照序列,退火成DNA双链,然后亚克隆穿梭质粒pShuttle-H1,Pme I线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,转染AD293细胞,包装得到pAd-Skp2-siRNA和pAd-Skp2-siRNA-NC重组腺病毒。用病毒体外感染结肠癌SW480细胞,Western blot检测Skp2蛋白表达水平。结果:重组腺病毒载体经酶切、鉴定正确,制备的病毒感染效率高,能显著抑制Skp2蛋白表达。结论:细菌内同源重组成功构建了Ad-Skp2-siRNA重组腺病毒及阴性对照病毒。     

靶向血管内皮生长因子受体3基因的小干扰RNA表达载体构建及其生物学效应

目的构建靶向血管内皮生长因子受体3（VEGFR-3）基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体（psiRNA-VEGFR-3）,并观察其抑制人结肠癌细胞株LoVo细胞中VEGFR-3基因表达的效果及生物学效应。方法设计并合成1对VEGFR-3编码基因的反向重复序列,定向克隆至载体pSUPER,构建siRNA真核表达载体,利用脂质体2000将构建的psiRNA-VEGFR-3载体转入LoVo细胞中,应用半定量RT-PCR检测基因转染前后VEGFR-3mRNA表达水平的变化,四甲基偶氮唑蓝法观察细胞生长变化、凋亡率及细胞周期的变化。结果成功构建针对VEGFR-3基因的siRNA表达载体。psiRNA-VEGFR-3可显著抑制LoVo细胞中VEGFR-3基因的表达（P〈0．01）;转染psiRNA-VEGFR-3后能够诱导LoVo细胞发生明显凋亡。结论psiRNA-VEGFR-3载体能够在LoVo细胞中引发RNA干扰效应,通过下调VEGFR-3基因表达可以抑制细胞增殖,诱导LoVo细胞发生明显凋亡。     

l-Caldesmon腺病毒的构建及其在ECV304细胞中的表达

目的 构建含有l-Caldesmon基因的重组腺病毒表达载体.方法 以含有l-Caldesmon全长编码序列的pCGN-CaD为模板,PCR扩增l-Caldesmon, T-A克隆,酶切亚克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV上,在BJ5183菌内和pAdeasy同源重组,筛选阳性克隆,酶切鉴定,线性化后脂质体法转染HEK293细胞进行包装、扩增,得到含有l-Caldesmon基因的重组腺病毒,根据报告基因GFP测定病毒滴度.将收集的病毒液感染ECV304细胞,Western blot检测l-Caldesmon蛋白的表达.结果 成功构建了含有l-Caldesmon基因的重组腺病毒载体,病毒滴度可达1×10 9U /ml.重组病毒感染后可使ECV304细胞l-Caldesmon表达较对照组增加5倍.结论 该重组腺病毒载体的构建为研究l-Caldesmon蛋白在内皮细胞中的生物学功能提供了一定的工作基础.     

编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体构建及鉴定

目的:构建编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体.为进一步研究其蛋白功能提供工具.方法:穿梭质粒pAdTrack-CMV-PGC1α线性化后与骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183菌中完成同源重组,筛选并提取重组正确的腺病毒质粒,PacI线性化,脂质体转染293细胞包装出成熟的具有感染活力的腺病毒颗粒,TCID50法测定病毒滴度,Western bloting检测PGC1α蛋白在293细胞的表达.结果:测序及酶切鉴定表明目的基因正确插人穿梭质粒,读码框未发生移位.重组腺病毒扩增后滴度约3×1010TCID50/ml,能在293细胞中表达PGC1α蛋白.结论:利用细菌内同源重组的方法成功构建了编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体,并观察到其蛋白表达.     

细菌内同源重组法快速制备重组腺病毒

目的：探讨细菌内同源重组两步转化法快速构建重组腺病毒质粒和制备重组腺病毒的方法。方法：将腺病毒骨架质粒pAdEasyl转化BJ5183高效感受态,制备pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态,将线性化的腺病毒穿梭质粒pAdtrack—CMV转化至含pAdEasy—1的BJ5183感受态,筛选获得重组腺病毒载体pAdEazy—CMV。获得的重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞,包装、扩增出重组腺病毒RAdCMV,氯化铯梯度离心法进行纯化,采用电镜负染鉴定重组腺病毒,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白GFP的表达并检测重组腺病毒的滴度。继而用纯化的蘑组腺病毒感染HeLa细胞,测定转染效率。结果：成功构建了重组腺病毒载体pAdEazyCMV,透射电镜和绿色荧光鉴定证实病毒包装成功,并且具有感染力,病毒的滴度呵达2．0×10^10pfu／ml。结论：细菌内同源重组两步转化法可以快速构建重组腺病毒质粒,为后续构建携带不同目的基因的重组腺病毒奠定基础。     

大鼠shRNA-TRPC4重组腺病毒载体的构建及其在EPCs中转染效率的测定

目的 构建大鼠shRNA-TRPC4重组腺病毒载体并观察其在大鼠内皮祖细胞(EPCs)中的转染效率.方法 针对大鼠TRPC4序列设计4个RNA干扰靶点序列并合成双链DNA oligo,连接入干扰载体后转入大肠杆菌感受态细胞,培养后挑取转化子进行PCR鉴定及测序比对.利用Admax包装系统获得重组腺病毒Ad-shRNA-TRPC4小量扩增并测定病毒滴度,检测重组腺病毒对TRPC4表达的影响,最后将获得的重组腺病毒转染EPCs,在荧光显微镜下观察并用流式细胞仪测定其转染效率.结果 4组干扰质粒经培养后的转化子中均有阳性克隆,且阳性克隆与设计的干扰靶点序列一致;4组目的质粒均可抑制TRPC4蛋白的表达,合成的Ad-shRNA-TRPC4病毒滴度为5×1010 ifu/mL;倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测重组腺病毒在大鼠EPCs的转染效率分别为(85.47±2.05)％和(67.27±2.94)％.结论 本实验成功构建Ad-shRNA-TRPC4载体,其在EPCs的转染效率高.     

人EGFP—TERT—VEGF-Bcl—xlshRNA重组腺病毒的构建与鉴定

目的构建表达绿色荧光蛋白（EGFP）和人端粒酶逆转录酶（TERT）、血管内皮生长因子（VEGF）、Bcl-xl基因shRNA的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定,观察其对喉癌细胞（Hep-2）的感染效果。方法用基因工程技术将EGFP和TERT、VEGF、Bcl—xl基因短发夹RNA（shRNA）的cDNA从质粒载体pGenesil-1．1上亚克隆至穿梭质粒pENTR-EGFP-VTB上,再通过体外同源重组的方法将EGFP-VEGF-TERT-Bcl-xlshRNA表达框转移至pGSadeno腺病毒表达载体上,得到腺病毒载体pGsadeno-EGFP_VTB,将PacI线性化的腺病毒DNA转染HEK293,并在其中包装扩增腺病毒。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中所携带EGFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对Hep-2细胞感染效率的检测。结果酶切鉴定及PCR结果证明EGFP-TERT—VEGF-Bcl—xlshRNA重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1．0×10^9PFU／ml,对Hep-2细胞有较强感染能力。结论应用体外同源重组方法成功构建了表达EGFP和TERT-VEGF-Bcl—xl基因shRNA的重组腺病毒载体。     

人DeltaNp73α基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的 利用Adeasy腺病毒载体系统构建含人DeltaNp73α cDNA的重组腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒.方法 从pcDNA3-DeltaNp73α-HA中酶切出DeltaNp73α基因,并插入pAdTrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒;pAdTrack-CMV-DeltaNp73α线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的E.coli.BJ5183菌株内同源重组.筛选正确的重组质粒,PacⅠ线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒;并在293T细胞中反复扩增;增强离心法转染树突状细胞,Western blot检测目的蛋白的表达.结果 经限制性内切酶酶切鉴定、PCR筛选、基因测序和GFP表达证实成功构建了携带DeltaNp73α cDNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒;Western blot检测出预期相对分子质量为67×103的特异条带.结论 成功构建了携带DeltaNp73α cDNA的重组病毒.     

Tie2基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定Tie2基因的RNA干扰慢病毒表达载体。方法先构建pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,通过XbaⅠ酶切电泳及测序鉴定,再以pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,pVSVG包膜质粒和pHelper包装质粒三质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,收集病毒上清液并测定病毒滴度。结果成功构建pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒2条,通过XbaⅠ酶切及测序鉴定,Tie2-siRNA核苷酸序列插入正确,利用三质粒慢病毒包装系统生产EGFP-Tie2-siRNA病毒,收集病毒上清,并测得病毒滴度为9×103/μL。结论成功构建了Tie2基因的RNA干扰慢病毒表达载体。     

GM-CSF基因腺病毒表达载体的构建及其在树突状细胞的表达

目的构建人GM-CSF基因的重组腺病毒载体,探讨其在树突状细胞(DC)中的表达。方法设计一对GM-CSF基因上下游引物,以质粒pBlu-hGM-CSF为模板,经PCR扩增获得GM-CSF基因全部序列。片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒,获得重组质粒pshuttle-CMV-GM-CSF。经双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,将2种重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化,用脂质体转染293细胞。制备病毒上清并测定其滴度,并感染人树突状细胞。结果完成构建含有人GM-CSF基因的重组腺病毒,病毒滴度Ad-GM-CSF 5.2×109pfu/mL。RT-PCR及ELISA检测证实GM-CSF在DC中表达。结论构建重组腺病毒载体,并在DC表达GM-CSF抗原蛋白。     

SHP-1基因重组腺病毒的构建与表达

目的 构建并鉴定人蛋白酪氨酸磷酸酶基因(SHP-1)重组腺病毒Ad-SHP1.方法 将人SHP-1 cDNA克隆于穿梭质粒pAdTrack-CMV,PmeⅠ线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得带有SHP-1基因的重组腺病毒质粒pAd-SHP1,经PacⅠ线性化后通过Lipofectamine2000转染HEK293包装细胞,观察细胞内绿色荧光蛋白表达情况.收获重组腺病毒,经PCR和Western Blotting鉴定后,扩增并纯化重组腺病毒,测定病毒滴度.结果 经测序、酶切电泳和感染后蛋白表达检测均表明成功构建重组腺病毒Ad-SHP1;病毒滴度为1.58×1010 pfu/mL.结论 成功构建带有人SHP-1 cDNA的重组腺病毒,为进一步研究结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤发生机制及肿瘤的基因治疗奠定了基础.     

PTEN重组腺病毒载体的构建及其在气道平滑肌细胞的表达

目的 应用pAdxsi载体系统构建携带PTEN基因的腺病毒载体.方法 将PTEN cDNA自载体pcDNA3-PTEN中切出,克隆至穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV中,然后与腺病毒质粒pAdxsi在化学感受态细胞DH5α菌株内同源重组,经Pac-Ⅰ线性化后,重组子通过脂质体2000介导转染HEK293细胞,产生有感染能力的腺病毒,并测定其滴度,通过荧光显微镜能观察HEK293细胞内绿色荧光的表达;PCR检测腺病毒载体PTEN mRNA的表达,Western blotting检测PTEN蛋白在气道平滑肌细胞的表达.结果 感染腺病毒载体的HEK293细胞表达GFP随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应,经过3轮扩增后病毒达到合适的滴度,构建的Ad-PTEN腺病毒滴度为2×1010pfu/ml,PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳证实其表达,Western blotting检测纠腺病毒感染的气道平滑肌细胞内PTEN蛋白表达明显增高.结论 成功构建了携带野生型PTEN腺病毒载体,为进一步研究PTEN基因应用于哮喘治疗提供了实验基础.     

人FRNK重组腺病毒的构建

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建人FRNK基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。方法:把人FRNK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建腺病毒质粒pAdTrack-CMV-hFRNK,经PmeⅠ内切酶酶切成线性化后,采用电穿孔转化将其转化到含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中,通过卡那霉素筛选获得阳性腺病毒重组质粒。再将获得的腺病毒重组质粒转染到HEK293细胞进行包装,获得人FRNK重组腺病毒pAdhFRNK。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果:经酶切和绿色荧光蛋白表达证明了hFRNK基因的重组腺病毒载体pAdhFRNK构建成功,并制备出高滴度的重组病毒。结论:成功构建携带人FRNK基因的重组腺病毒pAdhFRNK,为研究FRNK的基因治疗奠定了基础。     

小鼠NR4A1基因小分子干扰RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建表达小鼠NR4A1基因的小分子干扰RNA(siRNA)重组腺病毒载体. 方法:根据siRNA靶序列设计并合成2条互补的64 bp寡核苷酸.pShuttle-H1穿梭质粒经BglⅡ、HindⅢ双酶切后,与退火的寡核苷酸进行连接,构建穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA.PmeⅠ酶切pShuttle-H1-siRNA, 然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组.PacⅠ酶切线性化重组质粒pAdEasy-H1-siRNA后转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增.Western blot检测NR4A1基因的表达. 结果:穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA经双酶切和测序证实构建成功,进一步构建了表达小鼠NR4A1基因的siRNA重组腺病毒载体,重组腺病毒AdH1-siRNA/NR4A1感染小鼠睾丸间质细胞瘤细胞(MLTC-1)后显著抑制目的蛋白表达(抑制率为70%～90%). 结论:成功构建了表达小鼠NR4A1基因的siRNA重组腺病毒载体AdH1-siRNA/NR4A1,并在MLTC-1中验证其抑制NR4A1蛋白表达,为进一步研究NR4A1基因在多囊卵巢综合征(PCOS)中的作用奠定了基础.     

人DeltaNp73α基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的利用Adeasy腺病毒载体系统构建含人DehaNp73α cDNA的重组腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒。方法从pcDNA3-DeltaNp73α—HA中酶切出DehaNp73α基因，并插入pAdTrack—CMV中构建成腺病毒穿梭质粒；pAdTrack-CMV—DehaNp73α线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的E.coli．BJ5183菌株内同源重组。筛选正确的重组质粒，PacⅠ线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒；并在293T细胞中反复扩增；增强离心法转染树突状细胞，Western blot检测目的蛋白的表达。结果经限制性内切酶酶切鉴定、PCR筛选、基因测序和GFP表达证实成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒；Western blot检测出预期相对分子质量为67×10^3的特异条带。结论成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组病毒。     

密码子优化的HIV-1型gp120基因重组腺病毒载体疫苗的构建与鉴定

目的 构建密码子优化型gp120基因重组腺病毒载体（rAden-mgp120）,为研发新型HIV预防性疫苗奠定基础.方法 首先利用PCR的方法扩增mgp120基因,将目的基因克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得重组穿梭载体克隆pENTR/D-TOPO-mgp120.经过穿梭载体克隆与表达载体（pAd-CMV/VS-DEST）间的重组反应获得表达克隆质粒pAden-mgp120,表达克隆线性化后转染HEK293A包装细胞,得到复制缺陷型重组腺病毒rAden-mgp120.结果 经PCR和测序鉴定,重组载体rAden-mgp120构建正确,转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为6.8x1011pfu/ml,该重组腺病毒载体能正确表达mgp120蛋白.结论 成功构建了重组腺病毒rAden-mgp120为HIV-1预防奠定了基础.     

HBx-shRNA重组腺病毒的构建及功能鉴定

目的：构建携带绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）标签的乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X pro－tein,HBx）特异性shRNA重组腺病毒,并对其干扰效果进行鉴定。方法：将前期构建的真核表达载体pGenesil-1-HBx-shRNA和pGenesil-1-Scramble sequence的表达启动子U6连同shRNA 亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,构建pAdTrack-CMV-U6-HBx-shRNA和对照pAdTrack-CMV-U6-Scramble sequence穿梭质粒;酶切及DNA测序鉴定后,经PmeⅠ线性化后转化入感受态AdEasier细菌,获得重组腺病毒质粒pAd-U6-HBx-shRNA和pAd-U6-Scramble sequence,PacⅠ酶切后转染AD293细胞获得重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA和Ad-U6-Scramble sequence;扩增病毒,测定滴度;以RT-PCR和real-time PCR鉴定重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA对HBx的干扰效果。结果：酶切鉴定得到阳性pAd-U6-HBx-shRNA和pAd-U6-Scramble sequence重组质粒;转染到AD293细胞并包装成功;RT-PCR以及real-time PCR表明,重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA携带的干扰片段能够明显干扰HBx表达（P=0.01）。结论：成功构建了HBx特异性shRNA重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA,它能抑制HepG2.2.15细胞中的HBx的表达,为研究HBx作为肝癌基因治疗作用的一个靶点以及机制奠定基础。