人SCARB2蛋白提高人肠道病毒71型对转基因小鼠的感染力

目的细胞实验证实人清道夫受体B2(hSCARB2)是人类EV71的受体,本研究拟通过建立人SCARB2转基因小鼠,建立感染能力更高的小鼠模型。方法构建CMV启动子的SCARB2转基因表达载体,通过显微注射法建立C57BL/6J背景的人SCARB2转基因小鼠,PCR筛选阳性首建鼠。通过Western Blot和免疫组化检测目的蛋白在各组织中的表达。EV71感染转基因小鼠后,通过实时荧光定量PCR和免疫组化检测目的蛋白表达对病毒感染的促进效果。结果人SCARB2蛋白主要在转基因小鼠的骨骼肌和脑组织中表达,与野生型小鼠相比,转基因小鼠组织中的病毒载量显著提高4到5倍。结论人SCARB2的体内表达可促进EV71对转基因小鼠的感染,该蛋白在体内具有EV71受体功能。     

人bcl-xL基因在转基因小鼠中的整合和表达

目的研究人bcl—xL基因在显微注射所产生的子代小鼠中的整合、转录和表达情况。方法采用PCR和Southern blot方法检测人bcl—xL基因在小鼠体内的整合；RT—PCR方法检测它们的bcl—xL mRNA水平；用Western blot及免疫组化法检测目的蛋白的表达情况。结果在显微注射所产生的转基因小鼠中，有4只为Southern blot检测阳性，并且在这4只小鼠及其子代中均检测到人bcl—xL的mRNA和过表达的目的蛋白。结论由于在这些小鼠中既有外源基因的整合，又有其mRNA和蛋白质的表达，所以，它们是真正的转基因动物。     

人体多组织器官EV 71病毒受体SCARB 2和PSGL-1的分布特点

目的探讨人体多组织器官中EV71病毒受体SCARB2和PSGL-1的分布特点及其意义。方法应用免疫组织化学法检测中枢神经、呼吸道、肠道、肝脏、脾脏、心脏组织EV71病毒受体SCARB2和PSGL-1的表达。结果 SCARB2在中枢神经的大脑、小脑、脑干,呼吸道的喉部、气管、支气管、细支气管、肺泡细胞、巨噬细胞以及肠道组织中呈阳性分布,肝脏呈弱阳性或阴性,脾脏、心脏则为阴性,SCARB2受体在中枢神经、呼吸道和肠道的分布明显高于肝脏、脾脏、心脏(P0.05)。PSGL-1在中枢神经的大脑、小脑、脑干,呼吸道的喉部呈阳性分布,呼吸道的气管、支气管、肠道呈少量阳性分布,而肺泡细胞阴性,肝脏、脾脏、心脏为阴性或仅极少量表达阳性。PSGL-1受体在中枢神经系统的分布明显高于呼吸道、肠道、肝脏、脾脏、心脏(P0.05),PSGL-1受体在呼吸道、肠道的分布明显高于肝脏、脾脏、心脏(P0.05)。结论在中枢神经、呼吸道和肠道表达的EV71病毒受体SCARB2和/或PSGL-1,提示上述组织器官是EV71感染的主要部位。     

高表达人源Her2乳腺癌小鼠模型的建立及鉴定

目的 构建并鉴定高表达人源Her2乳腺癌转基因小鼠模型.方法 构建pMD18T-MMTV-huHER2-EGFP转基因构件,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒pMD18T-MMTV-huHER2-EGFP注射入C57BL/6J小鼠受精卵中,胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠.采用PCR鉴定子代小鼠尾部组织基因组DNA,用蛋白质免疫印迹法检测乳腺组织Her2蛋白的表达,通过组织病理学切片观察转基因小鼠乳腺组织的病理学变化.结果 经PCR方法检测得到转基因阳性小鼠.蛋白质免疫印迹结果显示,与野生型小鼠相比,F2代阳性小鼠的乳腺组织中Her2蛋白高表达.病理组织切片表明25周龄阳性小鼠的乳腺组织已经出现明显的癌变倾向.结论 高表达人源Her2乳腺癌小鼠模型成功建立并能稳定遗传,可自发形成乳腺癌,其生物学特性和病理学改变与人乳腺癌相近,可作为研究乳腺癌发生发展的动物模型.     

β防御素2转基因小鼠抗金黄色葡萄球菌感染的研究

目的探讨转基因小鼠抗金黄色葡萄球菌作用。方法用分子克隆方法构建β防御素2（HBD-2）全长cDNA重组质粒,通过显微注射技术,将重组片段注射入小鼠雌原核细胞,聚合酶链反应（PCR）方法检测小鼠HBD2基因整合情况,免疫组化检测转基因小鼠HBD2表达和组织分布。用金黄色葡萄球菌腹腔攻击转基因阳性小鼠观测全身情况和死亡数。结果DNA序列测定证明重组质粒插入HBD-2cDNA片段无误,PCR显示7只小鼠已整合HBD-2基因,PCR阳性小鼠免疫组化显示HBD2基因在肺、肠道、肝、肾、睾丸、小脑等组织广泛表达。腹腔攻击实验显示7只转基因小鼠4只存活,而野生小鼠10只全部死亡。结论HBD-2在体内具有显著抗金色葡萄球菌感染能力。     

瞬时受体电位通道家族M8型受体转基因小鼠模型的建立

目的 建立瞬时受体电住通道家族M8型受体(TRPM8)转基因小鼠模型.方法 通过显微注射法将pcDNA3.1-hTrpm8导入C57BL/6J×CBA F1小鼠的受精卵中,并将其移植到假孕母鼠输卵管中获得子代小鼠.采用PCR方法鉴定子代基因型,通过RT-PCR和免疲印迹法检测Trpm8基因及蛋白在组织中的表达.结果 将405枚注射受精卵移植给15只假孕鼠,其中13只顺利妊娠并产下95只子鼠,经PCR鉴定得到5只转基因阳性首建鼠,其中4只小鼠可稳定传代,经与C57BL/6J小鼠回交7代后互交数代建系.子代转基因小鼠经RT-PCR检测发现Trpm8基因在心脏、肝脏、肾脏、脂肪和骨骼肌中均有表达,且TRPM8蛋白表达在转基因小鼠中显著增加.结论 通过显微注射法成功建立了Trpm8转基因小鼠模型.     

Dicer 1转基因小鼠模型的建立

目的 建立Dicer1转基因小鼠模型.方法 构建pcDNA3.I-Dicer1转基因构件,经酶切、纯化后通过显微注射方法导人BDF1小鼠受精卵原核并移植到同期受孕的ICR受体母鼠输卵管内.出生后仔鼠用PCR和Southern方法检测鼠尾DNA鉴定基因型,通过免疫组化检测Dicer1基冈表达.结果 显微注射172枚卵,移植119枚卵于3只受体输卵管中,2只怀孕,共产仔15只,经PCR检测获得6只阳性鼠,Southern榆测6只均为阳性.对Southern检测阳性转基因小鼠子代进行RT-PCR检测和免疫组化分析证明Dicer1基因在肝脏、肾脏、肺内均有表达.对腹腔肿胀的转基因阳性1号鼠解剖发现肝脏、脾脏明显增大,胚胎发育异常.结论 成功建立Dicer1基因表达的转基因小鼠模型,该模型为进一步研究DICER1基因功能及miRNA的表达及功能等奠定基础.     

EV71临床分离株BALB/c小鼠致病特点分析

目的 将肠道病毒71型(EV71)临床分离株接种小鼠观察其致病特点.方法 将6株EV71临床株分别腹腔接种1日龄BALB/c小鼠,观察小鼠表现以及脑、肺脏、骨骼肌组织病理变化;采用免疫组化和RT-PCR方法,检测组织中病毒抗原和基因片段.结果 临床分离的6株EV71(C4亚型)接种1日龄小鼠均出现病症,其中JN200804株实验小鼠症状较重,小鼠脑组织和骨骼肌可观察到细胞空泡变性、淋巴细胞浸润等病理变化;JN200804株感染组小鼠脑内检测到EV71抗原和基因片段.结论 6株EV71临床株均可感染小鼠并致病,重者出现松弛型麻痹并死亡,轻者出现震颤、麻痹但可恢复至正常.     

心脏过表达人源PRKAG2(G100S)转基因小鼠模型的建立

目的 建立心脏过表达人源PRKAG2 (G100S)的转基因小鼠模型,为进一步研究该人源基因点突变对小鼠心脏发育、形态和功能维持的作用奠定基础.方法 克隆人源基因PRKAG2并构建点突变质粒,将人源PRKAG2 (G100S)插入α肌球蛋白重链(α-MHC)启动子下游,构建转基因表达载体.选用C57BL/6J小鼠为遗传背景,通过显微注射法建立人源PRKAG2(G100S)转基因小鼠模型,利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型.采用实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白质印迹法检测人源PRKAG2 (G100S)的表达.结果 经过回交繁育后建立了2个品系的心脏特异表达人源PRKAG2(G100S)的转基因小鼠品系F2代,并通过qPCR、蛋白质印迹法检测,确认了转基因小鼠心脏组织中人源PRKAG2(G100S)在rmRNA和蛋白水平存在过表达,且该突变能在转基因小鼠中稳定传代.结论 本研究成功建立了心脏特异表达人源PRKAG2(G100S)转基因小鼠模型,人源PRKAG2 (Gl00S)基因在心脏组织的过度表达在小鼠心脏发育和功能维持中的作用需要进一步深入研究与探讨.     

帕金森病α-Synuclein转基因小鼠模型的建立

目的建立人α-Synuclein野生型及两个突变型A53T和A30P基因的转基因动物模型,研究α-Synuclein在帕金森病发病过程中的作用。方法构建人α-Synuclein表达载体,利用显微注射法制备人α-Synuclein基因的转基因小鼠。通过PCR方法鉴定转基因首建鼠及其子代基因型。通过RT-PCR和Western blotting方法鉴定转基因小鼠脑组织中人α-Synuclein mRNA和蛋白表达情况。采用免疫组化鉴定人α-Synuclein在小鼠脑组织中的表达情况。通过Rotatingrod实验评价转基因小鼠的行为改变情况。结果得到表达水平不同的野生型人α-Synuclein转基因小鼠2个品系。得到表达水平不同的A53T突变型α-Synuclein转基因小鼠2个品系。得到表达水平不同的A30P突变型α-Synuclein转基因小鼠3个品系。免疫组化显示,转基因小鼠大脑海马、新皮层、纹状体区出现人α-Synuclein阳性标记的细胞。Rotating rod实验结果显示转基因小鼠表现出明显的进行性运动能力障碍。结论建立了转人α-Synuclein基因的帕金森病小鼠模型。     

脂肪细胞因子CTRP4转基因鼠的构建与鉴定

目的建立人CTRP4基因的转基因小鼠,为脂肪细胞因子CTRP4的体内功能研究奠定基础。方法首先构建人CTRP4的转基因小鼠线性化表达载体,再利用显微注射的方法将载体注射入小鼠受精卵,从而构建人CTRP4的首建鼠(Founder)并与野生型小鼠交配繁殖得到F1代阳性小鼠,再通过近亲繁殖与测交的方法,得到CTRP4转基因纯合子小鼠,并通过PCR和western blot的方法对纯合子小鼠进行鉴定。结果得到人CTRP4转基因小鼠纯合子小鼠两个品系,western blot鉴定该转基因小鼠心脏,肝脏,脑,肾脏等多种组织中均呈现CTRP4高表达。结论成功构建了人CTRP4转基因小鼠纯合子小鼠。     

乙型肝炎病毒(adr亚型)preS2-S基因转基因小鼠的建立

目的：建立可表达乙型肝炎病毒（adr亚型）包膜中蛋白的转基因小鼠品质。方法：通过原核显微注射法制备带有乙型肝炎病毒（adr亚型）preS2-S基因的转基因小鼠。应用PCR方法筛选乙型肝炎病毒preS2-S基因转基因首建者（founder）小鼠，再以免疫组织化学法分析乙型肝炎病毒蛋白在这些小鼠中的表达特性，PCR和免疫组化均阳性的转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配用于传代培育，并用PCR法检测其子代小鼠。结果：共注射受精卵69枚。选取存活受精卵58枚分别植入4只假孕小鼠，产仔并存活23只。经尾组织DNA PCR筛选得到5只整合preS2-S基因的founder小鼠，免疫组织化学法发现其中3只小鼠的肝脏中表达HBsAg，进而对其中表达较强的阳性鼠进行保种。结论：所建立的乙型肝炎病毒（adr亚型）preS2-S基因转基因小鼠品系具有表达乙肝病毒中蛋白的生物学特性，这一品系的建立为中蛋的相关研究提供了技术平台。     

C4亚型人肠道病毒71型的小鼠肌肉适应株对小鼠具有致死毒力

目的 人肠道病毒71型( EV71)感染婴幼儿可导致手足口病,偶尔伴随有严重的并发症.建立EV71的小鼠模型是深入研究病毒感染的致病机制、进行疫苗和药物评价的基础.方法将EV71的临床分离株在小鼠骨骼肌中进行系列传代,得到了小鼠的肌肉适应株MP10.使用MP10经腹腔注射感染10日龄ICR小鼠,对感染小鼠的症状、病毒复制和病理进行了监测.结果 与临床分离株相比,MP10对人横纹肌瘤细胞(rhabdomyosarcoma cell,RD细胞)的感染力提高,并且对小鼠的毒力增强,MP10感染10日龄小鼠可导致其瘫痪和死亡.病毒主要在骨骼肌中复制,并引发大面积的坏死性肌炎,同时神经组织未观察到病变.病理分析发现:感染小鼠体内与呼吸运动相关的肌肉均发生严重的坏死性肌炎,推测此类肌肉的坏死会影响小鼠的呼吸功能,从而成为导致小鼠死亡的因素之一.结论 建立了C4亚型EV71毒株感染10日龄ICR小鼠的模型,该模型可作为研究EV71感染的致病机制、以及疫苗和药物评价的工具.     

波形蛋白对EV71感染小鼠脑组织引起NLRP3炎性小体活化的影响

目的观察肠道病毒71型（EV71）感染的小鼠中枢神经系统中波形蛋白（VIM）介导NLRP3炎性小体的活化。方法取3~ 5 d龄的VIM基因敲除型乳鼠（VIM-/-）40只,随机分为EV71感染实验组和空白对照组,20只/组,实验组每只腹腔注射浓度为1× 108半数组织培养感染剂量（TCID50）病毒液10 μL,空白组腹腔注射无菌PBS 10 μL,再将同品质的野生型乳鼠（WT）40只以同样 方式分组处理。观察小鼠感染状态1周,提取小鼠脑脊液（CSF）和脑组织全蛋白、RNA及组织切片,通过Western blot、ELISA、 RT-PCR检测小鼠中枢神经系统的炎症小体激活状况,以及免疫组化技术考察小鼠中枢神经系统的损伤。结果与空白组比 较,VIM-/-实验组小鼠在感染EV71 后CSF 和脑组织中NLRP3 炎症小体及其下游产物IL-1β、caspase-1 含量无明显变化;而 WT实验组小鼠相较VIM-/-型实验组的NLRP3、IL-1β和caspase-1含量显著升高（P<0.05）;同时WT型实验组IL-1β和caspase-1 的mRNA拷贝数亦明显高于VIM-/-型实验组小鼠（P<0.05）;VIM-/-感染EV71 的脑组织神经元受损程度较WT小鼠明显轻微 （P<0.05）。结论EV71通过感染小鼠脑组织诱发VIM基因介导的NLRP3炎症小体活化,释放IL-1β和caspase-1,这可能是中枢 神经系统炎症和神经元损伤的原因之一。     

GLUT4-Cre转基因模型建立与Cre酶特异性表达

目的：建立骨骼肌和脂肪组织特异性表达Cre重组酶基因的转基因小鼠，以期在上述组织细胞中实现相关基因的条件性剔除。方法：选择人葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)基因的启动子驱动Cre重组酶的特异性表达，利用基因重组技术，构建GLUT4-Cre转基因表达质粒。通过显微注射法将该质粒导入小鼠受精卵细胞核，获得的新生鼠经PCR和Southern杂交方法进行基因型的分析鉴定，常规方法培育、传代转基因鼠。用RT-PCR和免疫组化法对Cre酶在阳性转基因鼠体内mRNA和蛋白表达水平进行检测。结果：获得5只阳性转基因首建鼠，其中3只已建系并稳定传代。在脑、脂肪组织中检测到Cre基因表达，而心肌、骨骼肌及肝脏组织中未检出转基因表达。结论：成功构建了在脑、脂肪组织中特异性表达Cre的转基因鼠，为研究与2型糖尿病、胰岛素抵抗等相关的条件性基因剔除小鼠模型的建立奠定了基础。     

硒代蛋氨酸与亚硒酸钠对EV71在体内外增值的影响

目的探讨硒代蛋氨酸和亚硒酸钠抗EV71病毒感染的效果,解析硒蛋白在机体抗感染的免疫作用。方法以非洲绿猴肾细胞(VERO细胞)和ICR小鼠为研究模型,用体外细胞培养和小鼠的动物实验来探讨不同含量的硒代蛋氨酸和亚硒酸钠对EV71在VERO细胞中和ICR小鼠体内增值的抑制作用,用荧光定量PCR方法定量分析病毒载量。结果 2μmol/L和3μmol/L的硒代蛋氨酸在5d内能有效抑制EV71在VERO细胞中的增值。而用5mg/L硒代蛋氨酸饲养的小鼠产下的幼鼠经EV71感染后,肌肉组织中的EV71核酸载量也比对照组显著降低。结论硒代蛋氨酸在体外和体内都能够有效抑制EV71复制,暗示硒代蛋氨酸可能参加了机体的免疫应答抗EV71的感染。     

缺硒饲养ICR小鼠加快肠道病毒71型在体内的复制研究

目的观察硒蛋白对手足口病病原体肠道病毒71型（EV71）在感染动物体内复制的影响情况。方法将30只雌性ICR小鼠分为常规饲料组、缺硒饲料组和加硒饲料组,各种饲料饲养小鼠6周后,通过电感耦合等离子体质谱仪（ICP—MS）测定小鼠外周血中硒的含量以及荧光定量PCR方法测定动物体内肠道病毒EV71的载量．然后用病毒空斑实验测定病毒滴度并用酶促法来测定主要硒蛋白酶的活性。结果通过测定外周血中硒的含量发现,缺硒饲料组的ICR小鼠硒含量为0．081μg／g,显著低于常规饲料组0．135μg／g和加硒饲料组的0．128μg／g,差异有统计学意义（P〈0．01）;用荧光定量PCR方法测定EV71载量,加硒饲料组ICR小鼠体内EV71核酸扩增Ct值,明显高于缺硒饲料组（P〈0．05）;ICR小鼠体内主要硒蛋白酶（GPX1）的活力在缺硒饲料组的动物体内显著低于加硒饲料组：病毒空斑实验结果表明,缺硒饲料组的ICR小鼠体内EV71病毒复制活力显著高于其他两组。结论缺硒可能导致硒蛋白GPX1合成减少或其活力降低从而加快EV71在宿主内的复制。     

肠道病毒71型能诱导THP-1巨噬细胞的自噬和凋亡

目的 探讨肠道病毒71型（EV71）诱导THP-1巨噬细胞自噬和凋亡及其相关信号通路。方法 设置EV71处理组和DMEM对照组,EV71处理组是用感染复数0.1感染THP-1巨噬细胞2、8和16 h,对照组是用DMEM培养基作为阴性对照即是0 h组。CCK-8检测EV71对THP-1巨噬细胞增殖和毒性的影响;荧光定量PCR法检测EV71在细胞内病毒核酸变化情况;透射电镜观察THP-1巨噬细胞内超微结构变化;Hoechst 33342染色法和AnnexinV/PI 双染法检测EV71诱导THP-1巨噬细胞凋亡的情况; 免疫印迹法分析EV71诱导THP-1巨噬细胞自噬和凋亡相关蛋白水平的变化;用3-MA和Ac-DEVD-CHO抑制剂分别检测EV71对THP-1巨噬细胞自噬和凋亡的影响。结果 EV71作用THP-1巨噬细胞2、8和16h的细胞存活率逐渐下降（P<0.05）;细胞内病毒核酸拷贝数逐渐增多（P<0.01）;可见细胞内自噬小体和病毒颗粒;总细胞凋亡率逐渐增加（P<0.01）;与对照组比较,EV71处理组LC3转化量（LC3-II/LC3-I）逐渐增多,而p62蛋白逐渐减少,cleaved caspase 3蛋白增多,Bcl-2和caspase-3蛋白减少（P<0.01）,而cleaved caspase-8无差异（P>0.05）;与PBS对比,在8 h时3-MA明显抑制EV71诱导THP-1巨噬细胞自噬,LC3-II/LC3-I比值减少,而p62蛋白增多（P<0.01）;与DMSO对比,Ac-DEVD-CHO明显抑制EV71诱导THP-1巨噬细胞凋亡,凋亡率分别为15.5%和7.7%（P<0.01）。结论 EV71能感染THP-1巨噬细胞并在其中复制,且能诱导自噬和凋亡,其可能与激活LC3/p62自噬途径和caspase凋亡途径有关。     

脑内过表达胰岛素样生长因子结合蛋白-4转基因小鼠的建立

目的构建脑内过表达胰岛素样生长因子结合蛋白-4(insulin-like growth factor binding protein-4,IGFBP-4)的转基因小鼠,以研究IGFBP-4对脑发育的作用。方法构建神经元特异性启动子血小板源性生长因子β链(platelet derived growth factorβchain,PDGF-β)驱动的IGFBP-4表达载体,通过显微注射构建转基因小鼠。用PCR法检测小鼠子代基因组IGFBP-4 c DNA的整合情况,Western blotting法和免疫组织化学法观察IGFBP-4在脑内的表达丰度和分布,比较野生型和转基因小鼠的体质量和脑质量的改变。结果外源IGFBP-4 c DNA稳定整合于转基因小鼠基因组,IGFBP-4蛋白在成年小鼠脑内表达水平升高了267%,脑区IGFBP-4蛋白分布符合PDGF-β启动子驱动的蛋白表达特征,与野生型小鼠IGFBP-4部位相似。转基因小鼠体质量未见明显改变,整脑质量增加了8.4%(P<0.05),其中脑干增加了16.5%(P<0.05),其余脑区改变不明显。结论外源IGFBP-4转基因在小鼠基因组中得到整合并能稳定遗传和表达,并影响了部分脑区的发育,为脑发育研究提供了有价值的动物模型。