VEGF_(165)基因转染脂肪组织来源干细胞后目的基因表达

目的检测人脂肪组织来源干细胞(ADSC)经血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染后目的基因的表达,为下一步利用经基因转染的ADSC构建血管化组织工程脂肪组织打下基础。方法行腺病毒重组血管内皮生长因子165(Ad-VEGF165)基因转染ADSC,通过免疫细胞荧光和ELISA鉴定VEGF在细胞中的表达情况。结果经免疫荧光和ELISA检测证实腺病毒能成功地将VEGF165基因转染至ADSC中,并获得有效的表达。结论采用Ad-VEGF165基因转移技术,可以将VEGF转染至ADSC中,并有目的基因的表达,为促进脂肪组织工程血管化奠定基础。     

VEGF165贷基因转染脂肪组织来源干细胞后目的基因表达

目的检测人脂肪组织来源干细胞（ADSC）经血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因转染后目的基因的表达，为下一步利用经基因转染的ADSC构建血管化组织工程脂肪组织打下基础。方法行腺病毒重组血管内皮生长因子165（Ad-VEGF165）基因转染ADSC，通过免疫细胞荧光和ELISA鉴定VEGF在细胞中的表达情况。结果经免疫荧光和ELISA检测证实腺病毒能成功地将VEGF165基因转染至ADSC中，并获得有效的表达。结论采用Ad-VEGF165基因转移技术，可以将VEGF转染至ADSC中，并有目的基因的表达，为促进脂肪组织工程血管化奠定基础。     

VEGF基因真核表达载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的探讨经腺病毒表达载体转染血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)165基因的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)体内外基因表达的特点。方法构建VEGF基因腺病毒表达载体,将VEGF165基因转染到MSCs中。用RT-PCR法检测转基因MSCs中基因表达情况。结果转基因MSCs及其分化的子代细胞均有VEGF165的表达,并持续2周左右时间。结论经腺病毒表达载体转染VEGF165基因的MSCs在体内外均有良好的基因表达。     

人VEGF165基因转染兔骨髓内皮祖细胞及对其增殖的影响

目的 探讨人血管内皮生长因子165(hVEGF165)基因转染兔骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)及对EPCs增殖的影响.方法 体外分离、培养、扩增并鉴定EPCs,脂质体介导转染携带增强型绿色荧光蛋白标记的VEGF165质粒、空白质粒,同时经ELISA法检测转基因EPCs表达VEGF蛋白,并采用CCK-8法检测对其增殖的影响.结果 FITC标记荆豆凝集素Ⅰ和Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白荧光双染证实正在分化的EPCs,同时经免疫组化法证实VEGF受体2 FLk-1和Ⅷ因子的表达;VEGF165质粒转染组EPCs上清液中表达VEGF165,VEGF165转染EPCs的转染率约22.5%;hVEGF165基因转染促进EPCs增殖.结论 hVEGF165基因可成功转染EPCs,且可促进EPCs的增殖,为基因治疗血管性疾病提供了动物实验基础.     

血管内皮细胞生长因子基因转染诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为内皮细胞

目的：评价经腺病毒介导的血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染后的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导成内皮细胞的可行性。方法：从大鼠骨髓中分离培养获取BMSCs，分别经Adv-VEGF、Adv-GFP转染，Western印迹分析检测VEGF蛋白的表达情况．细胞生长曲线测定BMSCs增殖特性．同时进行免疫表型鉴定．并与未转染细胞组比较。结果：Adv-VEGF转染组BMSCs可分泌VEGF蛋白，而其杂两组不分泌VEGF蛋白。转染VEGF基因后,BMSCs生长速度变快．向内皮细胞分化。与Adv-VEGF转染组BMSCs相比．Adv-GFP转集细胞组、未转染细胞组的BMSCs生长速度较慢．未有向内皮细胞分化的证据。结论：腺病毒介导的VEGF基因转繁可诱导BMSCs分化成内皮细胞。     

重组腺病毒介导血管内皮生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达及其影响

目的观察重组腺病毒介导血管内皮生长因子基因(AdVEGF165)转染后大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中血管内皮生长因子的表达情况以及腺病毒载体对大鼠骨髓间充质干细胞的生长影响情况。方法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,用腺病毒载体转染BMSCs。采用ELISA法检测血管内皮生长子因子(VEGF)的表达和分泌。转染后用胰酶消化传代培养,MTT法绘制细胞生长曲线。结果AdVEGF165转染组上清液中VEGF蛋白表达量极显著高于空白对照组(P<0.01)。且AdVEGF165转染BMSCs后,生长曲线与正常培养细胞无显著差异(P>0.05)。结论重组腺病毒载体能够在BMSCs中介导VEGF的表达,且对BMSCs生长无影响。     

人血管内皮生长因子165基因腺病毒载体的构建及其在C17.2神经干细胞的表达

[目的]构建含有人血管内皮生长因子165(VEGF165)基因的重组腺病毒载体并观察其在C17.2神经干细胞的表达,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供基础.[方法]将VEGF165基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV,获得重组质粒pAdTrack VEGF165,经酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠杆菌BJ5183同源重组获得重组腺病毒质粒,将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒pAdCMV VEGF165,转化体外培养的C17.2神经干细胞.通过RT-PCR、原位杂交、免疫组化、Western blot法检测其在C17.2神经干细胞中的表达.[结果]重组腺病毒AdCMV VEGF165在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×1011efu/mL.病毒上清液经ELISA检测VEGF165表达的量为(1135±138)ng/L.重组腺病毒转染神经干细胞后有稳定表达.[结论]成功构建pAd VEGF165重组腺病毒,获得了稳定表达VEGF165的神经干细胞克隆,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供了基础.     

VEGF165基因转染EPCs移植对大鼠阿霉素肾病组织学的影响

目的 构建含血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒(Ad-VEGF165),转染血管内皮祖细胞(EPCs)后,观察其对阿霉素肾病大鼠肾脏组织学的影响.方法 用细菌内同源重组法构建含VEGF165基因的重组腺病毒Ad-VEGF165,通过PCR和Western blot鉴定所构建的腺病毒.贴壁法体外培养获得大鼠骨髓来源的EPCs,Ad-VEGF165体外转染EPCs,检测转染后目的基因的蛋白表达.大鼠阿霉素肾病模型形成过程中,尾静脉注射转染Ad-VEGF165的EPCs,在第16周时观察肾脏组织学变化.结果 PCR和Western blot证实构建的重组腺病毒含有目的基因,滴度为1.4×1010PFU/ml;培养第6天的EPCs用于Ad-VEGF165转染,转染后24 h,培养上清中VEGF蛋白表达较对照组和转染前增加.转染了VEGF165基因的EPCs移植后第12周(切肾术后16周),转染组的肾小球硬化和肾小管间质纤维化的程度明显较肾病组轻.结论 转染了VEGF165基因的EPCs可以减轻阿霉素肾病的肾小球和肾小管的损伤程度,为VEGF在慢性肾脏病治疗提供了实验基础.     

tPA和VEGF165基因共表达质粒的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的 构建携带人组织纤溶酶原激活物(tPA)和血管内皮细胞生长因子165(VEGFl65)基因的真核表达质粒pBudCE4．1／tPA-VEGF165,并观察其在血管平滑肌细胞(VSMC)中的表达。方法从人心脏组织中克隆tPA和VEGF165基因。将tPA和VEGF165基因克隆至真核表达质粒pBudCE4．1中,构建共表达质粒pBudCE4．1／tPA-VEGF165。将pBudCE4．1／tPA-VEGF165转染VSMC,用RT-PCR法检测转染的VSMC中tPA和VEGFl65mRNA的表达,用ELISA法检测转染的VSMC培养液中tPA和VEGF165蛋白质。结果人tPA和VEGF165基因的RT-PCR产物分别为1．9kb和576bp。经酶切鉴定证实,tPA和VEGF165基因已克隆至真核表达质粒pBudCE4．1中。以其转染VSMC后,经RT-PCR和ELISA检测发现,tPA和VEGF165在mRNA和蛋白质水平均有表达。结论成功地构建了真核共表达质粒pBudCE4．1／tPA-VEGF165,并在VSMC中表达tPA和VEGF165。     

人VEGF基因腺病毒表达载体修饰大鼠骨髓间充质干细胞

目的 探讨含人血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因腺病毒表达载体Ad-VEGF转染大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的可行性.方法 采用贴壁培养筛选法富集大鼠BM-MSCs.将HEK293细胞中扩增并经效价分析后的Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs,通过对细胞转染效率、生长和活力的观察分析,以确定理想的感染复数(MOI)值.结果 本实验经HEK293细胞扩增制备的Ad-VEGF的病毒效价达8×108 pfu/ml;当MOI值为50时,Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs效率可达最高值53％;而MOI值高于50时,Ad-VEGF转染对BM-MSCs活性抑制明显.结论 成功实现Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs,其最适MOI值为50.     

人VEGF166基因转染兔骨髓内皮祖细胞及对其增殖的影响

目的探讨人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因转染兔骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对EPCs增殖的影响。方法体外分离、培养、扩增并鉴定EPCs,脂质体介导转染携带增强型绿色荧光蛋白标记的VEGF166质粒、空白质粒,同时经ELISA法检测转基因EPCs表达VEGF蛋白,并采用CCK-8法检测对其增殖的影响。结果FITC标记剂豆凝集素I和Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白荧光双染证实正在分化的EPCs,同时经免疫组化法证实VEGF受体2FLk-1和VIII因子的表达;VEGF165质粒转染组EPCs上清液中表达VEGF166,VEGF165转染EPCs的转染率约22．5％;hVEGF165基因转染促进EPCs增殖。结论hVEGF165基因可成功转染EPCs,且可促进EPCs的增殖,为基因治疗血管性疾病提供了动物实验基础。     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

 【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体,利用贴壁法分离培养MSCs后,用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率,用免疫组化、Western-Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率,转染效率与病毒感染复制数(multiplicyties of infection,MOI)具有量效关系。MOI为150倍时,转染效率>95%,转染VEGF后,MSCs可有效表达VEGF,9d时达到表达高峰(1125pg/mL),13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs,MSCs是一种理想的基因载体细胞,其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

tPA和VEGF165基因共表达质粒对人血管细胞增殖的影响和纤溶作用

目的：观察组织纤溶酶原激活物（tPA）和血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）基因共表达质粒在血管平滑肌细胞（VSMC）中的表达,并研究表达产物对血管内皮细胞（VEC）和VSMC增殖的影响和纤溶作用。方法：用脂质体转染法将tPA和VEGF165的共表达质粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165转染VSMC,逆转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）和酶联免疫吸附实验（ELISA）分别从mRNA水平和蛋白质水平检测tPA和VEGF165的表达;纤溶蛋白板法检测转染基因的VSMC培养基中tPA的纤溶活性;取转染pBudCE4.1/tPA-VEGF165质粒的VSMC培养基培养VEC和VSMC,用四甲基偶氮唑盐（MTT法）和流式细胞技术检测转基因VSMC的细胞培养基对VEC和VSMC增殖的影响。结果：pBudCE4.1/tPA-VEGF165转染VSMC后,RT-PCR和ELISA检测发现,tPA和VEGF165在mRNA和蛋白质水平均有表达;转基因培养基有明显促进纤溶和促VEC增殖作用,而对VSMC增殖无作用。结论：tPA和VEGF165基因共表达质粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165能在VSMC表达有生物学活性的tPA和VEGF165,为tPA和VEGF165基因转染防治移植心脏内血管狭窄奠定了基础。     

转染逆转录病毒的VEGF在兔骨髓基质干细胞内的表达

目的 :检测逆转录病毒介导血管内皮细胞生长因子(VEGF1 65)基因转染兔骨髓基质干细胞 (BMSC)后目的基因表达情况及促血管生成作用 ,为进一步将其用于血管化组织工程骨构建奠定基础 .方法 :构建含VEGF基因的逆转录病毒表达载体 ,通过感染兔BMSC 使其获得稳定表达 ,使用免疫组化的方法检测其蛋白表达 ,并通过新生血管计数观察其促血管生成作用 .结果 :成功构建VEGF逆转录病毒表达载体 ,免疫组化方法显示经感染的BMSC 胞质中有阳性棕色颗粒出现 ,且动物实验显示新生血管计数明显高于对照组 (P <0 .0 1 ) .结论 :采用逆转录病毒介导的基因转移技术可将VEGF基因转染至BMSC 中 ,可获得外源性蛋白的表达 ,且有明显的促血管生成作用 .     

VEGF165基因转染的内皮祖细胞移植对大鼠肾脏缺血再灌注后的保护作用

评估VEGF165基因转染的内源性内皮祖细胞(EPCs)移植治疗肾脏缺血再灌注损伤(IRI)的作用,进一步完善EPCs对肾脏IRI产生保护作用的旁分泌机制。利用重组腺病毒载体Ad-VEGF165感染EPCs,并进行转染效率鉴定。并进一步移植治疗大鼠肾脏IRI,术后24h和72h分别评估血清肌酐及尿素氮水平;组织病理学检查评估各组大鼠术后肾损伤程度;Western blot检测大鼠肾脏IRI中血管内皮生长因子 (VEGF)、血管生成素-1 (Ang-1)及血管生成素-2 (Ang-2) 表达情况。结果发现利用重组腺病毒载体Ad-VEGF165转染的EPCs移植治疗后,大鼠肾脏功能明显改善,术后72h检测大鼠患肾,其内VEGF、Ang-1以及Ang-2表达水平均明显提升。因此,VEGF165基因转染的EPCs移植治疗可以有效的治疗大鼠肾脏IRI,其作用机制可能与EPCs归巢后旁分泌过量VEGF并进一步促进Ang-1、Ang-2等血管新生因子表达,从而促使肾脏血管新生有关。     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子（VEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体，利用贴壁法分离培养MSCs后，用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率，用免疫组化、Western—Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率，转染效率与病毒感染复制数（multipcyties of infection，MOI）具有量效关系。MOI为150倍时，转染效率〉95％，转染VEGF后，MSCs可有效表达VEGF，9d时达到表达高峰（1125pg／mL），13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs，MSCs是一种理想的基因载体细胞，其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

血管内皮生长因子基因修饰内皮祖细胞对内膜损伤血管修复的影响

目的 探讨人血管内皮细胞生长因子165(hVEGF165)基因转染骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)及对EPCs增殖的影响,在体研究VEGF基因修饰EPCs对内膜损伤血管再内皮化的影响.方法 体外分离、培养、鉴定EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组、pcDNA3空质粒转染组、空白对照组.ELISA法检测EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测hVEGF165基因修饰对EPCs增殖的影响.基因修饰EPCs移植到内膜损伤血管模型中,观察基因修饰对EPCs修复内膜损伤的效应.结果 FITC-UEA-Ⅰ和DiⅠ-acLDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs迁移、黏附和增殖.基因修饰EPCs促进损伤内膜修复.结论 EPCs可以成功转染hVEGF165基因,并且促进EPCs的迁移、黏附和增殖,增强EPCs对损伤内膜修复的能力.     

构建及在血管内皮细胞中的表达

目的:构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在血管内皮细胞中的表达.方法:采用PCR扩增VEGF165基因全长,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP/VEGF165重组质粒,经酶切、PCR及序列分析鉴定,脂质体介导转染体外培养的血管内皮细胞,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹等方法检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF165正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,pEGFP/VEGF165重组质粒转染血管内皮细胞后,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹检测均显示EGFP/VEGF蛋白在血管内皮细胞中表达.结论:成功构建了携带人VEGF165及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,pEGFP/VEGF165可在血管内皮细胞中表达,此为进一步研究VEGF基因治疗缺血性血管疾病奠定了实验基础.     

血管生成素-1在体外对人胃癌细胞生物学作用的研究

目的:探讨人血管生成素-1(Ang1)及其与血管内皮生长因子165(VEGF165)共同作用对人胃癌细胞的生物学作用,研究其在肿瘤发生中的作用机制。方法:应用复制缺陷型腺病毒(Ad)-绿色荧光蛋白(GFP)、Ad-Ang1、Ad-VEGF165和Ad-Ang1 Ad-VEGF165/2转染人胃癌细胞株MGC-803,使用MTT比色法分析它们对胃癌细胞增殖的影响;通过流式细胞仪分析血浆饥饿时其对凋亡的影响;使用免疫细胞化学法检测Ki-67的表达;应用RT-PCR方法半定量检测bcl-2 mRNA、bax mRNA的表达情况。结果:MTT结果显示24、48和72 h Ad-Ang1转染组、Ad-VEGF165转染组和Ad-Ang1 Ad-VEGF165/2转染组吸光度均明显高于Ad-GFP组及对照组(P<0.05);Ad-GFP组与对照组相比无显著差异(P>0.05);Ad-Ang1 Ad-VEGF165/2转染组吸光度明显高于Ad-Ang1转染组和Ad-VEGF165转染组(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示Ad-Ang1、Ad-VEGF165及Ad-Ang1 Ad-VEGF165/2处理组与对照组及空转染组相比均能够显著抑制细胞凋亡(P<0.01)。免疫细胞化学法显示各转染组Ki-67表达强度均显著高于对照组和Ad-GFP组(P<0.01)。RT-PCR结果显示bcl-2 mRNA在各转染组中的表达要明显高于对照组(P<0.05);bax mRNA在各转染组中的表达要明显低于对照组(P<0.05)。结论:Ang1、VEGF165和Ang1 VEGF165/2能够明显促进人胃癌细胞MGC-803增殖,抑制血浆饥饿时的凋亡,Ang1 VEGF165/2组的作用要显著强于Ang1组和VEGF165组。     

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外转染心肌细胞的研究

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)基因的重组腺病毒载体,并转染体外培养的心肌细胞,检测VEGF的表达.方法:将人源性的VEGF165cDNA正向插入到腺病毒载体PDC315,构建重组质粒,通过脂质体共转染293细胞,经同源重组获得携带人VEGF165基因的重组腺病毒,通过PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒,扩增并测定滴度后,体外转染培养的心肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测VEGF在心肌细胞中的表达.结果:人VEGF165cDNA成功地正向插入到PDC315载体中,以重组病毒基因组DNA为模板,同时扩增出了610bp的VEGF165cDNA基因片段,证实了所构建病毒的正确性,病毒滴度为2.8×108 pfu/ml,Ad VEGF165体外转染心肌细胞3 d后,在培养细胞的上清液及细胞内检测到了VEGF的表达.结论:成功构建了表达人VEGF 165基因的腺病毒载体,体外转染心肌细胞后能够满意表达VEGF,为基因治疗心肌缺血奠定基础.