人VEGF166基因转染兔骨髓内皮祖细胞及对其增殖的影响

目的探讨人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因转染兔骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对EPCs增殖的影响。方法体外分离、培养、扩增并鉴定EPCs,脂质体介导转染携带增强型绿色荧光蛋白标记的VEGF166质粒、空白质粒,同时经ELISA法检测转基因EPCs表达VEGF蛋白,并采用CCK-8法检测对其增殖的影响。结果FITC标记剂豆凝集素I和Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白荧光双染证实正在分化的EPCs,同时经免疫组化法证实VEGF受体2FLk-1和VIII因子的表达;VEGF165质粒转染组EPCs上清液中表达VEGF166,VEGF165转染EPCs的转染率约22．5％;hVEGF165基因转染促进EPCs增殖。结论hVEGF165基因可成功转染EPCs,且可促进EPCs的增殖,为基因治疗血管性疾病提供了动物实验基础。     

人VEGF 165基因转染大鼠内皮祖细胞及对其增殖的影响

目的探讨人血管内皮细胞生长因子165（hVEGF165）基因转染骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对EPCs增殖的影响。方法体外分离、培养、鉴定EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组、pcDNA3空质粒转染组、空白对照组。ELISA检测EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测hVEGF165基因修饰对EPCs增殖的影响。结果FITC-UEA-Ⅰ和DiI-ac-LDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs增殖。结论EPCs可以成功转染hVEGF165基因,并且可促进EPCs的增殖,为进一步研究hVEGF165基因修饰EPCs治疗血管内膜损伤性疾病提供实验依据。     

人血管内皮细胞生长因子165基因转染大鼠内皮祖细胞的实验研究

目的探讨人血管内皮细胞生长因子165（hVEGF165）基因转染骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对其影响。方法体外分离、培养、鉴定大鼠骨髓EPCs,ELISA检测转基因EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测对其增殖的影响。结果FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs增殖,注射转基因EPCs的大鼠皮下局部血管增加。结论hVEGF165基因可成功转染EPCs,并且具有血管内皮增殖刺激活性,为进一步研究hVEGF165基因修饰EPCs治疗血管内膜损伤性疾病提供实验依据。     

pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染骨髓内皮祖细胞后VEGF165的表达

目的:培养和鉴定大鼠内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs),观察pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染大鼠骨髓内皮祖细胞后内皮细胞生长因子165(Vascular endot-helial growth fator-165,VEGF165)的表达.方法:体外培养内皮祖细胞,以免疫细胞化学法检测其表面抗原(CD34、CD133、KDR)的表达.通过pcDNA3.1(+)质粒转染VEGF165后,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测内皮祖细胞培养上清液中VEGF蛋白的水平,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测内皮祖细胞中VEGF165mRNA的表达.结果:免疫细胞化学检测表明培养的细胞为大鼠内皮祖细胞,PCR后凝胶电泳显示pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染组在576 bp处可见有明显条带,pcDNA3.1(+)空质粒转染组和未转染组可见微弱的电泳带位于500 bp与600 bp之间,约576bp大小.ELISA检测结果为pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染组上清液中VEGF165水平为(175.8±10.7)pg/ml,pcDNA3.1(+)空质粒组为(10.5±1.6)pg/ml,未转染组为(9.3±1.3)pg/ml.结论:内皮祖细胞体外培养有微量VEGF165表达,应用pcDNA3.1(+)/VEGF165载体转染,可使SD大鼠内皮祖细胞高效表达VEGF165.     

血管内皮生长因子基因修饰内皮祖细胞对内膜损伤血管修复的影响

目的 探讨人血管内皮细胞生长因子165(hVEGF165)基因转染骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)及对EPCs增殖的影响,在体研究VEGF基因修饰EPCs对内膜损伤血管再内皮化的影响.方法 体外分离、培养、鉴定EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组、pcDNA3空质粒转染组、空白对照组.ELISA法检测EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测hVEGF165基因修饰对EPCs增殖的影响.基因修饰EPCs移植到内膜损伤血管模型中,观察基因修饰对EPCs修复内膜损伤的效应.结果 FITC-UEA-Ⅰ和DiⅠ-acLDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs迁移、黏附和增殖.基因修饰EPCs促进损伤内膜修复.结论 EPCs可以成功转染hVEGF165基因,并且促进EPCs的迁移、黏附和增殖,增强EPCs对损伤内膜修复的能力.     

VEGF165转染内皮祖细胞移植对大鼠肾脏缺血再灌注的保护作用

目的：评估VEGF165基因转染的内源性内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）移植治疗肾脏缺血再灌注损伤（ischemia?reperfusion injury,IRI）的作用,进一步阐明EPCs对肾脏IRI产生保护作用的旁分泌机制。方法：40只成年雄性SD大鼠被随机分成4组,其中包括假手术组、缺血再灌注组、EPC移植组、携带VEGF165基因转染组。利用重组腺病毒载体Ad?VEGF165感染EPCs,并进行转染效率鉴定。并进一步移植治疗大鼠肾脏IRI,术后24 h和72 h分别评估血清肌酐及尿素氮水平;组织病理学检查评估各组大鼠术后肾损伤程度;免疫组化染色评估CD31表达情况;Western blot检测大鼠肾脏IRI中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、血管生成素?1（Ang?1）及血管生成素?2（Ang?2）表达情况。结果：研究发现利用重组腺病毒载体Ad?VEGF165转染的EPCs移植治疗后,大鼠肾脏血清肌酐、尿素氮水平和肾脏组织病理学明显改善,术后72 h检测大鼠患肾,其CD31、VEGF、Ang?1以及Ang?2表达水平均明显提升。结论：VEGF165基因转染的EPCs移植治疗可以有效治疗大鼠肾脏IRI,其作用机制可能与EPCs归巢后旁分泌过量VEGF并进一步促进Ang?1、Ang?2等血管新生因子表达,从而促使肾脏血管新生有关。     

血管内皮细胞生长因子165基因转染对兔骨缺损修复的影响

目的 构建pcDNA3．1-血管内皮细胞生长因子（VEGF）165质粒,观察其对兔骨缺损修复的影响。方法构建成重组真核表达质粒pcDNA3．1-VEGF165;采用30只新西兰大白兔,制备双侧桡骨骨缺损模型,实验组以体积等大的明胶海绵置于创腔,局部直接注射稀释的质粒液200ng;对照组以同量生理盐水代替质粒液,同法处理。于术后1、2、4、6、8和12周行X线照片后获取标本,观察缺损局部组织修复及新生血管并计算微血管密度（MVD）。结果pcDNA3．1-VEGF165质粒构建成功,测序正确。术后X线：1周时两组无明显差别,实验组2周骨痂形成、骨质修复,12周时骨质已正常,对照组表现为修复迟缓;HE染色：实验组2周大量新生血管形成、通血,4周成骨细胞大量增殖、骨小梁形成,12周骨皮质改建完成,骨髓腔再通;对照组经历过程类似,但相对时间延迟,12周时骨髓腔及皮质改建尚未完成。2周时对照组及实验组MVD分别为56．1±6．1、69．1±5．4,均较1周时42．2±6．4、47．0±7．5时增加,组间及组内间差异有统计学意义（t=8．0347,P=0．0000）。结论骨缺损局部直接应用PcDNA3．1-VEGF165质粒液后,可表达并上调VEGF165,具有促进局部微血管形成、加快骨缺损修复的作用。     

兔外周血内皮祖细胞的培养与鉴定

目的研究兔外周血内皮祖细胞(EPCs)的分离和定向培养的方法,并对其功能进行鉴定。方法从兔股静脉插管抽取静脉血20 mL,采用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心法分离单个核细胞,接种于人纤连蛋白包被的培养板上,分别予含血管内皮生长因子(VEGF)20 ng／mL或内皮细胞生长添加剂(ECGS)30μg／mL的M199培养基培养。培养2周后进行免疫荧光染色鉴定内皮祖细胞。结果每毫升外周血可分离1×106～2×106个单个核细胞,两组均于接种后第2～3天细胞胞体增大,有的呈多边形或梭形;第4天出现条带或栅栏状分布;第7～8天梭形细胞增多;第14天左右出现细胞集落,其特点是中央为圆形细胞,外周是梭形细胞;添加VEGF的培养基组每接种5×105个单个核细胞出现5～10个细胞集落,而添加ECGS者出现8～15个。第4周,添加VEGF的培养基组的细胞开始脱落而死亡,而添加ECGS的细胞仍持续稳定生长,呈铺路石样分布。两组在荧光显微镜下均可见双阳性的EPCs,血管性假性血友病因子(vWF)染色阳性。结论采用VEGF和ECGS均可体外培养兔外周血内皮祖细胞,且均能使其诱导分化为内皮样细胞,而ECGS较VEGF诱导效果更佳。     

VEGF121转染对诱导后血管内皮细胞增殖的影响

目的 探讨VEGF基因转染对VEGF诱导后血管内皮细胞生物学功能的影响,为组织工程血管构建提供血管内皮细胞的可能性.方法 应用VEGF体外诱导兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化成血管内皮细胞后,再通过脂质体介导的方法将pCDI/VEGF121转染分化后的血管内皮细胞,通过MTT及流式细胞仪检测转染前后细胞的增殖与凋亡能力.结果 诱导培养2周后兔骨髓基质细胞转化为血管内皮细胞,VEGF基因转染血管内皮细胞后表达VEGF蛋白,转染后细胞增殖能力增加,凋亡能力下降.结论 转染VEGF是促进VEGF诱导血管内皮细胞增殖的有效途径,可望为组织工程血管构建提供血管内皮细胞衬层,为人工血管内皮化开辟一种新的途径.     

血管生成素-1基因重组腺病毒转染兔外周血血管内皮祖细胞的研究

目的探讨重组腺病毒介导的血管生成素-1（Ang-1）基因转染兔外周血血管内皮祖细胞（EPCs）的方法及效果。方法从兔外周血中体外分离、扩增EPCs,采用免疫组织化学和荧光化学法鉴定EPCs,设EPCs细胞对照组（EPCs）、EPCs＋Ad空病毒载体对照组（EPCs＋Ad）及EPCs＋Ad-Ang-1组（EPCs＋Ad-Ang-1）。以携带Ang-1基因的重组腺病毒转染EPCs后,用荧光显微镜下观察转染效果,RT-PCR鉴定细胞内Ang-1基因在EPCs中的转录;ELISA法检测细胞培养上清中的Ang-1蛋白表达。结果 EPCs＋Ad-Ang-1组镜下观察到大部分细胞呈现绿色荧光;RT-PCR鉴定证实EPCs细胞内的Ang-1转录;ELISA检测证实EPCs＋Ad-Ang-1组细胞上清液中Ang-1的浓度高于EPCs组和EPCs＋Ad组（均P〈0.05）。结论腺病毒介导的Ang-1基因转染外周血EPCs可行。     

Transplantation of VEGF165-gene-transfected endothelial progenitor cells

Background: To study the cotherapeutic effect of stem cell transplantation and gene transfection on chronic venous thrombosis. Methods: We constructed a recombinant adenoviral vector carrying the VEGF165 gene by using the pAdEasy system, which was subsequently identified and amplified. Simultaneously, endothelial progenitor cells (EPCs) were isolated from rat bone marrow by using Ficoll, cultured in EBM-2MV medium, and identified. Then, the cells were transfected with the recombinant Ad-VEGF165. The EPCs were labeled with 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine (Dil) before transplantation. An experimental rat model of chronic vein thrombosis was developed by partial ligation of the inferior vena cava. The rats were randomly divided into 4 groups: A (n = 25), Ad-VEGF165/EPC-transplantation group, which received 1 ml (106) of Ad-VEGF165/EPCs; B (n = 25), EPC-transplantation group, which received 1 ml (106) of EPCs; C (n = 25), Ad/EPC-transplantation group, which received 1 ml (106) of Ad/EPCs; D (n = 25), control group, which received 1 ml of the transplantation medium. The thrombi and adjacent caval walls were harvested 28 days after transplantation; real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the expression level of VEGF mRNA; and western blotting was used to measure thrombosis and changes in VEGF protein expression. Hematoxylin-eosin (HE) staining and immunohistochemical staining were performed to detect recanalization, and neovascularization was observed by scanning electron microscopy. The capillary density was quantitatively determined by counting the capillaries under a high-power microscope. SPSS 11.5 software used for analysis, and differences at P < 0.05 were considered to be significant. Results: The Ad-VEGF165 was constructed, and bone-marrow-derived EPCs were cultivated and successfully identified. We determined the optimum transfection ratio that promoted the growth of EPCs. After transfection, the EPCs secreted the VEGF protein. After transplantation, the in vivo survival of EPCs and their differentiation into endothelial cells were determined by detecting the fluorescence associated with the Dil stain. VEGF mRNA was expressed in groups A, B, C, and D after transplantation, and the VEGF mRNA level in group A was significantly higher than those in groups B, C, and D (P < 0.05); the VEGF mRNA levels in groups B and C were significantly higher than those in group D (P < 0.05), and there was no statistical significance between the VEGF mRNA levels in groups B and group C. The recanalization capillary density in group A was significantly higher than those in groups B, C (P < 0.05), and D (P < 0.01); the recanalization capillary densities in groups B and C were significantly higher than that in group D (P < 0.05). Moreover, there was no statistical significant difference between the values for groups B and C. Neovascularization was detected by immunohistochemical staining using the antibody for vWF, which is a component of endothelial cells. Conclusion: The EPCs were successfully transfected by Ad-VEGF165. A suitable transfection ratio can improve the efficiency of EPCs, improving the possibility of promotion of angiogenesis after transplantation. Transfected EPCs caused accelerated organization and recanalization of vein thrombi.     

人VEGF基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：建立人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的方法。方法：采用密度梯度离心-贴壁培养法获Wistar大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,测定其生长曲线和表面标志CD34,CD44,CD45及SH3,检测其向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化潜能后;用脂质体介导法将pcDNA3.1-hVEGF165导入MSCs,观察转染后细胞形态和生长状况,通过RT-PCR,Western blot和ELISA鉴定VEGF在MSCs中的表达情况。结果：大鼠MSCs经检测为CD44和SH3阳性,CD45和CD34阴性,可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞;经RT-PCR,Western和ELISA检测证实阳离子脂质体能成功地将hVEGF。转染至大鼠MSCs,并获得有效的表达。结论：真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165在MSCs中获有效表达。     

氧自由基对内皮祖细胞的损伤及槲皮素的保护作用

目的研究氧自由基对内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)的损伤及槲皮素(quercetin,Que)的保护作用。方法分离并诱导分化人脐血EPCs,随机分为对照组、过氧化氢(H2O2)组:加入500μmol/L的H2O2建立氧化应激损伤EPCs模型、Que干预组:先分别加入浓度为60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L的Que预处理30min后,后加500μmol/L H2O2共同培养。培养24h及48h后使用WST-1法观察EPCs增殖情况。结果与空白对照组比较,60～90μmol/L的Que可以促进EPCs增殖,120μmol/L的Que则表现出抑制EPCs增殖的作用,与培养24h比,在48h对EPCs的抑制作用较为明显。差异均有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组比较,H2O2组EPCs增殖能力明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。加入60～120μmol/L的Que处理后,损伤后EPCs的细胞增殖能力得到明显改善,且具有明显的时间和浓度依赖性,与H2O2组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论氧化应激损害内皮祖细胞的增殖能力,而槲皮素有显著的改善作用。     

IL-8/CXCR_2轴促进兔内皮祖细胞迁移、增殖及VEGF的表达

目的 观察不同浓度白介素-8(interleukin-8,IL-8)对体外培养兔外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)生物学功能的影响,探讨趋化因子IL-8/CXC_2,轴对EPCs血管生成功能的作用.方法 密度梯度离心法获取兔外周血单个核细胞(mononuclear cells,MNCs),接种至纤维连接蛋白(fibronectin,FN)包被的培养板上,培养7-10 d后收集贴壁细胞鉴定EPCs,并用不同浓度IL-8的培养基继续培养24 h后采用MTT比色法、改良的Boyden小室实验,观察EPCs 的迁移和增殖能力;采用RT-PCR、Western blot方法检测CXCR_2、VEGF mRNA及蛋白表达水平.结果 IL-8显著增加兔外周血EPCs的增殖和迁移能力(P<0.05),且随着IL-8浓度升高而增强.IL-8促进CXCR_2膜受体和VEGF的表达,且随着IL-8浓度增加而增加.结论 IL-8/CXCR_2轴能显著促进EPCs的迁移、增殖及VEGF的表达.     

VEGF165反义RNA表达对人胃癌细胞恶性生物学行为的影响

目的利用本室构建的反义VEGF165（血管内皮生长因子,vascular endothelial growth factor）真核表达载体,研究VEGF反义RNA表达对人胃癌细胞生物学表型的影响. 方法用阳性脂质体介导的基因转染技术,将VEGF反义RNA重组体转入人胃癌细胞系,观察转染细胞的细胞周期、增殖能力及致瘤生长情况等生物学表现. 结果 VEGF反义RNA重组体转染胃癌细胞后,斑点杂交、间接免疫荧光等分析显示,反义RNA基因转染技术可使VEGF的表达明显减弱;与未转染的细胞相比,G2/M期细胞增加(0.39),而S期细胞减少(0.54);克隆形成率(2.2%)低于未转染细胞(4.0%);肿瘤细胞接种裸鼠后33 d时,VEGF反义RNA表达人胃癌细胞所致的移植瘤体积（345±136) mm3明显小于未转染细胞所致的移植瘤体积（1534±363) mm3. 结论 VEGF反义RNA可以通过抑制肿瘤组织血管生成而防治肿瘤的生长,另外VEGF的表达可能与细胞增殖能力有关.     

通心络体外促进人外周血内皮祖细胞的增殖

目的：观察中药通心络（Tongxinluo）对体外培养的人外周血内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）增殖的影响。方法：采用密度梯度离心法分离培养人外周血单个核细胞，经FITC标记荆豆凝集素I（FITC-UEA-I）和Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-acLDL）双染色鉴定为正在分化的EPCs，并进一步通过流式细胞仪检测其表面标志CD34、CD133。分别以不同浓度（O、50、100、200、500、750和1000μg／ml）通心络超微粉溶液作用36h，以及500μg／ml通心络超微粉溶液作用不同时间（O、6、12、24和36h）后，MTT法观察EPCs增殖的情况。结果：与对照组比较，不同浓度通心络组均改善了EPCs的增殖功能（P〈0.05），在500μg／ml时最为显著（P〈0.01）；500μg／ml通心络能明显促进EPCs增殖能力（P〈0.05，P〈0.01），随时间延长促进作用逐渐增强，36h达到高峰（增殖率为54．18％，P〈0.01）。结论：通心络体外能显著改善外周血内皮祖细胞增殖的能力。     

VEGF,b-FGF诱导人脐血单个核细胞向血管内皮祖细胞分化的研究

目的:研究VEGF, b-FGF诱导下人脐血单个核细胞向血管内皮祖细胞(EPCs)分化.方法:从新鲜脐血中用Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,在加有VEGF,bFGF的M199培养基中培养,培养7 d,免疫组化(SABC法)和免疫荧光检测细胞表面抗原的表达.结果:人脐血血单个核细胞(MNCs)经体外VEGF, b-FGF的诱导分化,表达内皮祖细胞的表面标志KDR, CD1133和CD34.结论:人脐血单个核细胞在一定的培养条件下可诱导分化为内皮祖细胞.