硒代蛋氨酸与亚硒酸钠对EV71在体内外增值的影响

目的探讨硒代蛋氨酸和亚硒酸钠抗EV71病毒感染的效果,解析硒蛋白在机体抗感染的免疫作用。方法以非洲绿猴肾细胞(VERO细胞)和ICR小鼠为研究模型,用体外细胞培养和小鼠的动物实验来探讨不同含量的硒代蛋氨酸和亚硒酸钠对EV71在VERO细胞中和ICR小鼠体内增值的抑制作用,用荧光定量PCR方法定量分析病毒载量。结果 2μmol/L和3μmol/L的硒代蛋氨酸在5d内能有效抑制EV71在VERO细胞中的增值。而用5mg/L硒代蛋氨酸饲养的小鼠产下的幼鼠经EV71感染后,肌肉组织中的EV71核酸载量也比对照组显著降低。结论硒代蛋氨酸在体外和体内都能够有效抑制EV71复制,暗示硒代蛋氨酸可能参加了机体的免疫应答抗EV71的感染。     

EV71小鼠适应株制备及体内外感染特点

目的 用1日龄ICR小鼠传代制备EV71小鼠适应株,研究EV71亲代株与小鼠适应株的体内外感染特点,建立EV71感染ICR小鼠动物模型,为病毒疫苗和抗病毒药物的研究提供实用的动物评价工具.方法 用1日龄ICR小鼠进行EV71病毒(Fuyang-0805)的传代,得到小鼠传代株.以一定浓度亲代株和传代株病毒分别接种RD、Vero、SY5Y、Caco-2四种细胞,定量方法检测各时间点不同毒株在四种细胞上的复制数量,CCK8方法测定各时间点细胞的存活率;同时,两毒株分别腹腔注射感染1日龄小鼠,定期安乐死动物,采集肺、小肠、骨骼肌、大脑四种器官组织,进行动物体内病毒半定量和定量分析,同时进行各器官组织病理学观察、免疫组织化学鉴定.结果 与亲代毒株相比较,小鼠传代株(EV71-MMP4)表现出更强的肌肉来源细胞嗜性与毒性;同时,两毒株腹腔注射感染1日龄小鼠后,EV71-MMP4感染的小鼠体重增长较正常小鼠体重增长缓慢;半定量和定量RT-PCR显示,在小鼠肌肉中的病毒载量于感染后1 d和5 d达到高峰.EV71-MMP4感染组感染率较高、病毒组织分布较广、感染持续性较好、病毒载量较高,高剂量病毒感染后小鼠小肠、心肌和骨骼肌可观察到细胞空泡变性、淋巴细胞浸润等病理变化.免疫组织化学显示感染后小鼠骨骼肌有EV71病毒特异分布.结论 阜阳EV71小鼠适应株表现出较亲代毒株更好的小鼠易感性、细胞毒性,所建立的动物模型可用于EV71病毒致病机制、感染特点的研究和病毒疫苗及药物的评价.     

肠道病毒71型（EV71）对ICR小鼠的感染

目的 研究肠道病毒71型经不同途径感染不同日龄ICR小鼠后的感染状况,了解肠道病毒71型的感染特点,为了解EV71小鼠感染机制和模型制备提供实验信息和技术支撑.方法 分别通过口腔途径、颅腔途径、肌肉途径及腹腔途径感染1日龄、7日龄及3 ～ 4周龄SPF级ICR小鼠,定期安乐动物,采集各器官组织进行病原学诊断,确定EV71病毒感染情况;同时建立一步RT-PCR、病毒分离、IFA及IEA等方法.结果 经腹腔途径感染成年鼠出现竖毛、弓背、消瘦症状,其他各途径感染小鼠感染后未见竖毛、弓背、觅食减少、体重减轻、精神呆滞及神经系统症状.颅腔注射3 ～ 4周龄ICR小鼠能在脑组织检测到病毒RNA,腹腔注射和肌肉注射1日龄乳鼠能在肌肉组织和肠道检测到病毒RNA,其中,肌肉组织病毒分离可检测到活病毒.本研究同时建立了分子生物学、血清学方法,为今后研究其它适合EV71的动物模型奠定了基础.结论 临床分离的EV71毒株通过口腔接种、颅腔、肌肉、腹腔注射途径感染1日龄、7日龄及3 ～ 4周龄SPF级ICR小鼠的疾病程度和病毒检出不同,ICR乳鼠及成年鼠可作为该病毒感染机制、病毒体内分布等基础研究,但用作EV71动物模型应用,感染程度尚不十分理想.     

利巴韦林对肠道病毒体外抑制作用的研究

目的研究抗病毒药物利巴韦林体外抗肠道病毒（EV）的效果。方法采用细胞病变效应（CPE）法和MTT分析法,观察利巴韦林对肠道病毒（EV71、CAV16、CBV3、ECH011、EV84）的抑制作用。结果利巴韦林对Vero细胞的半数毒性浓度（TC50）为2．09mg／mL,0．2mg／mL浓度的利巴韦林对5种肠道病毒均有抑制作用,对CAV16、EV71、ECHO11、EV84、CBV3的抑制率分别为13％、27％、36％、23％、58％。对EV84、EV71病毒,利巴韦林浓度为0．1mg／mL时其抑制率为16．5％、29．5％;对CBV3病毒,利巴韦林抗病毒作用与其剂量呈正相关,半数有效浓度（IC50）为0．125mg／mL,治疗指数（TI）为16．72。结论利巴韦林在体外对肠道病毒具有抑制作用,对不同的肠道病毒其抑制效率不同,对CVB3的抑制率较高。     

C4亚型人肠道病毒71型的小鼠肌肉适应株对小鼠具有致死毒力

目的 人肠道病毒71型( EV71)感染婴幼儿可导致手足口病,偶尔伴随有严重的并发症.建立EV71的小鼠模型是深入研究病毒感染的致病机制、进行疫苗和药物评价的基础.方法将EV71的临床分离株在小鼠骨骼肌中进行系列传代,得到了小鼠的肌肉适应株MP10.使用MP10经腹腔注射感染10日龄ICR小鼠,对感染小鼠的症状、病毒复制和病理进行了监测.结果 与临床分离株相比,MP10对人横纹肌瘤细胞(rhabdomyosarcoma cell,RD细胞)的感染力提高,并且对小鼠的毒力增强,MP10感染10日龄小鼠可导致其瘫痪和死亡.病毒主要在骨骼肌中复制,并引发大面积的坏死性肌炎,同时神经组织未观察到病变.病理分析发现:感染小鼠体内与呼吸运动相关的肌肉均发生严重的坏死性肌炎,推测此类肌肉的坏死会影响小鼠的呼吸功能,从而成为导致小鼠死亡的因素之一.结论 建立了C4亚型EV71毒株感染10日龄ICR小鼠的模型,该模型可作为研究EV71感染的致病机制、以及疫苗和药物评价的工具.     

2008年湖北省手足口病流行病学分析

目的分析2008年湖北省手足口病（HFMD）疫情的特点,为合理防治提供临床流行病学依据。方法对2008年湖北省17个地市州上报HFMD病例的流行病学资料进行回顾性分析;分析不同肠道病毒亚型的流行特点。结果2008年湖北省共上报HFMD病例21145例,其中重症病例12例,死亡1例。发病时间主要在5～7月份,发病年龄以0～5岁儿童为主。病原学检测提示,湖北省各地肠道病毒呈散发状态,以肠道病毒71型（EV71）感染为主（50．8％）,科萨奇病毒（Cox）A16占18．0％,其他肠道病毒占31．2％,但局部地区流行的肠道病毒不同。粪便中肠道病毒检出率（84．0％）最高,其次为咽拭子（62．0％）;而EV71在咽拭子中检出率最高（49．3％）,其次为疱疹液（39．2％）。病毒在体内存留时间在10d以上。结论2008年湖北省流行的HFMD呈散发状态,局部地区以EV71流行为主。     

红细胞锌浓度与IgG亚类在预测手足口病患儿病情中的作用

目的分析不同病毒感染类型的手足口病（HFMD）患儿红细胞锌浓度及免疫球蛋白IgG亚类的表达变化及相互关系,为患儿病情进展预测提供依据。方法选取2011年3月-2013年3月在湖北省孝感市中心医院诊治的手足口病患儿1756例作为研究对象,按病情分为3组,普通病例组（普通组）、病情加重组（加重组）及重型病例组（重症组）,检测红细胞锌浓度、血免疫球蛋白IgG亚类浓度及所感染病毒类型,分析红细胞锌浓度、血免疫球蛋白IgG亚类浓度在预测不同病毒感染类型的手足口病（HFMD）患儿病情发展中的作用。结果普通组、加重组与重型组的红细胞锌浓度分别为（117．9±61．7）／μmol／L、（93．2±40．6）μmol／L与（85．2±41．7）μmol／L,IgGl浓度分别为（5．81±1．54）g／L、（4．16±1．27）g／L与（4．02±1．13）g／L,经方差分析,差异均有统计学意义（P〈0．05）;加重组患儿,EV71组在入院时的红细胞锌、IgG1浓度分别为（113．5±51．5）μmol／L、（5．73±1．52）g／L,而病情转变为重症后,浓度分别为（85．0±36．5）μmo／／L、（3．78±1．23）g／L,经t检验,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论血浆中红细胞锌浓度和免疫球蛋白IgGl联合检测可以对EV71型病毒引起的HFMD患儿病情的进展起一定预测作用,及时检测可以发现不良预后趋势。     

不同肠道病毒感染手足口病患儿病毒载量及临床特征对比分析

目的 对比分析肠道病毒71型(EV71)与柯萨奇A组16型（CoxA16）感染手足口病（HFMD）患儿的病毒载量及临床特征。方法 收集2015年5-9月唐山市妇幼保健院儿科确诊的HFMD患儿430例,根据临床症状、体征和病毒种类将患儿分为EV71轻度组162例、EV71重度组87例、CoxA16轻度组158例、CoxA16重度组23例。采用实时荧光定量反转录PCR技术检测患儿咽拭子EV71、CoxA16 RNA,计算病毒载量;记录患儿的病程、体温、热程、口腔溃疡、流涎、咳嗽、手部出疹、足部出疹、嗜睡、惊厥、呕吐、意识改变、肢体抖动、肌痉挛情况。结果 标准曲线显示循环阈值（Ct值）与病毒载量的对数呈高度负相关(r=-1.000,P＜0.01)。Ct值（X）与病毒载量的对数（Y）的关系为Y=-0.29X+13.03。CoxA16轻度组、CoxA16重度组HFMD患儿Ct值较EV71轻度组、EV71重度组降低（P＜0.05）;EV71轻度组与EV71重度组、CoxA16轻度组与CoxA16重度组HFMD患儿Ct值比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。EV71重度组、CoxA16重度组HFMD患儿病程较EV71轻度组、CoxA16轻度组延长（P＜0.05）;EV71重度组HFMD患儿病程较CoxA16重度组延长（P＜0.05）。4组HFMD患儿体温≥38.5 ℃、口腔溃疡、流涎、手部出疹、足部出疹发生率比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）。EV71重度组、CoxA16重度组HFMD患儿热程≥3 d发生率较EV71轻度组、CoxA16轻度组升高（P＜0.007）;EV71重度组、CoxA16重度组HFMD患儿体温≥38.5 ℃+热程≥3 d发生率较EV71轻度组、CoxA16轻度组升高,EV71轻度组HFMD患儿体温≥38.5 ℃+热程≥3 d发生率较CoxA16轻度组升高,EV71重度组HFMD患儿体温≥38.5 ℃+热程≥3 d发生率较CoxA16重度组升高（P＜0.007）;CoxA16轻度组、CoxA16重度组HFMD患儿咳嗽、手部出疹数≥15个(双手)、足部出疹数≥15个(双足)发生率较EV71轻度组、EV71重度组升高（P＜0.007）。EV71重度组、CoxA16重度组HFMD患儿嗜睡、呕吐发生率较EV71轻度组升高,EV71重度组HFMD患儿嗜睡发生率较CoxA16重度组升高（P＜0.01）。结论 HFMD患儿病毒载量与感染病毒相关,但不同病情程度间病毒载量无差别。不同病毒感染及病情程度患儿间热程≥3 d、体温≥38.5 ℃+热程≥3 d、咳嗽、手部出疹数≥15个(双手)、足部出疹数≥15个(双足)、嗜睡、惊厥、呕吐、意识改变、肢体抖动、肌阵挛发生率有差异。     

通过遗传多样性小鼠筛选EV71致病相关基因

目的通过遗传多样性小鼠资源(Genetic Diversity Mice Resources)筛选肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)的致病相关基因,深入理解该病毒的致病机理,对临床诊断、治疗以及预后提供基础。方法 107copies EV71病毒经腹腔感染4～6周龄遗传多样性小鼠品系,收集血液和后肢骨骼肌样本,利用实时荧光定量PCR技术分析病毒载量,之后利用The Gene Mine系统遗传学数据库分析感染数据,筛选获得EV71致病相关基因。结果通过遗传多样性小鼠感染数据筛选到53个与EV71致病相关的基因。结论遗传多样性小鼠在模拟人群基因多样性、研究复杂性状疾病等方面具有较大的优势,是筛选致病相关基因理想的动物新资源。     

肠道病毒71感染的手足口病患儿体液免疫检濒及应用价值

目的通过测定手足口病（HFMD）患儿机体血清炎症细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-01）、白细胞介素-6（IL-6）．免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）及补体C3、C4水平,以探讨HFMD患儿体液免疫与HFMD的关系。方法收集舟山医院妇幼保健院区2010年6月-2012年12月HFMD患儿50例,其中30例肠道病毒71（EV71）感染呈阳性,20例呈阴性。另选取同期20例健康体检儿为对照。血清免疫球蛋白如IgA、IgG,IgM和补体C3、C4水平采用放射性免疫扩散法测定,血清TNF-α、IL-6采用化学发光免疫分析法进行测定。结果EV71阳性感染的HFMD患儿血清TNF-α、IL-6、IgA、IgG、IgM及补体C3、C4水平依次为（66．0±11．2）ng／L、（44．3±7．7）ng／L、（0．50±0．37）g／L、（8．09±3．55）g／L、（1．47±0．70）g／L、（0．96±0．51）g／L、（0．21±0．07）g／L,与其他肠道病毒引起HFMD相应指标水平比较,差异无统计学意义（t=0．462、0．734、0．209、0．125、0．259、0．209、0．833,均P〉0．05）,但EV71阳性感染组血清TNF—α、IL-6、IgA、IgG、IgM和补体C3、C4水平与对照组比较,差异均有统计学意义（t=20．398、19．496、4．319、2．756、2．379、2．146、3．148,均P〈0．05）,其中IgA、IgG和补体C3、C4水平较对照组明显降低,而IgM、TNF—α、IL-6则明显升高。结论EV71感染HFMD患儿的体液免疫功能紊乱．TNF—α、IL-6参与了HFMD的病理过程,可为HFMD的临床诊断、疗效观察及预后判断提供一定的理论依据。     

RNA编辑酶ADAR1对EV71感染及变异的影响

 目的 研究RNA编辑酶腺苷酸脱氨酶 (adenosine deaminase acting on RNA,ADAR1)对新型肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染及变异的影响。方法  运用RNAi技术筛选ADAR1基因沉默稳定细胞株,通过MTT分析病毒感染后细胞活力变化、噬斑形成分析病毒滴度及细胞对病毒的敏感性,以及Western blot测定病毒蛋白表达水平等,分析ADAR1对EV71感染的影响。由于ADAR1介导的RNA编辑可使基因形成A-G或T-C突变,为确定ADAR1影响EV71感染是否与其编辑EV71基因组导致病毒变异有关,对EV71流行区EV71的突变特征进行分析;并利用EV71感染ADAR1基因沉默细胞,通过对病毒基因组测序分析,研究ADAR1是否直接编辑EV71基因组。结果   ADAR1基因沉默后,与对照细胞相比,病毒感染细胞的存活率下降更快,并形成更多、更大的噬斑。病毒感染细胞中的VP1蛋白和细胞培养基上清中的病毒滴度均明显增加。EV71突变特征分析表明,虽然A-G和T-C之间的变异是病毒突变的主要类型,但EV71感染实验初步证明,ADAR1并不直接编辑EV71病毒基因组。结论ADAR1可能具有抗EV71感染的作用,但ADAR1可能并不直接编辑EV71基因组。     

肠道病毒71型微复制子的构建

目的 构建EV71非结构蛋白及EV71 3C蛋白酶微复制子体系,研究微复制子的复制及表达情况。方法 聚合酶链式反应扩增绿色荧光蛋白(EGFP),利用特定酶切位点及连接酶,将目的基因片段连接至pMD19-T载体,分别构建EV71非结构蛋白及EV71 3C蛋白酶微复制子体系。荧光显微镜下观察微复制子表达情况,实时荧光定量PCR观察微复制子复制情况。结果 EV71非结构蛋白微复制子及EV71 3C蛋白酶微复制子表达后,均可观察到特异性绿色荧光,荧光强度有明显差异;转染后12~72 h取样所测RNA含量几乎不变。结论 非结构蛋白全长及3C蛋白酶启动微复制子转录强度不同,所构建微复制子不具备复制功能,提示结构蛋白编码区对病毒RNA复制有重要意义。     

EV71病毒对树鼩原代肾上皮细胞感染模型的建立

目的 建立EV71对树鼩原代肾细胞的感染模型。方法 胰蛋白酶消化法获得树鼩的原代肾细胞，用EV71感染树鼩肾细胞，测定1、2、4、6和8 d培养上清病毒滴度，分别用Western blot和间接免疫荧光法检测细胞中EV71病毒VP1蛋白的表达，以确定EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性。结果 对分离得到的树鼩原代肾细胞进行传代纯化和形态鉴别，建立以树鼩原代肾细胞为主的细胞培养。用EV71病毒感染树鼩原代肾细胞，感染后48 ~ 96 h病毒滴度可达到1.3×10⁶ TCID₅₀/mL，说明EV71病毒可有效感染树鼩原代肾细胞并有效增殖。Western blot检测发现，EV71病毒VP1蛋白可在感染后2 ~ 8 d的树鼩原代肾细胞中有效检出，间接免疫荧光法则在感染后2 ~ 6 d细胞的细胞质中检测到病毒VP1蛋白的分布。结论 在成功建立树鼩原代肾细胞培养的基础上，确定了EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性和病毒增殖特性，初步建立了EV71树鼩原代肾细胞感染模型。     

SCARB2蛋白提高人肠道病毒71型对转基因小鼠的感染力

目的 细胞实验证实人清道夫受体B2（hSCARB2）是人类EV71的受体,本研究拟通过建立人SCARB2转基因小鼠,建立感染能力更高的小鼠模型.方法 构建CMV启动子的SCARB2转基因表达载体,通过显微注射法建立C57BL/6J背景的人SCARB2转基因小鼠,PCR筛选阳性首建鼠.通过Western Blot和免疫组化检测目的 蛋白在各组织中的表达.EV71感染转基因小鼠后,通过实时荧光定量PCR和免疫组化检测目的 蛋白表达对病毒感染的促进效果.结果 人SCARB2蛋白主要在转基因小鼠的骨骼肌和脑组织中表达,与野生型小鼠相比,转基因小鼠组织中的病毒载量显著提高4到5倍.结论 人SCARB2的体内表达可促进EV71对转基因小鼠的感染,该蛋白在体内具有EV71受体功能.     

实时荧光定量PCR技术在手足口病检测中的应用

目的探讨实时荧光定量PCR技术在手足口病检测中的应用。方法选择本溪市疾病预防控制中心2018年2月～2019年6月收治的120例手足口病患儿作为研究对象,根据检测方法不同分为对照组和观察组。对照组利用常规PCR技术检测手足口病组,实时荧光定量PCR技术检测手足口病为观察组。比较两组的检出肠道病毒分型EV、EV71、CoxA16阳性率,特异性和灵敏度。结果采用实时荧光定量PCR技术与常规PCR技术检测手足口病肠道病毒分型EV、EV71、CoxA16的阳性率及两组特异性和灵敏度相比,观察组检测阳性率为66.67%,明显高于对照组检测阳性率的21.67%,观察组检出阳性率高于对照组,两组均有特异性,观察组灵敏度优于对照组,对照组最低检测限均为4.11×10~3cfu/mL。而观察组均为4.11×10~2cfu/mL。结论荧光定量PCR技术在检测肠道病毒中不仅具有特异性高,还具有灵敏度高、检测时间快的特点,有助于更快诊断手足口病,更好的服务于临床。     

EV71临床毒株分离及其VP1单克隆抗体制备

目的 对手足口病肠道病毒71型 (EV71) 流行临床株进行分型和鉴定,制备抗EV71外壳蛋白VP1的特异性单克隆抗体,为EV71生物学特征研究和疫苗株的筛选奠定基础。方法 从患者咽拭子中分离出流行的EV71毒株,原核表达纯化该毒株EV71 VP1衣壳蛋白,以此蛋白为免疫原制备VP1的特异性小鼠单克隆抗体,采用免疫荧光法（ELISA）观察抗体能否特异性识别EV71感染的细胞。结果 测序结果显示分离出的EV71病毒株为肠道病毒C4亚型。筛查出12株分泌针对VP1蛋白的抗体杂交瘤细胞株,将其中结合特异性和结合力最强的一株命名为11T12。复苏的11T12活化后接种于液体石蜡免疫的小鼠腹腔,收集腹水经过protein-G柱纯化后对抗体的效价进行ELISA评价,结果显示纯化抗体稀释10万倍后仍可以结合蛋白,证实成功制备了抗EV71 C4亚型外壳蛋白VP1单克隆抗体。抗体结合特征分析结果显示该抗体具有特异性识别能力。结论 从感染的临床样本中分离到一株C4型EV71毒株,以该病毒VP1蛋白为免疫原获得一株相应的单克隆抗体11T12,该单克隆抗体的获得为病毒的检测、试剂盒的研发提供了核心材料。     

不同免疫方案制备肠道病毒71型抗血清的免疫效果比较

目的比较不同免疫方案制备肠道病毒71型(EV71)抗血清的免疫效果,选择最佳免疫方案。方法制备EV71,并对病毒进行滴定和灭活。将BALB/c鼠随机分为5组,每组9只。1、2组以灭活病毒免疫,3、4组以活病毒免疫,1、3组的免疫间隔时间为2周,2、4组为3周,第5组为对照组,用磷酸盐缓冲液(PBS)免疫,免疫间隔2周。免疫4次后用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组小鼠血清抗体滴度。结果 4个实验组均产生阳性抗体(A/A0≥2.1),对照组抗体阴性(A/A0<2.1),1～5组吸光度值依次为1.081 7±0.289 7、1.029 6±0.3719、1.074 8±0.374 9、1.492 9±0.215 9、0.168 7±0.021 8。对其进行单因素方差分析,F=23.449,P<0.05,差异有统计学意义,LSD-t检验结果,第4组与1、2、3组差异均有统计学意义(P<0.05),而1、2、3组两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论各组抗体滴度不完全相同,其中第4组即活病毒间隔3周免疫组抗体滴度最高,所以活病毒间隔3周免疫方案可作为制得高滴度EV71抗血清的理想选择。