人SCARB2蛋白提高人肠道病毒71型对转基因小鼠的感染力

目的细胞实验证实人清道夫受体B2(hSCARB2)是人类EV71的受体,本研究拟通过建立人SCARB2转基因小鼠,建立感染能力更高的小鼠模型。方法构建CMV启动子的SCARB2转基因表达载体,通过显微注射法建立C57BL/6J背景的人SCARB2转基因小鼠,PCR筛选阳性首建鼠。通过Western Blot和免疫组化检测目的蛋白在各组织中的表达。EV71感染转基因小鼠后,通过实时荧光定量PCR和免疫组化检测目的蛋白表达对病毒感染的促进效果。结果人SCARB2蛋白主要在转基因小鼠的骨骼肌和脑组织中表达,与野生型小鼠相比,转基因小鼠组织中的病毒载量显著提高4到5倍。结论人SCARB2的体内表达可促进EV71对转基因小鼠的感染,该蛋白在体内具有EV71受体功能。     

SCARB2蛋白提高人肠道病毒71型对转基因小鼠的感染力

目的 细胞实验证实人清道夫受体B2（hSCARB2）是人类EV71的受体,本研究拟通过建立人SCARB2转基因小鼠,建立感染能力更高的小鼠模型.方法 构建CMV启动子的SCARB2转基因表达载体,通过显微注射法建立C57BL/6J背景的人SCARB2转基因小鼠,PCR筛选阳性首建鼠.通过Western Blot和免疫组化检测目的 蛋白在各组织中的表达.EV71感染转基因小鼠后,通过实时荧光定量PCR和免疫组化检测目的 蛋白表达对病毒感染的促进效果.结果 人SCARB2蛋白主要在转基因小鼠的骨骼肌和脑组织中表达,与野生型小鼠相比,转基因小鼠组织中的病毒载量显著提高4到5倍.结论 人SCARB2的体内表达可促进EV71对转基因小鼠的感染,该蛋白在体内具有EV71受体功能.     

Toll样受体在EV71感染发病机制中的作用

肠道病毒71型（Ev71）易致婴幼儿重症手足口病（HFMD）,是近年来儿童发病率最高的传染病,严重的脑干脑炎和神经源性肺水肿是其致死的主要原因。目前EV71精确发病机制尚未阐明,在细胞水平研究发现清道夫受体B族2型（SCARB2）既是EV71病毒受体,也是Toll样受体（TLRs）内源性配体。TLRs作为重要的病原模式识别受体能够识别EV71,与宿主抵抗病毒感染、炎症反应等有直接关系,可能参与介导EV71感染所致混合性拮抗反应综合征（MARS）。现就Toll样受体在EV71感染发病机制中的作用研究现状进行概述。     

陈株病毒抗原在隐性感染小鼠组织中定位的研究

目的:研究汉坦病毒抗原在隐性感染小鼠体内各脏器组织中的定位与分布特点。方法:以陈株汉坦病毒腹腔感染成龄昆明系小鼠,取其心、肝、脾、肺、肾等内脏组织,用免疫组化多重PAP法对病毒抗原进行检测。结果:感染小鼠的肝脏与肺脏是病毒抗原检测阳性率最高的脏器,心脏与脾脏病毒抗原呈阴性分布,肾脏与小肠病毒抗原亦可呈阳性,但阳性率较低。病毒抗原定位于感染细胞的胞浆,主要分布于感染小鼠的血管内皮细胞、肝细胞和肺泡上皮细胞等。结论:(1)肝脏与肺脏是成龄小鼠最易受HV病毒侵犯和寄生的脏器;(2)HV病毒抗原在感染小鼠体内的组织分布与在EHF病人体内的组织分布特点不同,这很可能是成龄小鼠感染HV病毒不发病的原因之一。     

鹌鹑流感病毒SA受体的分布特点及其在流感病毒生态系统中的作用

目的探讨鹌鹑流感病毒受体分布特点及其在流感病毒生态系统中的位置和作用。方法应用亲和组化法检测鹌鹑呼吸道和消化道流感病毒SA受体的分布,用荧光素Alexa488标记的禽流感病毒H9N1、人流感病毒H1N1分别与鹌鹑呼吸道、消化道各解剖部位结合。结果鹌鹑呼吸道均表达SAα-2,3Gal受体和SAα-2,6Gal受体,SAα-2,3Gal受体在呼吸道气管、支气管、次级支气管和消化道结肠上皮细胞均呈弱阳性分布,而副支气管呈阳性弥漫分布;SAα-2,6Gal受体在呼吸道气管、支气管和次级支气管多呈强阳性弥漫分布,而在副支气管、消化道结肠均为缺乏或仅极少量分布。禽流感病毒H9N1、人流感病毒H1N1均可与呼吸道和消化道上皮细胞结合。结论鹌鹑同时表达SAα-2,3Gal受体和α-2,6Gal受体,能与禽流感病毒和人流感病毒结合,有助于病毒基因重配,可充当产生人类流感大流行潜在的中间宿主。     

儿童重症手足口病护理现状

<正>近年来,全国部分地区反复出现儿童手足口病(handfoot-mouth disease,HFMD)疫情流行。病原学证实,HFMD由肠道病毒引起,以柯萨奇A组16型(CoxA16)和肠道病毒71型(EV71)多见[1]。目前,HFMD的发病多数为EV71感染,其中年龄小于3岁的EV71阳性HFMD患儿成为重症病例的危险因素[2]。EV71是一种高度噬神经病毒,脑干和小脑最易被侵     

2例EV71死亡病例的病理特征及EV71宁波分离株全基因组序列分析

目的探讨2例感染EV71手足口病(HFMD)死亡病例的病理特征及其病原体的分子生物学特征。方法系统分析2例HFMD病例的临床资料及尸检病理结果,并对EV71的PCR结果进行序列分析。结果死者年龄均<3岁,病情进展快,最终出现肺水肿和肺出血死亡。尸检显示:病变主要在中枢神经系统、肺脏以及肠道。大脑及脑干可见明显充血、水肿、炎症、坏死及软化灶等,脑脊膜炎症明显;肺脏显著充血,主要为水肿和出血,肺间质及小血管周围少量炎细胞浸润;肠黏膜充血,空肠及回肠部分区域肠黏膜、黏膜下层、平滑肌层、浆膜均坏死,细胞核消失,胞质及间质溶解,肠壁变薄,肠系膜淋巴结肿大,肠系膜及肠黏膜下淋巴滤泡增生,生发中心坏死;心肌纤维细胞结构正常,心肌间质充血,心肌细胞水肿,心外膜少量炎性细胞浸润;肝、脾、肾、胰腺病理改变不明显。肠内容物及总肠道组织EV 71病毒核酸检测均为阳性。EV 71病毒全基因共7414个碱基,该2株EV71均为C4亚型。结论危重型HFMD(EV 71感染)患者神经系统、呼吸系统病变明显,严重的脑干脑炎、脑膜炎和神经源性肺水肿、肺出血是死亡的主要原因;C4亚型EV71感染的重症HFMD患儿肠道的损害亦极为显著,肠道功能保护不容忽视。     

实验动物小鼠及西藏小型猪和猴的甲型流感病毒受体分布特征

目的分析小鼠、西藏小型猪和猴的流感病毒sialic acid(SA)α-2,3-Gal[α-2,3-半乳糖唾液酸]受体和SAα-2,6-Gal受体在不同器官、组织分布特征,为流感病毒的组织嗜性及可能的跨种属传播提供基础数据。方法应用外源凝集素亲和组织化学染色法分析上述实验动物的流感病毒SAα-2,3-Gal受体和SAα-2,6-Gal受体的分布特点及特异性。结果除脑和心脏外,气管与支气管、肺脏、肾脏、脾脏、肝脏、小肠都有SAα-2,3-Gal和SAα-2,6-Gal受体分布,其中小鼠的SA-2,3-Gal受体主要分布在气管纤毛上皮细胞和基底细胞,SAα-2,6-Gal受体在气管纤毛上皮细胞有弥漫性表达;在肺实质,SAα-2,3-Gal受体弥漫性存在于肺泡。西藏小型猪的SAα-2,6-Gal受体主要分布在气管和支气管内上皮细胞的假复层纤毛上皮细胞,肺脏中,SAα-2,6-Gal主要分布在上皮细胞中而SAα-2,3-Gal主要分布在内皮细胞中,在肺泡内层SAα-2,6-Gal和SAα-2,3-Gal受体表达相似;猴的气管和支气管中,SA-2,3-Gal受体主要分布在气管无纤毛上皮细胞(主要是基底细胞),以及支气管部分纤毛和无纤毛上皮细胞;SAα-2,6-Gal受体在气管支气管纤毛细胞和无纤毛上皮细胞有弥漫性表达,且2种受体在肺细胞中均有分布。结论流感病毒SAα-2,3-Gal受体和SAα-2,6-Gal受体在不同器官中均有不同程度分布,其中主要分布在气管与支气管、肺脏等上、下呼吸道。     

EV71肠道病毒感染与脑型手足口病的临床病理分析

目的探讨EV71肠道病毒感染与脑型手足口病的临床病理表现。方法对6例重症脑型手足口病的尸检材料进行病理临床分析。结果 EV71重症病例中枢神经系统病变突出:(1)脊髓、脑干炎,病变部位弥散性神经组织小灶状坏死,形成软化灶。血管周围淋巴细胞呈袖套状浸润。脑实质内淋巴细胞、单核巨噬细胞及少量中性白细胞浸润,小胶质细胞结节状增生。(2)脑、脊髓膜炎,软脑膜及蛛网膜下隙淋巴细胞、单核巨噬细胞浸润,浆液及纤维蛋白渗出。(3)肺淤血、肺水肿、肺实变、肺泡间隔少量淋巴细胞和单核细胞浸润和肺泡透明膜形成。结论EV71肠道病毒感染的小儿病变累及中枢神经时病情凶险,伴随有免疫机能损害、重度中毒性休克、急性呼吸窘迫及缺氧性心肌病,而引起直接死亡原因是严重中枢损害及急性呼吸窘迫征。     

肠道病毒71型特异性单克隆抗体的制备及其在病毒鉴定中的应用

目的：建立肠道病毒71型（ EV71）特异性检测的免疫荧光方法用于病毒分离培养后的EV71鉴定,为EV71生物学特征研究和疫苗株的筛选奠定基础。方法：以EV71 VP1为免疫原制备单克隆抗体,用经测序鉴定的肠道病毒毒株建立EV71特异性免疫荧光方法;将不同地区收集的手足口病患儿的临床标本进行病毒分离,利用EV71特异性单抗进行分离培养后的病毒鉴定。结果：制备获得2株单抗,经鉴定其中1株3 E12为EV71特异性单抗;以此单抗建立的免疫荧光方法对EV71感染细胞呈阳性反应,而与柯萨基病毒A16和埃可病毒6等非EV71肠道病毒不反应。从104份手足口病临床标本中共分离到35株病毒,产生肠道病毒典型的细胞病变;用3E12特异性单抗免疫荧光鉴定分离病毒,其中29株为EV71,与RT-PCR验证结果完全一致。结论：成功制备获得EV71特异性单克隆抗体,以此单抗建立的EV71特异性免疫荧光方法敏感性高、特异性强,可用于分离培养EV71的鉴定。     

EV71小鼠适应株制备及体内外感染特点

目的 用1日龄ICR小鼠传代制备EV71小鼠适应株,研究EV71亲代株与小鼠适应株的体内外感染特点,建立EV71感染ICR小鼠动物模型,为病毒疫苗和抗病毒药物的研究提供实用的动物评价工具.方法 用1日龄ICR小鼠进行EV71病毒(Fuyang-0805)的传代,得到小鼠传代株.以一定浓度亲代株和传代株病毒分别接种RD、Vero、SY5Y、Caco-2四种细胞,定量方法检测各时间点不同毒株在四种细胞上的复制数量,CCK8方法测定各时间点细胞的存活率;同时,两毒株分别腹腔注射感染1日龄小鼠,定期安乐死动物,采集肺、小肠、骨骼肌、大脑四种器官组织,进行动物体内病毒半定量和定量分析,同时进行各器官组织病理学观察、免疫组织化学鉴定.结果 与亲代毒株相比较,小鼠传代株(EV71-MMP4)表现出更强的肌肉来源细胞嗜性与毒性;同时,两毒株腹腔注射感染1日龄小鼠后,EV71-MMP4感染的小鼠体重增长较正常小鼠体重增长缓慢;半定量和定量RT-PCR显示,在小鼠肌肉中的病毒载量于感染后1 d和5 d达到高峰.EV71-MMP4感染组感染率较高、病毒组织分布较广、感染持续性较好、病毒载量较高,高剂量病毒感染后小鼠小肠、心肌和骨骼肌可观察到细胞空泡变性、淋巴细胞浸润等病理变化.免疫组织化学显示感染后小鼠骨骼肌有EV71病毒特异分布.结论 阜阳EV71小鼠适应株表现出较亲代毒株更好的小鼠易感性、细胞毒性,所建立的动物模型可用于EV71病毒致病机制、感染特点的研究和病毒疫苗及药物的评价.     

鸡流感病毒SAα-2,3 Gal和α-2,6 Gal受体分布特点及其在流感病毒生态系统中的作用

目的：探讨鸡流感病毒受体分布特点及其在流感病毒生态系统中的位置和作用。方法：应用凝集素组织化学染色技术检测鸡呼吸道和消化道流感病毒SA受体的分布,用荧光素Alexa 488标记的禽流感病毒H9N1、人流感病毒H1N1分别与鸡呼吸道、消化道各解剖部位结合。结果：鸡呼吸道均表达SA-α2,3Gal和-α2,6Gal受体,SA-α2,6Gal受体在气管、支气管和次级支气管呈高密度分布,而SA-α2,3Gal受体在呼吸道的分布以副支气管上皮细胞为主;消化道结肠上皮细胞SA-α2,3Gal受体呈弥漫分布,但SA-α2,6Gal受体仅少量分布。同时,禽流感病毒H9N1、人流感病毒H1N1均可与呼吸道和消化道上皮细胞结合。结论：鸡同时表达SA-α2,3Gal和-α2,6Gal受体,能与禽流感病毒和人流感病毒结合,有助于病毒基因重配,可充当产生人类流感大流行潜在的中间宿主。     

全肝缺血再灌注小鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体2/4的表达

目的:探讨小鼠肝脏缺血再灌注时肺泡巨噬细胞Toll样受体2/4的表达及意义.方法:24只BALB/c小鼠随机分为假手术组(n=6)和肝脏缺血再灌注组(n=18)2组,并于再灌注1 h、6 h、12 h后通过支气管肺泡灌洗获取肺泡巨噬细胞,采用荧光定量PCR及流式细胞学检测其TLR2/4 mRNA和蛋白的表达.同时检测支气管肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子α的水平、肺组织湿干重比值及髓过氧化物酶活性,并进行肺组织学评分.结果:与假手术组比较,肝脏缺血再灌注组各时点肺泡巨噬细胞Toll样受体2/4蛋白及mRNA表达均增高(P＜0.01),TLR2表达水平持续升高(P＜0.01),TLR4在6 h达到峰值(P＜0.01).肝脏缺血再灌注时,支气管肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子α的水平6 h最高(P＜0.01,肺组织湿干重比值、髓过氧化物酶含量及肺组织学评分均从1 h开始增加,并在12 h达到峰值(P＜0.01).结论:肝脏缺血再灌注后肺泡巨噬细胞表面Toll样受体2/4被激活,并参与了肺损伤的过程.     

2009年重庆地区手足口病病毒分离鉴定

目的:对2009年2～4月重庆地区流行的手足口病(Hand-food-and-mouth disease,HFMD)病原进行分离鉴定,以调查本地区HFMD流行病原学情况.方法:采集47例手足口患儿脑脊液、疱疹液、粪便、咽拭子、肛拭子共100份标本,分别接种于人横纹肌肉瘤细胞(Human rhabdomyosarcoma,RD)中进行病毒分离培养,对出现细胞病变(Cytopathic effect,CPE)的细胞上清,分别用肠道病毒通用引物、EV71属特异性引物和柯萨奇A16属特异性引物进行RT-PCR检测,并对PCR产物进行回收克隆测序鉴定,以确定本次疫情中肠道病毒(Enteroviruses,EV)的病原,将测序结果用生物学软件Bioedit同国际代表BrCr株进行序列比对及同源性相关分析,以鉴定此毒株遗传变异情况.结果:在处理后的100份HFMD患儿临床标本的细胞培养中,有7份观察到明显的细胞病变,通过RT-PCR检测有7份呈肠道通用引物阳性,EV71特异性引物检测有3份呈阳性结果,而CAl6特异性引物检测结果均为阴性,这3份EV71阳性临床标本来自2例门诊患儿和1例临床诊断疑似病例患儿,其PCR产物测序结果也证实为EV71病毒.结论:重庆地区2～4月发生的HFMD疫情主要是由EV71型引起的.     

肠道病毒71型手足口病患者外周血淋巴细胞增殖反应

目的 研究肠道病毒71型(EV71)手足口病患者外周血淋巴细胞对不同EV71抗原刺激的增殖反应. 方法 将38例研究对象分为手足口病EV71阳性重症组8例、轻症组10例、EV71阴性组10例、健康对照组10例.外周血单核细胞(PBMC)与EV71合成多肽SP1、SP2、SP3、灭活EV71和植物血凝素(PHA)分别共同孵育,加入胸腺嘧啶核苷(3H-TdR),然后收集细胞于液闪仪测定每分钟脉冲数(cpm). 结果 对不同EV71抗原的淋巴细胞增殖反应发现,以灭活病毒EV71免疫原性最强,SP2次之.EV71轻症和重症患者淋巴细胞增殖反应比较差异无统计学意义(P＞0.05),EV71阴性手足口病患者及健康对照组对EV71抗原未能显示有效的淋巴细胞增殖反应. 结论 灭活EV71免疫原性最强,感染EV71的患者淋巴细胞对EV71抗原刺激呈特异性增殖反应.     

前体mRNA可变剪接调节因子NSSR1在大肠癌中的表达

目的:研究神经系统显著表达的前体mRNA可变剪接调节因子NSSR1在大肠癌中的表达.方法:应用RT-PCR、Western blot以及免疫组织化学染色方法观测小鼠肠道等组织和人类大肠癌中NSSR1的mRNA和蛋白的表达以及分布.结果:NSSR1的mRNA在小鼠的大脑、小脑、心脏、肝脏、大肠以及肺等组织中均有表达,而蛋白只在神经系统表达,在肠道中无表达.在人体正常肠道组织中,NSSR1只在肠黏膜上皮细胞中表达;而在大肠癌细胞中,NSSR1存在显著表达且主要分布在细胞核中.结论:NSSR1在大肠癌中高表达,这可能与NSSR1在大肠癌发生发展中的生物学功能有关.     

EV71型手足口病中枢神经系统并发症急性期影像表现分析

目的分析EV71型手足口病中枢神经系统(CNS)并发症急性期MR表现,探讨其影像学特点及诊断价值。资料与方法回顾分析经实验室检测确诊为EV71型手足口病,临床诊断其伴CNS并发症的62例患儿的临床资料和影像资料,所有患儿均行头颅和/或脊髓MRI平扫及增强。结果 11例临床诊断脑膜炎者MRI均阴性;10例临床诊断为脑炎者仅1例MRI阳性,主要表现为右顶叶皮质下长T1长T2信号,伴轻度强化。41例脑干脑炎有30例MRI阳性,主要为脑桥延髓交界处长T1长T2信号;11例轻-中度强化,其中5例平扫阴性。17例脊髓炎者11例MRI阳性,9例为脊髓中央灰质长T1长T2信号、未见明显强化,(颈、胸和腰分别为4、3、2例),另2例表现为颈髓横贯性脊髓炎,均同时合并脑干。结论 EV71型手足口病CNS并发症MRI检查阳性主要是脑干脑炎,表现为稍长T1和稍长T2信号,增强MRI可发现平扫为阴性病灶,脑干脑炎可同时累及多个部位,合并颈髓横贯性脊髓炎是病情危重的征象。     

肠道病毒EV71手足口病43例临床分析

目的探讨肠道病毒EV71型手足口病临床特点和治疗。方法对2010年3月1日~6月30日在清远市人民医院经粪便检测证实为EV71病毒感染手足口病患儿的临床特点及治疗进行临床分析。结果手足口病1期15例,占34.6%,2期10例,占23.2%,3期14例,占32.5%,4期4例,占9.3%,41例手足口病患儿经过治疗,大多获得满意效果,2例因神经源性肺水肿、肺出血死亡。结论肠道病毒EV71具有明显嗜神经特性,易引起严重的中枢神经感染,如脑干脑炎,神经源性肺水肿,肺出血等危重表现,甚至死亡。     

以GFP为报告基因的重组酿酒酵母消化道转基因研究

目的以GFP为报告基因,研究重组酿酒酵母消化道途径转基因的可能。方法以6~8周龄Balb/c小鼠为实验对象,根据管饲材料不同对动物进行分组:第1组为空白对照组;第2组管饲酿酒酵母INVSc1;第3组管饲携带酿酒酵母-哺乳动物细胞穿梭载体pYES-CMV-GFP的重组酿酒酵母;每次每只Balb/c小鼠灌胃0.3 ml(108个)重组酿酒酵母悬浮液,2 d 1次,持续4周后采用免疫组织化学染色法检测小鼠小肠、肝脏、脾脏组织中GFP基因的表达。结果在第3组小鼠小肠、肝和脾组织中,有免疫组化呈阳性的检测结果,其中6只小鼠中的4只小肠组织免疫组化结果呈阳性,肝脏、脾脏分别有1只免疫组化结果呈阳性,而阴性对照组中小鼠的各组织结果均呈阴性。结论以酿酒酵母作为基因载体实现消化道途径转基因存在可能,为进一步研究酿酒酵母在基因治疗药物载体上的应用提供了实验基础。     

EV71病毒对树鼩原代肾上皮细胞感染模型的建立

目的 建立EV71对树鼩原代肾细胞的感染模型。方法 胰蛋白酶消化法获得树鼩的原代肾细胞，用EV71感染树鼩肾细胞，测定1、2、4、6和8 d培养上清病毒滴度，分别用Western blot和间接免疫荧光法检测细胞中EV71病毒VP1蛋白的表达，以确定EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性。结果 对分离得到的树鼩原代肾细胞进行传代纯化和形态鉴别，建立以树鼩原代肾细胞为主的细胞培养。用EV71病毒感染树鼩原代肾细胞，感染后48 ~ 96 h病毒滴度可达到1.3×10⁶ TCID₅₀/mL，说明EV71病毒可有效感染树鼩原代肾细胞并有效增殖。Western blot检测发现，EV71病毒VP1蛋白可在感染后2 ~ 8 d的树鼩原代肾细胞中有效检出，间接免疫荧光法则在感染后2 ~ 6 d细胞的细胞质中检测到病毒VP1蛋白的分布。结论 在成功建立树鼩原代肾细胞培养的基础上，确定了EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性和病毒增殖特性，初步建立了EV71树鼩原代肾细胞感染模型。