冠心病与肺炎衣原体感染及C反应蛋白的关系研究

目的 探讨肺炎衣原体（Cpn）感染与冠心病（CHD）、冠脉狭窄程度及C反应蛋白（CRP）的关系。方法 选择冠状动脉造影（CAG）确诊的冠心病患者和健康者为研究对象,用ELISA检测样本Cpn特异性IgG及IgM抗体。应用乳胶凝集法检测CRP。结果 冠脉轻度狭窄组和重度狭窄组CpnIgG抗体阳性率均显著高于正常组,轻度狭窄组与重度狭窄组之间无显著性差异。3组CpnIgM抗体阳性率无显著性差异;稳定性心绞痛（SAP）组和急性冠脉综合征（ACS）组CpnIgG抗体阳性率均高于正常组,ACS组与SAP组之间差异无显著性。3组CpnIgM抗体阳性率无显著性差异;ACS组CRP阳性率显著高于正常组和SAP组,正常组和SAP组之间无显著差异性。CpnIgG抗体阳性组的CRP阳性率显著高于CpnIgG抗体阴性组。结论 Cpn感染所介导的炎症反应可能在冠心病的发生与发展中起一定作用,但因果关系尚待确定。     

RGD修饰的腺病毒介导LIF和IL-24双基因共表达对MEG01白血病细胞的抑制作用

目的 利用RGD修饰改造白血病抑制因子（LIF）和白细胞介素 24（IL-24）双基因共表达腺病毒载体,以提高感染效率,探讨其对人白血病MEG01细胞的抑制作用。方法 同源重组法构建RGD修饰的表达LIF、IL 24的腺病毒载体Ad.RGD-LIF、Ad.RGD -IL24和Ad.RGD-LIF-IL24。在QBI-293A细胞中扩增腺病毒,检测病毒滴度。流式细胞仪检测各组腺病毒载体对MEG01细胞的感染效率。应用Western blotting检测目的基因LIF、IL-24在MEG01细胞中的表达。CCK-8法检测各组腺病毒载体Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24、Ad.RGD-LIF-IL24感染MEG01细胞后对细胞增殖的影响。PE-AnexinV／7-AAD双染后,经流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达。PI染色后,流式细胞仪检测目的基因表达对MEG01细胞周期的影响。实时定量PCR检测细胞周期调控基因p21和E2F1的表达。结果 成功构建了RGD修饰的腺病毒载体Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24和Ad.RGD-LIF-IL24。RGD修饰后的腺病毒能够显著增强对MEG01细胞的感染效率。CCK-8检测显示,与PBS组比较,携带单个目的基因的腺病毒载体Ad.RGD-LIF和Ad.RGD-IL24在第5 d对细胞生长的抑制率分别为29.2％和31.5％,均能够显著抑制MEG01细胞的生长;携带Ad.RGD-LIF-IL24双基因组的抑制率达42.5％,优于单基因组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。凋亡检测显示,与PBS组（4.5％）和空病毒组Ad.RGD（7.4％）比较,Ad.RGD-IL24（20.9％）、Ad.RGD LIF（17.8％）均能够显著促进细胞凋亡,且Ad.RGD-LIF-IL24双基因组（29.7％）的促凋亡作用更强。Western blotting显示,LIF和IL-24能够提高促凋亡蛋白p53、Bax的表达,同时抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达。目的基因LIF、IL-24过表达会影响MEG01细胞周期的进程,使细胞阻滞在G2期。实时定量PCR显示,LIF和IL-24能够上调细胞周期调控基因p21的转录,抑制E2F1的表达。结论LIF和IL-24过表达的腺病毒载体在体外通过调节p53、Bax、Bcl-xl的表达,影响白血病细胞MEG01的生长,诱导其凋亡,并通过调控p21、E2F1的水平影响细胞周期的进程。     

人端粒酶逆转录酶启动子介导的E1A和IL-24表达及其对肝癌细胞生长的抑制作用

目的构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子介导的E1A和IL-24双基因靶向腺病毒载体,获得Ad-h-E1A-IL-24靶向重组病毒子,并探索其体外抑瘤作用。方法运用PCR扩增MCF-7乳腺癌细胞的DNA,XbaⅠ和HindⅢ酶切获得280 bp hTERT启动子,插入空载体构建成pTrack-hTERT;运用PCR及HindⅢ和XhoⅠ酶切获得E1A,与pTrack-hTERT构成pAdTrack-hTERT-E1A;运用PCR及NotⅠ和SalⅠ酶切获得IL-24,插入pTrack-PP-IRES;XbaⅠ和XhoⅠ酶切获得hTERT-E1A,与pTrack-PP-IL-24-IRES形成pTrack-hTERT-E1A-PP-IL-24-IRES,同源重组、包装和扩增获得Ad-h-E1A-IL-24重组靶向病毒子。用25 MOI重组靶向腺病毒感染SMMC-7721肝癌细胞,MTT法测定Ad-h-E1A-IL-24的细胞生长抑制作用。结果成功构建pTrack-hTERT-E1A-PP-IL-24-IRES,并获得Ad-h-E1A-IL-24重组病毒子。与非靶向双基因比较,Ad-h-E1A-IL-24组可明显抑制肿瘤细胞生长（P〈0.05或0.01）。结论Ad-h-E1A-IL-24靶向腺病毒载体的体外抑瘤作用优于非靶向双基因载体。     

重组人白细胞介素-24对裸鼠人胃癌移植瘤生长的抑制作用

白细胞介素（IL）-24对多种人肿瘤细胞的生长均有抑制作用，可诱导肿瘤凋亡、抑制肿瘤细胞生长和血管生成，对正常细胞没有影响，还具有抑制裸鼠人移植瘤生长的作用。苏州大学医学院细胞和分子生物学教研室成功构建了真核表达载体pcDNA3．0-IL-24和原核表达载体PET21a（＋）IL-24，并分别在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞和大肠杆菌BL-21中稳定表达。我们在此研究基础上，将两种质粒的表达产物重组人白细胞介素（rhIL）-24蛋白直接注入裸鼠人胃癌皮下移植瘤瘤体内，观察对裸鼠胃癌移植瘤生长的影响，并初步探讨其可能的作用机制。     

Ad-hLIF转基因饲养层细胞对CD34+造血干/祖细胞增殖和分化的影响

目的 用腺病毒载体介导的人白血病抑制因子基因(Ad-hLIF)感染WI-38人胚肺成纤维细胞制备饲养层细胞,体外观察转基因细胞对CD34+造血干/柑细胞增殖和分化的影响,体内研究对辐射损伤SCID小鼠造血功能恢复的效果.方法 用RT-PCR和ELISA法鉴定Ad-hLIF转基因饲养层细胞目的 基因的表达后,将经免疫磁珠法分离和流式细胞术检测后的CD34+细胞在饲养层和/或细胞因子培养体系中扩增28 d,检测不同时间点的单个核细胞(MNC)数量及CD34+细胞阳性率;扩增后的MNC经CFDA SE荧光标记后移植入辐射损伤SCID小鼠体内,RT-PCR和细胞荧光标记法检测小鼠内含Alu基因人源细胞的门巢情况.结果 感染50MOI(multiplicity of infection)Ad-hLIF的饲养层细胞均有绿色荧光,RT-PCR和ELISA法结果 显示hLIF目的 基因能在WI-38饲养层细胞中表达,免疫磁珠法分离的CD34+造血干/祖细胞经流式细胞术检测其纯度可达95.60%±2.58%,MNC在Ad-hLIF转基因饲养层培养体系持续扩增,最高可达356.95±0.87倍,其中CD34+细胞仪在0～14 d能维持较高水平,最高可扩增52.11±1.13倍,以后逐渐降低.将其移植辐射损伤SCID小鼠后,可明显提高小鼠存活率,4周内小鼠骨髓中不仅可观察到CFDA SE荧光标记的细胞,而且经RT-PCR法搭定后.还可检测到表达Alu人源基因的人脐血造血归巢细胞.结论 成功建立的Ad-hLIF转基因饲养层细胞不仅体外可以有效地扩增CD34+造血干/祖细胞,并延缓其分化.扩增的CD34+细胞对辐射损伤SCID小鼠具有造血功能恢复的功能.     

门静脉周围积液的影像表现分型及临床意义

目的探讨肝门静脉周围间隙积液的影像学表现、分型及临床意义。方法选取265例经MSCT及MRI检查诊断肝脏IPSE征象的病例包括肝肿瘤介入治疗后108例(40.8%)、慢性肝炎78例(29.4%)、肝转移瘤25例(9.4%)、尿毒症16例(6.0%)、肝脓肿11例(4.1%)、心力衰竭10例(3.7%),其他包括急性胰腺炎6例、外伤性肝损伤6例和胰腺及胆囊术后5例(6.4%),总结IPSE的影像表现并分型。结果依照IPSE的影像表现分为三型:全肝叶型138例(52.1%);肝右叶型77例(29.1%),肝左叶型50例(18.8%)。结论不同类型IPSE影像表现与其发病基础有关,对临床综合判断肝组织及其功能损伤程度、分析病因及指导治疗有重要意义。     

VEGF165基因重组腺病毒载体的构建及其促血管形成作用

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）基因的腺病毒表达载体（Ad—VEGF165），并观察其感染QBI．293A靶细胞后目的基因的表达及促进血管形成的作用。方法以含有VEGF165基因片段的pSV-K3-VEGF165质粒为模板，PCR扩增获得的VEGF165目的片段（XhoI、EcoRV）亚克隆至GFP标记的pAdTrack—CMV载体中构建重组转移质粒pAdTrack．CMV．VEGF165，行PCR、双酶切和DNA测序鉴定。将测序正确的pAdTrack—CMV．VEGFl65质粒经PmeI线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy．1共转化BJ5183细菌，获得同源重组腺病毒质粒pAdEasy-1．pAdTrack-CMV．VEGF165（pAd．VEGF165），再经PacI线性化后用脂质体转染QBI．293A包装细胞，通过多轮扩增和氯化铯密度梯度离心纯化获得Ad．VEGFl65重组腺病毒。RT．PCR和ELISA检测腺病毒介导的外源性VEGFl65基因在QB｜．293A细胞中的转录和表达。将孵育8d的生长状态良好的鸡胚随机分成Ad空载体腺病毒组、Ad—VEGFI65重组腺病毒组、NS组。采用鸡胚尿囊膜（CAM）法检测VEGF165重组腺病毒促进尿囊膜血管形成活性。结果PCR、双酶切和测序鉴定结果证实成功构建了pAdTrack．CMV—VEGF165重组转移质粒，并获得了高滴度的Ad．VEGF165重组腺病毒，其病毒效价可达2×10^10pfu／mL。Ad-VEGFl65感染后，QBI．293A细胞中的VEGF165含量较QBI．293A细胞对照组和Ad空病毒感染组均明显升高（P〈0．05）。Ad-VEGF165组与Ad．空载体组和NS组比较，CAM三级分支血管生长更旺盛，毛细血管更丰富（P〈0．05）。结论成功获得了携带人VEGF165基因的腺病毒表达载体，具有明显的促CAM血管形成活性，为进一步开展VEGF165基因修饰干细胞的应用研究奠定了实验基础。     

Ad.RGD-ING4-PTEN对神经胶质瘤U87细胞增殖、凋亡及侵袭的影响

目的:探讨经RGD修饰的生长抑制因子4(inhibitor of growth 4,ING4)基因与第10染色体缺失与张力蛋白同源的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten,PTEN)双基因共表达的腺病毒载体(Ad.RGD-ING4-PTEN)体外对神经胶质瘤U87细胞的增殖、凋亡及侵袭的影响.方法:以Ad.RGD-ING4-PTEN为实验组,Ad.RGD-ING4/-PTEN为单基因对照组,PBS、Ad.RGD/Ad-GFP为空白对照组,分别体外感染U87神经胶质瘤细胞.Western blotting检测目的基因ING4和PTEN在U87细胞中的表达,MTT法检测实验组病毒感染对U87细胞增殖的影响,流式细胞术及Real-time PCR法检测神经胶质瘤细胞凋亡及凋亡相关基因(Bcl-2、Bax、caspase-3、HIF-1α)表达变化,划痕实验及Transwell实验检测实验组病毒感染对U87细胞迁移及侵袭能力的影响,Real-time PCR法检测侵袭相关基因(MMP-2、MMP-9)表达变化.结果:成功检测到ING4和PTEN仅在实验组及相应单基因对照组中表达.实验组第5天细胞抑制率可达(83.1±4.6)％、凋亡率可达(40.7±4.3)％,与单基因组及空白对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05);实验组能明显上调U87细胞中Bax、caspase-3和下调HIF-1α、Bcl-2等细胞凋亡相关蛋白的表达(均P＜0.05),而且肿瘤侵袭相关分子MMP-2、MMP-9的表达也明显下调(均P＜0.05);实验组细胞迁移距离[(70.1±6.2)μm]和穿膜细胞数[(26.6±3.5)个]均明显减少,与单基因组及空白对照组比较差异有统计学意义(均P＜0.05).结论:与单基因腺病毒相比,Ad.RGD-ING4-PTEN双基因具有更显著的抑制U87神经胶质瘤细胞增殖、诱导其凋亡,并抑制其迁移及侵袭能力.