重症手足口病患者气管插管吸出液中肠道病毒71型的分离与鉴定

目的分离鉴定重症手足口病患者气管插管吸出液标本的EV71病毒株。方法将采集的标本过滤除菌接种于MA104细胞,出现细胞病变效应(CPE)后提取培养上清液中的RNA,用国家标准检测引物进行RT-PCR鉴定;用特异性引物进行PCR获得VP1全序列,测序后以MEGA4软件与各血清型代表株VP1序列进行分析并构建分子进化树。结果接种标本3 d后细胞出现CPE,经RT-PCR鉴定为EV71,对其VP1全序列进行测定分析后,确定其为C4亚型,并绘制了分子进化树。结论手足口病患者下呼吸道分泌物EV71的分离鉴定,为手足口病肺损伤发病机制的研究提供了依据。     

HCMV感染动物胃肠组织损伤实验研究

目的 探讨HCMV感染是否引起大鼠和家兔胃肠组织损伤。方法 将人巨细胞病毒(Human Cyto—megalovirus，HCMV)AD168毒株静脉接种大鼠和新西兰兔，大鼠90d、兔30d后，检查动物胃、肠组织的病理变化，用免疫组化方法和原位杂交方法检查组织中的病毒抗原和DNA片段。结果 接种病毒之部分动物出现食量减少、粘液性大便，胃粘膜组织可见淋巴细胞浸润，肠粘膜变性坏死，甚至有穿孔灶；在粘膜细胞中查到病毒抗原或DNA片段。结论 HCMV感染可以侵犯动物胃肠组织并引起该组织病理损伤。     

黄酮溶液用于烧伤抗渗出作用的实验和临床研究

目的 :研究黄酮提取物治疗烧伤的应用价值 ;方法 :将黄酮提取物制成水溶液 ,通过动物渗出模型和临床试验 ,研究该药物在动物的抗渗出作用和临床治疗小面积浅Ⅱ度、深Ⅱ度烧伤的疗效 ;结果 :动物实验结果显示 ,应用黄酮溶液保护的动物腹腔渗出和足肿胀度明显减轻 ,与正常对照组比较具有显著性差异 (P <0 0 1) ,临床试验结果表明该药物可以使Ⅱ度烧伤患者在用药当日渗出明显减轻 (水泡萎缩 ) ,与对照药物比较愈合时间提前 2 66d(P <0 0 1) ;结论 :该药物具有显著抗渗出作用。     

致敏绵羊红细胞在EV71细胞嗜性研究中的应用

目的    以致敏绵羊红细胞为工具研究肠道病毒71型（EV71）的细胞嗜性,并探讨传代培养细胞表面EV71受体表达情况。方法    EV71致敏的绵羊红细胞与传代培养细胞作用,观察不同方法处理的培养细胞吸附致敏绵羊红细胞的情况,分析EV71的细胞嗜性,并探讨培养细胞表面EV71受体的表达情况。结果     EV71致敏绵羊红细胞能吸附在人喉癌上皮细胞（Hep-2）、恒河猴胚肾细胞（MA104）的细胞表面,并且胰酶能破坏MA104的吸附功能,对Hep-2却无影响,而狗肾细胞（MDCK）与EV71致敏的绵羊红细胞未见吸附现象,这与病毒直接感染细胞结果一致。结论    该方法能直接、有效地反映病毒的细胞嗜性及培养细胞表面病毒受体的表达情况,在病毒学尤其是病毒受体研究中具有较强的可行性及应用价值。     

制备肠道病毒71型黏膜疫苗的初步探索

目的利用同源重组技术将肠道病毒71型衣壳蛋白VP1基因重组入枯草芽胞杆菌基因组,进而将VP1蛋白展示在其芽胞表面制备EV71黏膜疫苗。方法将枯草芽胞杆菌CotB基因与VP1基因连接后插入整合质粒pDG1662,得到重组质粒pDG1662-CotB-VP1,电转化法转化枯草芽胞杆菌1A771,抗生素抗性筛选,PCR、Westernblot、免疫荧光鉴定VP1基因重组及蛋白表达情况。结果 VP1基因成功重组入枯草芽胞杆菌基因组中,VP1蛋白在芽胞表面得到了有效表达。结论 EV71衣壳蛋白在枯草芽胞杆菌芽胞表面得到了有效表达,为研究EV71黏膜疫苗奠定基础。     

轮状病毒VP4蛋白酶切片段VP5*、VP8*在原核系统中的表达

目的克隆表达轮状病毒结构蛋白VP4酶切片段VP5＊、VP8＊。方法以猴轮状病毒SA11株细胞培养物提取总RNA为模板,经RT—PCR方法获得VP5＊、VP8＊全长基因片段cDNA,将其重组于pET-30a表达载体,转化大肠杆菌BL21（plyss）,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,表达产物做SDS—PAGE和Western—blotting检测,目的产物用镍柱纯化。结果①重组载体在IPTG诱导下,工程菌表达的两个目的蛋白主要以包涵体形式存在;②SDS—PAGE检测表达产物与目的蛋白大小一致,VP5＊为60kD,VP8＊为28kD,Western—blotting检测发现两目的蛋白所带标签可与抗体反应;③镍柱纯化获得RVSA11VP5＊、VP8＊蛋白,纯度达90％。结论①构建表达载体pET-30a—VP5＊、pET-30a—VP8。;②表达、纯化VP4蛋白的VP5＊、VP8＊片段。     

肠道病毒71型结构蛋白VP1的原核表达及初步鉴定

目的利用大肠杆菌表达系统表达EV71 VP1蛋白并对其抗原性进行初步鉴定;为EV71疫苗研制奠定基础。方法采用PCR扩增EV71 VP1基因2-274aa片段,并将其插入表达载体pET30a（＋）,转化Transetta（DE3）菌株,SDS-PAGE和Western Blot初步分析蛋白表达及抗原性;探讨目的蛋白的最佳表达条件。结果获得相对分子质量约为30 kD的融合蛋白,Western Blot证实其抗原性良好;该蛋白的最佳表达条件是37℃、1.0 mmol/L IPTG、诱导表达4 h。结论表达并鉴定了EV71 VP1抗原;本研究为EV71疫苗研制及检测试剂盒的建立奠定了基础。     

不同毒力EV71济南分离株全基因组序列比较分析

目的研究EV71济南分离株的基因特点,寻找潜存的EV7l毒力决定位点。方法将6株EV71济南分离株（JN200803、JN200804、Jinanl002、Jinanl004、Jinan1005和Jinan1006株）分别接种1d龄BALB／c小鼠,确定其对小鼠的致病性程度。对6株EV71全基因组核苷酸、氨基酸序列进行比较,对非编码区进行RNA二级结构的预测和分析,对VPl区进行遗传进化分析。结果通过动物实验可将6株EV71济南分离株分为强、中、弱毒力株。小鼠感染强毒株（JN200804、Jinan1002、Jinanl004、Jinanl005株）的主要症状为后肢麻痹并死亡,感染弱毒株（Jinanl006株）的主要症状为后肢麻痹但能自愈,感染无毒株（JN200803株）未引起明显症状。不同毒力EV71分离株全基因组序列比对发现,共有40个核苷酸位点的差异,导致编码区8个氨基酸突变,其中第937位氨基酸（位于2A片段）在强毒株、弱毒株和无毒株间发生了连续突变（937aa：S→C→G）。非编码区RNA二级结构预测表明,5’UTR第115位核苷酸突变对内部核糖体进入位点（IRES）的结构有较大影响。遗传进化分析显示,与同内2003年以后的流行毒株相同,6株EV71济南分离株均属C4亚型的C4a进化分支。结论全基因组序列比较分析发现不同毒力EV71济南分离株之间存在差异位点,为采用反向遗传学方法鉴定EV71毒力决定位点奠定了基础。     

轮状病毒外壳蛋白VP4在大肠埃希菌中的表达

目的 克隆表达轮状病毒融合素蛋白VP4.方法 以轮状病毒SA11株细胞培养物提取总RNA为模板,经RT-PCR获得VP4全长基因片段cDNA,将其重组于pET-30a(+)表达载体,转化大肠埃希菌BL21(plysS),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,并用镍柱纯化.结果 重组载体所含目的基因片段的序列与文献公布序列相符,IPTG诱导表达的目的蛋白主要以包涵体形式存在;SDS-PAGE检测表达产物与目的蛋白大小一致,为88 kD,Western blot检测发现目的蛋白所带组氨酸标签可与标签抗体反应;镍柱纯化获得RV SA11 VP4融合素蛋白,纯度达90%.结论 构建了表达载体pET-30a(+)-VP4,经诱导表达、纯化,获得了RV融合素蛋白VP4.