冠心病与肺炎衣原体感染及C反应蛋白的关系研究

目的 探讨肺炎衣原体（Cpn）感染与冠心病（CHD）、冠脉狭窄程度及C反应蛋白（CRP）的关系。方法 选择冠状动脉造影（CAG）确诊的冠心病患者和健康者为研究对象,用ELISA检测样本Cpn特异性IgG及IgM抗体。应用乳胶凝集法检测CRP。结果 冠脉轻度狭窄组和重度狭窄组CpnIgG抗体阳性率均显著高于正常组,轻度狭窄组与重度狭窄组之间无显著性差异。3组CpnIgM抗体阳性率无显著性差异;稳定性心绞痛（SAP）组和急性冠脉综合征（ACS）组CpnIgG抗体阳性率均高于正常组,ACS组与SAP组之间差异无显著性。3组CpnIgM抗体阳性率无显著性差异;ACS组CRP阳性率显著高于正常组和SAP组,正常组和SAP组之间无显著差异性。CpnIgG抗体阳性组的CRP阳性率显著高于CpnIgG抗体阴性组。结论 Cpn感染所介导的炎症反应可能在冠心病的发生与发展中起一定作用,但因果关系尚待确定。     

腺病毒介导的白细胞介素24基因对人肺腺癌细胞的放疗增敏作用

目的研究腺病毒介导的白细胞介素24基因(Ad-IL-24)对人肺腺癌细胞SPC-A1体外抑癌效应、放疗增敏作用。方法将Ad-IL-24感染的SPC-A1细胞,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹(Western blot)法检测IL-24目的基因在SPC-A1细胞中的转录和表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测磷酸盐缓冲液(PBS)组、腺病毒(Ad-GFP)组、Ad-IL-24组、放疗组、Ad-GFP联合放疗组(Ad+放疗组)及Ad-IL-24联合放疗组(Ad-IL-24+放疗组)对SPC-A1细胞生长抑制作用,流式细胞术(FCM)检测各组SPC-A1细胞生长周期和凋亡率。RT-PCR法检测SPCA1细胞中生存素、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白X(bax)、B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(bcl-2)凋亡相关因子的表达。结果 Ad-IL-24作用SPC-A1细胞后,目的基因在SPC-A1细胞中成功转录及表达;Ad-IL-24能显著抑制SPC-A1细胞的生长且呈现时间依赖性,Ad-IL-24组(31.1±0.9)%、放疗组(44.4±2.3)%、Ad-IL-24+放疗组(72.4±1.5)%的生长抑制率分别与Ad-GFP组(2.7±1.1)%比较,均差异有统计学意义(P0.01),且Ad-IL-24+放疗组优于Ad-IL-24组、放疗组(F=314.613,P0.01),呈现放疗增敏的协同作用(Q=1.172);Ad-IL-24可诱导SPC-A1细胞G2/M期阻滞和细胞凋亡,Ad-IL-24+放疗组(40.6±3.3)%的细胞凋亡率与Ad-IL-24组(15.4±1.1)%、放疗组(26.3±1.7)%比较,差异有统计学意义(F=87.194,P0.01),且具有放疗增敏协同作用(Q=1.162)。Ad-IL-24能明显上调促细胞凋亡相关因子bax、Caspase-3,并下调细胞抗凋亡因子bcl-2、生存素的表达,Ad-IL-24+放疗组作用优于Ad-IL-24组、放疗组。结论 Ad-IL-24有放疗增敏的作用,是理想的放疗增敏剂,该作用机制可能与诱导肿瘤细胞阻滞在G2/M期以及促进肿瘤细胞凋亡有关。     

RGD修饰的腺病毒介导LIF和IL-24双基因共表达对MEG01白血病细胞的抑制作用

目的 利用RGD修饰改造白血病抑制因子（LIF）和白细胞介素 24（IL-24）双基因共表达腺病毒载体,以提高感染效率,探讨其对人白血病MEG01细胞的抑制作用。方法 同源重组法构建RGD修饰的表达LIF、IL 24的腺病毒载体Ad.RGD-LIF、Ad.RGD -IL24和Ad.RGD-LIF-IL24。在QBI-293A细胞中扩增腺病毒,检测病毒滴度。流式细胞仪检测各组腺病毒载体对MEG01细胞的感染效率。应用Western blotting检测目的基因LIF、IL-24在MEG01细胞中的表达。CCK-8法检测各组腺病毒载体Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24、Ad.RGD-LIF-IL24感染MEG01细胞后对细胞增殖的影响。PE-AnexinV／7-AAD双染后,经流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达。PI染色后,流式细胞仪检测目的基因表达对MEG01细胞周期的影响。实时定量PCR检测细胞周期调控基因p21和E2F1的表达。结果 成功构建了RGD修饰的腺病毒载体Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24和Ad.RGD-LIF-IL24。RGD修饰后的腺病毒能够显著增强对MEG01细胞的感染效率。CCK-8检测显示,与PBS组比较,携带单个目的基因的腺病毒载体Ad.RGD-LIF和Ad.RGD-IL24在第5 d对细胞生长的抑制率分别为29.2％和31.5％,均能够显著抑制MEG01细胞的生长;携带Ad.RGD-LIF-IL24双基因组的抑制率达42.5％,优于单基因组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。凋亡检测显示,与PBS组（4.5％）和空病毒组Ad.RGD（7.4％）比较,Ad.RGD-IL24（20.9％）、Ad.RGD LIF（17.8％）均能够显著促进细胞凋亡,且Ad.RGD-LIF-IL24双基因组（29.7％）的促凋亡作用更强。Western blotting显示,LIF和IL-24能够提高促凋亡蛋白p53、Bax的表达,同时抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达。目的基因LIF、IL-24过表达会影响MEG01细胞周期的进程,使细胞阻滞在G2期。实时定量PCR显示,LIF和IL-24能够上调细胞周期调控基因p21的转录,抑制E2F1的表达。结论LIF和IL-24过表达的腺病毒载体在体外通过调节p53、Bax、Bcl-xl的表达,影响白血病细胞MEG01的生长,诱导其凋亡,并通过调控p21、E2F1的水平影响细胞周期的进程。     

再生丝素膜对Ad-VEGF165转基因成纤维细胞基因表达的影响

背景：前期实验已证实再生丝素膜可促进pcDNA3．0-VEGF165转染的L929细胞表达血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）。目的：进一步观察再生丝素膜对经腺病毒介导的人VEGF（Ad—VEGF165）转基因成纤维细胞基因转录表达的影响。设计、时间及地点：对比观察细胞基因工程实验，于2007-11／2008—04在苏州大学细胞与分子生物实验室完成。材料：再生丝素膜由苏州大学材料工程学院李明忠教授提供。方法：将Ad—VEGF165腺病毒感染培养在再生丝素膜、聚氯乙烯膜及聚乙烯膜上的QBI-293A人胚肾和WI-38人胚肺成纤维细胞，以空载体Ad-GFP腺病毒和未接种病毒的PBS组为对照。主要观察指标：通过实时定量RT-PCR法检测不同材料对成纤维细胞VEGF mRNA转录的影响；ELISA法检测其对VEGF、血管生成素1、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子表达的影响。结果：再生丝素膜组成纤维细胞VEGF mRNA呈高水平表达，但聚氯乙烯膜组转录水平明显下降（P〈0．05）。再生丝素膜组Ad—VEGF165转基因293A细胞及WI-38细胞不仅目的基因VEGF细胞因子的分泌呈高水平表达，并可促使血管生成素1基因表达水平明显提高（P〈0．05），而且再生丝素膜还可使成纤维细胞自身分泌的碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子呈现正常表达水平。结论：再生丝素膜不仅利于VEGF目的基因在成纤维细胞中呈现高效表达，并促进血管生成素1基因的表达，而且能维持成纤维细胞自身分泌的与组织损伤修复相关基因碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子的正常表达。     

人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达

目的:拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体,观察靶细胞转染后目的基因的表达水平。方法:通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因,PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因,分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上,构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和pTrack-CMV-VEGF165,经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165,经PacI线性化后转染QBI-293A包装细胞,收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165。结果:PCR﹑双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒,PmeI线性化后重组腺病毒载体获得成功包装。脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变;荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强;经多轮感染、扩增后,病毒效价可达(2.0～5.0)×1010pfu/mL。转染48h后,293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高(F=427.93,17.93,P<0.05)。结论:成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒,血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达。     

VEGF165基因重组腺病毒载体的构建及其促血管形成作用

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）基因的腺病毒表达载体（Ad—VEGF165），并观察其感染QBI．293A靶细胞后目的基因的表达及促进血管形成的作用。方法以含有VEGF165基因片段的pSV-K3-VEGF165质粒为模板，PCR扩增获得的VEGF165目的片段（XhoI、EcoRV）亚克隆至GFP标记的pAdTrack—CMV载体中构建重组转移质粒pAdTrack．CMV．VEGF165，行PCR、双酶切和DNA测序鉴定。将测序正确的pAdTrack—CMV．VEGFl65质粒经PmeI线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy．1共转化BJ5183细菌，获得同源重组腺病毒质粒pAdEasy-1．pAdTrack-CMV．VEGF165（pAd．VEGF165），再经PacI线性化后用脂质体转染QBI．293A包装细胞，通过多轮扩增和氯化铯密度梯度离心纯化获得Ad．VEGFl65重组腺病毒。RT．PCR和ELISA检测腺病毒介导的外源性VEGFl65基因在QB｜．293A细胞中的转录和表达。将孵育8d的生长状态良好的鸡胚随机分成Ad空载体腺病毒组、Ad—VEGFI65重组腺病毒组、NS组。采用鸡胚尿囊膜（CAM）法检测VEGF165重组腺病毒促进尿囊膜血管形成活性。结果PCR、双酶切和测序鉴定结果证实成功构建了pAdTrack．CMV—VEGF165重组转移质粒，并获得了高滴度的Ad．VEGF165重组腺病毒，其病毒效价可达2×10^10pfu／mL。Ad-VEGFl65感染后，QBI．293A细胞中的VEGF165含量较QBI．293A细胞对照组和Ad空病毒感染组均明显升高（P〈0．05）。Ad-VEGF165组与Ad．空载体组和NS组比较，CAM三级分支血管生长更旺盛，毛细血管更丰富（P〈0．05）。结论成功获得了携带人VEGF165基因的腺病毒表达载体，具有明显的促CAM血管形成活性，为进一步开展VEGF165基因修饰干细胞的应用研究奠定了实验基础。     

Ad-ING4对人前列腺癌细胞PC-3体内外抑癌效应的研究

背景与目的：腺病毒作为载体已被广泛用于肿瘤的基因治疗。ING4是生长抑制因子家族中的一个成员，是一种潜在的抑癌基因。本研究旨在探讨腺病毒介导的人ING4基因（Ad-ING4）对人前列腺癌细胞PC-3的体内外抑癌效应及其分子机制。方法：将扩增的Ad-ING4重组腺病毒感染PC-3细胞，用RT-PCR法检测ING4在PC-3细胞中的转录；MTT法检测ING4基因对PC-3细胞增殖的影响：流式细胞术和Hoechst33258染色法检测细胞凋亡的变化；半定量RT-PCR法检测ING4基因的表达对PC．3细胞中的bcl-2、bax、p53和caspase-3凋亡相关基因表达的影响。用Ad-ING4重组腺病毒在裸鼠PC-3移植瘤的瘤体内注射治疗，观察肿瘤生长变化，15d后处死裸鼠，摘除瘤体，称瘤重；用免疫组化法检测瘤组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3和CD34蛋白的表达。结果：腺病毒介导的人ING4基因在PC-3细胞中成功转录，明显抑制PC-3细胞增殖，上调p53、bax、caspase．3基因表达和下调bcI-2基因表达，并诱导细胞凋亡。Ad-ING4重组腺病毒能显著抑制裸鼠PC-3移植瘤的生长，瘤重的抑制率达37％，与空病毒载体Ad-GFP组和细胞对照PBS组比较差异有统计学意义（P〈0．05）；免疫组化结果显示Ad-ING4重组腺病毒能明显上调Bax和Caspase-3蛋白的表达水平，下调Bcl-2和CD34蛋白的表达水平。结论：腺病毒介导的ING4基因在体内外均可明显抑制人前列腺癌细胞PC-3的生长，诱导其凋亡，其机制可能是上调P53、Bax、Caspase-3蛋白和下调Bcl-2蛋白表达水平。     

Ad-hLIF转基因饲养层细胞对CD34+造血干/祖细胞增殖和分化的影响

目的 用腺病毒载体介导的人白血病抑制因子基因(Ad-hLIF)感染WI-38人胚肺成纤维细胞制备饲养层细胞,体外观察转基因细胞对CD34+造血干/柑细胞增殖和分化的影响,体内研究对辐射损伤SCID小鼠造血功能恢复的效果.方法 用RT-PCR和ELISA法鉴定Ad-hLIF转基因饲养层细胞目的 基因的表达后,将经免疫磁珠法分离和流式细胞术检测后的CD34+细胞在饲养层和/或细胞因子培养体系中扩增28 d,检测不同时间点的单个核细胞(MNC)数量及CD34+细胞阳性率;扩增后的MNC经CFDA SE荧光标记后移植入辐射损伤SCID小鼠体内,RT-PCR和细胞荧光标记法检测小鼠内含Alu基因人源细胞的门巢情况.结果 感染50MOI(multiplicity of infection)Ad-hLIF的饲养层细胞均有绿色荧光,RT-PCR和ELISA法结果 显示hLIF目的 基因能在WI-38饲养层细胞中表达,免疫磁珠法分离的CD34+造血干/祖细胞经流式细胞术检测其纯度可达95.60%±2.58%,MNC在Ad-hLIF转基因饲养层培养体系持续扩增,最高可达356.95±0.87倍,其中CD34+细胞仪在0～14 d能维持较高水平,最高可扩增52.11±1.13倍,以后逐渐降低.将其移植辐射损伤SCID小鼠后,可明显提高小鼠存活率,4周内小鼠骨髓中不仅可观察到CFDA SE荧光标记的细胞,而且经RT-PCR法搭定后.还可检测到表达Alu人源基因的人脐血造血归巢细胞.结论 成功建立的Ad-hLIF转基因饲养层细胞不仅体外可以有效地扩增CD34+造血干/祖细胞,并延缓其分化.扩增的CD34+细胞对辐射损伤SCID小鼠具有造血功能恢复的功能.     

IL-24基因修饰的树突状细胞促进CIK细胞对肺癌细胞的杀伤作用

目的 研究IL-24基因修饰的树突状细胞(DC)与同源细胞因子诱导的杀伤细胞(cyto-kine-induced killer,CIK)共培养后对A549肺癌细胞的杀伤作用及其机制.方法 从健康人外周血单个核细胞中常规诱导DC、CIK细胞,同时抽提重组腺病毒质粒pAdEasy-1-pTrack-CMV-IL-24,Pac I酶切线性化后脂质体转染QBl-293A细胞,收获Ad-IL-24重组病毒.将IL-24基因通过重组病毒导入已负载肿瘤抗原的DC,获得细胞称为DC-IL-24.RT-PCR和ELISA法检测DC中IL-24基因的表达,FCM和ELISA法检测DC表型及分泌细胞因子能力的变化,将DC和CIK细胞混合培养,溶血试验检测CIK细胞产生穿孔素的能力,FCM法检测共培养的DC-CIK细胞对A549肺癌细胞细胞毒活性的变化.结果 获得了高滴度的重组病毒Ad-IL-24并成功将IL-24基因导入DC,在倒置荧光显微镜下可观察到荧光,IL-24可上调Dc表而CD80、CD83、HLA-DR、CD40、CXCR4分子的表达,转染后Dc分泌IL-12、TNF-α和IL-24的能力显著增强,DC-IL-24更能促进CIK细胞产生穿孔素,与同源CIK细胞共培养后对A549肺癌细胞的细胞毒活件明显增强.结论 IL-24基因修饰的DC能增强自体CIK细胞产生特异性抗肿瘤免疫,其机制与IL-24能促进DC表型成熟,分泌Th1型细胞因子,维持DC活化状态,进而促进CIK细胞活化密切相关.