腺病毒介导的反义VEGF165对人皮肤恶性黑色素瘤细胞生长的影响

目的:用腺病毒介导的反义VEGF165(Ad-aVEGF165)转染人血管内皮细胞系(ECV304)和人皮肤恶性黑色素瘤细胞系(A375)后,观察Ad-aVEGF165对这两细胞系体外生长的影响.方法:用感染复数为100的Ad-aVEGF165分别转染上述细胞,测定其生长曲线(MTT法)、细胞周期、VEGF基因的表达.结果:转染Ad-aVEGF165基因的A375细胞上清能够抑制ECV304细胞的生长,其增殖指数下降.Ad-aVEGF165对A375细胞的生长、增殖指数无明显影响,但是它能抑制A375细胞VEGF的表达.结论:①ECV304细胞不表达VEGF,Ad-VEGF 165对ECV304细胞无直接影响,必须要经过A375细胞介导才能抑制ECV304细胞的生长;②在体外,Ad-aVEGF165不能直接抑制A375细胞的生长,但能抑制A375细胞分泌VEGF.     

survivin基因启动子的克隆及其在人喉癌Hep-2细胞中的特异性表达

目的:构建survivin启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,利用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)检测该启动子在Hep-2细胞中的特异表达活性。方法:PCR扩增survivin启动子,置换pShuttle载体中的CMV启动子,构建质粒pSurp;分别双酶切pShuttle、pSurp和pEGFP-C1载体,构建分别携带survivin启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体pCMV-EGFP和pSurp-EGFP;脂质体法转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果:成功扩增survivin基因启动子,构建了survivin基因启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,用其转染两种细胞后,荧光显微镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞没有表达。结论:成功克隆survivin启动子,其在Hep-2细胞具有较强的肿瘤特异性启动活性,为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础。     

survivin基因启动子驱动的肿瘤特异性腺病毒载体的构建

目的:构建肿瘤特异性启动子驱动的腺病毒载体,检测survivin基因启动子在喉癌细胞中的特异表达活性。方法:PCR扩增survivin启动子,构建分别携带survivin启动子和CMV启动子的真核表达载体pCMV-EGFP和pSurp-EGFP,体外连接法制备重组腺病毒Ad-SP-EGFP和Ad-CMV-EGFP,后转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP表达。结果:成功构建survivin基因启动子的腺病毒载体;Ad-SP-EGFP转染后荧光镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞无表达。结论:成功制备肿瘤特异性survivin启动子驱动的腺病毒,为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础。     

hTERT及CMV双调控TK基因靶向杀灭鼻咽癌细胞的实验研究

目的 探讨hTERT启动子及CMV增强子双调控表达载体调控TK基因靶向杀灭鼻咽癌细胞的效应.方法 将双调控增强型载体及hTERT单启动子载体(作为对照组)分别转染两种端粒酶(+)的人鼻咽癌5-8F细胞及对照组人乳腺癌MCF-7细胞及端粒酶(-)的正常人血管内皮ECV细胞,Stretch PCR法验证5-8F细胞、MCF-7细胞及ECV细胞中端粒酶活性,荧光显微镜下观察TK基因绿色荧光蛋白表达差异,MTT法分析杀灭鼻咽癌细胞的效果.结果 ①Stretch PCR法验证人鼻咽癌细胞5-8F、人乳腺癌细胞MCF-7端粒酶活性星阳性,人血管内皮ECV细胞端粒酶活性呈阴性.②增强型表达栽体转染上述两种端粒酶(+)肿瘤细胞均有很强的荧光表达及TK基因的mRNA表达,单启动子亦有较强的荧光表达,但比增强型表达载体要弱,而ECV细胞几乎无绿色荧光.③加入GCV后,增强型表达载体对两种端粒酶(+)肿瘤细胞体外增殖均有明显抑制作用,且均高于单启动子组、空载体组及空白对照组,而增强型表达载体转染ECV细胞体外增殖无明显抑制作用.结论 以hTERT启动子及CMV增强子双调控TK基因的表达载体能够靶向杀灭鼻咽癌细胞,且作用明显强于单启动子载体组.这种新型高效、靶向增强型载体有可能成为一种鼻咽癌临床靶向基因治疗的新策略.     

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外靶向性转染心肌细胞

目的:构建以鼠心肌轻链蛋白基因(mlc-2v)为启动子、携带人血管内皮生长因子hVEGF165基因的重组腺病毒载体,检测该重组腺病毒载体对心肌细胞转染的靶向性.方法:酶切腺病毒载体PDC315自身启动子CMV,构建腺病毒载体PDC317,分别接入hVEGF165、mlc-2v基因,构建腺病毒载体PDC-mlc-hVEGF165.鉴定正确后,将PDC-mlc-hVEGF165与Lipofectamine共转染至293细胞,经同源重组获得以mlc-2v为启动子、携带hVEGF165基因的重组腺病毒Ad-mlc-hVEGF165,同步构建无靶向性的重组腺病毒Ad-hVEGF165.扩增并测定滴度后,Ad-hVEGF165、Ad-mlc-hVEGF165分别转染体外培养的心肌细胞、骨骼肌细胞及平滑肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测Ad-mlc-hVEGF165转染心肌细胞的靶向性.结果:构建的病毒正确,病毒滴度为2.8×109 pfu/ml.转染3 d后,Ad-hVEGF165组在各培养细胞的上清液及细胞内均检测到VEGF的表达,而Ad-mlc-hVEGF165组仅在心肌细胞中有VEGF的表达,且Ad-mlc-hVEGF165组心肌细胞分泌的VEGF要少于Ad-hVEGF165组.结论:成功构建了以mlc-2v为启动子、携带人VEGF基因的重组腺病毒Ad-mlc-hVEGF165;该重组载体能体外靶向性转染心肌细胞并使之表达VEGF.     

survivin启动子的克隆及在HeLa细胞中控制GFP特异性表达

目的: 扩增survivin基因启动子并构建带有survivin启动子的pEGFP-N1真核表达载体 ,检测survivin基因启动子在HeLa细胞中的特异表达活性.方法: ①以HeLa细胞基因组DNA为模板,PCR 扩增survivin启动子,回收扩增产物并插入pGEM-TEasy载体(T/Surp),测序鉴定.②分别双酶切 T/Surp载体和不含CMV启动子的pEGFP-N1载体,回收survivin启动子酶切片段及pEGFP-N1酶切线性化片段,连接回收产物构建携带survivin启动子pEGFP-N1真核表达载体(pEGFP-N1/ Surp),酶切鉴定 .③转染HeLa细胞及正常血管内皮细胞ECV304,在荧光显微镜下观察GFP的表达.结果: 酶切及测序证实成功扩增survivin基因启动子,并构建了携带有survivin基因启动子的pEGFP-N1真核表达载体.转染HeLa细胞和正常血管内皮细胞ECV304,在荧光显微镜下见HeLa细胞发出较强的绿色荧光,而在ECV304细胞未见绿色荧光. 结论: 成功克隆的肿瘤特异性survivin启动子在HeLa细胞具有较强的肿瘤特异性启动活性,为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础.     

增强型自杀基因载体治疗宫颈癌的体外实验研究

目的探讨运用增强子增强hTERT启动子转录活性后，调控双自杀融合基因CDTK载体对人宫颈癌HeLa细胞的体外杀伤作用。方法将SV40增强子、CMV增强子、CMV增强子／启动子及SV40-CMV双增强子分别与hTERT启动子组合构建成报告基因载体。转染HeLa细胞后用双荧光素酶系统分析其活性差异；然后构建pHr—SCT／CDTKG治疗载体转染HeLa细胞，用流式细胞仅检测转染效率，RT-PCR检测融合自杀基因mRNA表达，HPLC检测5-Fu浓度，MTT分析载体杀瘤的效果。结果HeLa细胞中增强子能使hTERT启动子活性提高6-13倍，其中SV40-CMV双增强子／hTERT启动子的活性最高，达到CMV增强子／启动子的近3倍；体外转染pHr—SCT／CDTKG后可检测到cDTK的mRNA的表达；细胞上清中5-Fu最高浓度为50．83ug／mL；当5-FC浓度为200ug／mL、GCV浓度为10ug／mL时，HeLa细胞的相对细胞存活率为48．7％。结论SV40-CMV双增强子联合hTERT启动子能高效靶向的调控CDTK融合自杀基因杀伤宫颈癌细胞，因而是一种很有前景的基因治疗宫颈癌的策略。     

人血管内皮细胞生长因子165重组腺病毒的构建及其在真核细胞中的表达

目的:体外构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的腺病毒表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达。方法:从重组质粒pcDNA3/hVEGF165中获得hVEGF165,经酶切及测序鉴定,将hVEGF165基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,重组穿梭质粒经酶切线性化后,与pAEdasyl质粒在大肠杆菌BSJ183中进行同源重组,线性化后转染HEK293细胞进行包装扩增获取重组病毒上清,同时应用RT-PCR及ELISA法检测hVEGF165的表达。结果:目的基因的测序结果与人VEGF165序列(Genbank)相符。转染后经RT-PCR和ELISA检测证实转染重组质粒组hVEGF165 mRNA及蛋白表达,而转染空质粒组及未转染组没有检测到hVEGF165的表达。结论:本研究构建了人VEGF165重组腺病毒表达载体pAd-hVEGF165,并能成功地在HEK293细胞中表达。     

Resistin基因对TNF-α诱导血管内皮细胞ICAM-1表达的影响

目的:研究抵抗素(resistin)基因对TNF-α诱导血管内皮细胞ECV304表达细胞闻黏附分子1(ICAM-1)的影响.方法:应用分子生物学技术,将resistin基因克隆到载体pEGFP-C1中构建质粒pEG/Resi,脂质体转染ECV304,转染6 h加入20 μg/L TNF-α诱导.用RT-PCR方法分别检测转染18、30、42和54h时resistin和ICAM-1 mRNA表达;同时用免疫印迹法检测resistin蛋白的表达,并用ELISA方法检测各期ECV304上清ICAM-1蛋白表达.结果:经酶切鉴定和测序证实质粒pEG/Resi构建成功并可在ECV304中表达;相同TNF-α诱导条件下转染resistin基因组的ICAM-1表达水平始终高于未转染组,在resistin基因表达高峰(30和42 h)ICAM-1 mRNA和蛋白表达量较未转染组均显著升高(P＜0.05);且ICAM-1 mRNA和蛋白表达水平均随resistin基因表达量的增加而升高.结论:Resistin基因能够增强TNF-α诱导ECV304细胞表达ICAM-1.     

VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的表达及活性测定

目的探讨人血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因修饰的兔骨髓基质细胞对VEGF基因的表达及表达产物的生物学活性.方法制备真核表达质粒pAdCMV-VEGF165,以Superfect转染试剂介导VEGF基因转染兔骨髓基质细胞,收获转染后24h至6d的转染上清和细胞,采用RT-PCR技术、免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VEGF165基因的转录及表达,用血管内皮细胞增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性.结果VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效转录VEGF165,其分泌于培养上清中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖,具有很强的生物活性.结论VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效表达具有生物活性的VEGF.     

CMV启动子调控的VEGF-shRNA表达载体的构建及有效干扰序列的筛选

目的:构建针对人VEGF基因的小干扰RNA(siRNA)的表达载体,实现CMV启动子调控,转染肿瘤细胞后观察其对VEGF基因的干扰作用,并筛选出有效的VEGF-shRNA.方法:设计三对VEGF靶向的发夹状shRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入质粒pDC311-SV40-RC中,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人骨肉瘤细胞U-2 OS,分别培养3d和7d后收集细胞培养上清液,ELISA检测上清中VEGF蛋白的表达.结果:将针对VEGF基因的siRNA的双链寡核苷酸片段成功克隆到pDC311-SV40-RC载体,经过阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确;转染U-2 OS细胞后,ELISA方法检测蛋白表达水平证实干扰序列3能有效降低VEGF的表达.结论:成功构建了CMV启动子调控的针对VEGF基因的siRNA载体,转染肿瘤细胞后可抑制VEGF的表达,并筛选出有效的干扰序列.     

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外转染心肌细胞的研究

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)基因的重组腺病毒载体,并转染体外培养的心肌细胞,检测VEGF的表达.方法:将人源性的VEGF165cDNA正向插入到腺病毒载体PDC315,构建重组质粒,通过脂质体共转染293细胞,经同源重组获得携带人VEGF165基因的重组腺病毒,通过PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒,扩增并测定滴度后,体外转染培养的心肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测VEGF在心肌细胞中的表达.结果:人VEGF165cDNA成功地正向插入到PDC315载体中,以重组病毒基因组DNA为模板,同时扩增出了610bp的VEGF165cDNA基因片段,证实了所构建病毒的正确性,病毒滴度为2.8×108 pfu/ml,Ad VEGF165体外转染心肌细胞3 d后,在培养细胞的上清液及细胞内检测到了VEGF的表达.结论:成功构建了表达人VEGF 165基因的腺病毒载体,体外转染心肌细胞后能够满意表达VEGF,为基因治疗心肌缺血奠定基础.     

VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的表达及活性测定

目的 探讨人血管内皮细胞生长因子(VECF)基因修饰的免骨髓基质细胞对VEGF基因的表达及表达产物的生物学活性。方法 制备真核表达质粒pAdCMV-VEGF165,以Superfect转染试剂介导VFGF基因转染兔骨髓基质细胞,收获转染后24h至6d的转染上清和细胞,采用RT-PCR技术、免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VECF165基因的转录及表达,用血管内皮细胞增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性。结果 VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效转录VEGF165,其分泌于培养上清中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖,具有很强的生物活性。结论 VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效表达具有生物活性的VEGF。     

抗人血管内皮生长因子发夹状核酶对人脐静脉内皮细胞ECV304的影响

目的观察抗人血管内皮生长因子（VEGF）发夹状核酶对人脐静脉内皮细胞ECV304生物学特性的影响。方法将抗人VEGF发夹状核酶（RZ）基因构建的pcDNA3.1＋/RZ转染ECV304细胞,经G418筛选后,用RT-PCR法鉴定RZ基因在ECV304细胞中的转录,用MTT法和流式细胞仪检测转染前后ECV304细胞增殖活力和细胞周期,ELISA法检测细胞上清VEGF的表达水平。结果RZ基因在ECV304细胞中获得转录,它不改变细胞增殖活力和细胞周期,但能明显下调VEGF的表达。结论抗人VEGF发夹状核酶能够显著抑制ECV304细胞VEGF的表达,为进一步开展核酶的肿瘤基因治疗提供了实验依据。     

反义VEGF165真核表达载体的构建和表达

目的 进行抗血管生成治疗人脑胶质瘤实验,构建和鉴定携带人反义VEGF165基因的真核表达载体。方法 将VEGF165cDNA反向克隆入pcDNA3,构建CMV启动子控制的真核表达载体pcDNA-AVEGF165,用酶切鉴定结果;应用该载体转染人脑胶质瘤细胞SHG44,G418筛选阳性克隆;Western blot和免疫组化检测转染前、后瘤细胞的VEGF表达。检测转染前、后瘤细胞的生物学性状。结果 获得反向构建的pcDNA-AVECF165真核表达载体,VEGF165反义RNA阻断了SHG44细胞的VEGF表达,该细胞生物学性状不受外源基因的表达影响。结论 成功构建的反义VEGF165真核表达载体,为人脑胶质瘤的反义基因治疗提供了必要的条件。     

VEGF165-tPA双基因真核表达载体的构建和体外表达

目的构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)双基因的新型真核表达载体pIRES-VEGF165-tPA,并通过转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,验证载体的体外表达情况。方法将目的基因片段VEGF165和tPA插入到真核表达载体pIRES质粒中,体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,通过实时荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测mRNA和蛋白水平的表达。结果成功构建pIRES-VEGF165-tPA双基因真核表达载体,测序结果与预期相符;荧光计数显示体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞的转染效率约为(15.6±3.1)%;实时荧光定量RT-PCR和Western blot证实转染pIRES-VEGF165-tPA质粒组细胞在mRNA和蛋白水平的表达均高于各对照组(均P<0.01)。结论成功构建pIRES-VEGF165-tPA双基因真核表达载体,并且实现其在人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞中的表达,为进一步探索其在机械瓣膜抗凝方面的作用奠定了基础。     

VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的表达及与活性测定

目的：探讨人血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因修饰的兔骨髓基质细胞对VEGF基因的表达及表达产物的生物学活性。方法：制备真核表达质粒pAdCMV-VEGF165,以Superfect转染试剂介导VEGF基因转染兔骨髓基质细胞，收获转染后24h至6d的转染上清和细胞，采用RT－PCR技术，免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VEGF165基因的转录及表达，用血管内皮细胞增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性。结果：VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效转录VEGF165，其分泌于培养上清中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖，具有很强的生物活性。结论：VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效表达具有生物活性的VEGF。     

新型非病毒载体介导融合自杀基因靶向治疗胃癌的实验研究

目的 构建靶向性基因治疗载体pcDNA3.1(-)CVyCDglyTK,并以新型磷酸钙纳米为基因治疗载体,研究该基因治疗体系在胃癌细胞中体外与体内专一性表达和杀伤作用.方法 采用PCR、RT-PCR、融合PCK、酶切及连接等技术构建由CEA启动子、CMV增强子驱动的融合自杀基因pcDNA3.1(-)CVyCDglyTK表达栽体和融合自杀基因pcDNA3.1(-)CMVyCDglyTK表达栽体.以磷酸钙纳米为栽体分别转染CEA阳性的人胃癌细胞株SGC7901细胞和CEA阴性的Hela细胞.采用RT-PCR、免疫荧光法检测感染细胞中yCDglyTK基因的表达,并在体外观测其对胃癌细胞的作用.结果 SGC7901细胞在感染以上两种质粒表达栽体后均有yCDgtyTK mRNA表达,Hela细胞在转染纳米-pcDNA3.1(-)CMVyCDglyTK复合物后有yCDglyTK mRNA表达,对5-FC的敏感性增强,而在转染纳米-pcDNA3.1(-)CVyCDglyTK复合物后则没有yCDglyTK mRNA表达,5-FC对其亦无杀伤作用.在体外实验中,经纳米转染pcDNA3.1(-)CVyCDglyTK筛选的阳性克隆组细胞存活率为8.0%,纳米-pcDNA3.1(-)CVyCDglyTK转染组为25.4%,而对照组的细胞存活率为99.0%.结论 本实验构建的由CEA启动子、CMV增强子驱动的融合自杀基因yCDglyTK靶向性基因治疗载体,能使融合自杀基因在CEA阳性的胃癌细胞中专一性表达,从而达到靶向治疗胃癌的目的.     

HIV-1 Tat真核表达载体的构建及在内皮细胞的表达

目的:构建HIV-1 Tat真核表达质粒,为研究Tat在HIV-1致病机制中的作用奠定实验基础。方法:以pCV1(tat and rev)质粒为模板,用PCR方法扩增HIV-1 Tat基因,克隆至p cDNA3.1( )表达载体,酶切及测序鉴定重组体。重组质粒转染ECV304细胞,用RT-PCR、转染HIV-1 LTR荧光报告基因的方法检测tat基因的表达及活性。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建pcDNA3.1( )-Tat重组质粒。重组体转染ECV304细胞,建立稳定表达细胞株,应用RT-PCR可检测到Tat基因mRNA的表达;荧光仪检测Tat蛋白可明显促进荧光素酶在ECV304细胞内的表达。结论:成功构建HIV-1Tat真核表达载体,并建立了HIV-1 Tat内皮细胞稳定表达细胞株。     

MEK转染的内皮细胞表达人内皮细胞特异性分子-1的初步研究

目的人内皮细胞特异性分子-1(Human endocellular-specific molecule-1, ESM-1)表达载体的构建及其体外表达,表达产物的纯化及多克隆抗体和单克隆抗体的制备.重组MEK基因的真核转染,转染的内皮细胞中ESM-1的表达. 方法用PCR方法扩增ESM-1的基因片段,扩增产物与T-Vector连接,构建克隆载体pGEM-T- ESM-1.在宿主菌中扩增重组质粒,提取质粒并进行酶切纯化,将目的基因插入pET-28b中构建成表达载体,再次转化入大肠杆菌XL1-blue,蓝白选择、耐药性标记粗筛并挑取阳性克隆,经限制性内切酶酶谱分析、DNA序列分析两种方法鉴定.然后提取质粒,转化入大肠杆菌BL-21,用IPTG诱导表达.表达产物行SDS-PAGE,割下所需条带,用电洗脱方法纯化得到所需目的蛋白.免疫新西兰纯种大白兔,制备多抗,并用免疫双扩散法测定抗体效价;免疫BALB/C小鼠,制备抗人ESM-1的单克隆抗体.用重组MEK( )基因转染人脐静脉内皮细胞ECV304,加以鉴定,并检测转染细胞中ESM-1表达的改变. 结果经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证明所构建质粒为pET-28b-ESM-1重组质粒,SDS-PAGE证实获得的融合蛋白分子量为24 ku,表达量约占菌体总蛋白的24%.所得多抗效价为1:16(免疫双扩散),单抗效价为1:6000(ELISA).重组MEK基因转染成功,用Western blot和免疫荧光的方法检测显示,转染不同活性型重组MEK基因的ECV304其ERK-2的表达量不同, ESM-1的表达量在转染不同活性型重组MEK基因的细胞中也不同,都是转染高活性型的细胞中表达量最高,转染野生型的细胞中次之,未转染的ECV304中表达最少. 结论成功获得ESM-1的表达载体, 并在大肠杆菌中获得表达,成功制备了抗ESM-1的多克隆抗体和单克隆抗体.在转染了不同活性型重组MEK基因的ECV304细胞中,ESM-1的表达量有改变,在转染高活性型重组MEK基因的细胞中表达量最高,转染野生型重组MEK基因的细胞次之,未转染的ECV304中ESM-1的表达量最少.说明ESM-1可能是MAPK信号转导通路上的一个重要的成分,并在肿瘤转移以及肿瘤血管生成中发挥作用.