组织型纤溶酶原激活因子构建及其在人脐静脉内皮细胞的表达活性

背景：组织型纤溶酶原激活因子被认为是血管系统内初期血栓清除的关键酶。目的：构建pcDNA3．1（＋）组织型纤溶酶原激活因子真核表达载体转染人脐静脉内皮细胞，观察外源性组织型纤溶酶原激活因子的表达情况。设计：随机对照实验。单位：中南大学湘雅二医院及中国医学遗传学国家重点实验室。材料：实验于2002-09／2003-06在中国医学遗传学国家重点实验室完成。脐静脉内皮细胞取自中南大学湘雅二医院健康产妇分娩后胎盘脐带，pcDNA3．1为Smith Kline Beecham公司赠送。方法：构建真核表达载体pcDNA3．1（＋）组织型纤溶酶原激活因子，并将pcDNA3．1（＋）组织型纤溶酶原激活因子转入人脐静脉内皮细胞，用酶联免疫吸附法定量检测转基因后组织型纤溶酶原激活因子蛋白表达情况、发色底物法检测外源性组织型纤溶酶原激活因子活性。以转pcD-NA3．1（＋）组织型纤溶酶原激活因子基因人脐静脉内皮细胞为观察对象，未转pcDNA3．1（＋）组织型纤溶酶原激活因子基因人脐静脉内皮细胞作为对照。主要观察指标：组织型纤溶酶原激活因子蛋白定量及活性测定结果。结果：①组织型纤溶酶原激活因子蛋白定量表达结果为568．6ng／10。细胞／24h，未转pcDNA3．1（＋）组织型纤溶酶原激活因子的人脐静脉内皮细胞测得为17．8ng／10。细胞／24h。②组织型纤溶酶原激活因子活性为108．8IU／10。细胞／24h，未转pcDNA3．1（＋）组织型纤溶酶原激活因子的人脐静脉内皮细胞测得为5．6IU／105细胞／24h。结论：pcDNA3．1（＋）组织型纤溶酶原激活因子转染人脐静脉内皮细胞后，外源性组织型纤溶酶原激活因子基因获有效表达。为pcDNA3．1（＋）组织型纤溶酶原激活因子转入人体细胞确立了有效依据。     

弥漫性掌跖角化病家系角蛋白9基因突变热点区的检测

目的：确定一个弥漫性掌跖角化病家系的致病基因。方法：收集一个弥漫性掌跖角化病家系7人（3名患者,4名正常人）和家系外10位正常人的血样,抽提基因组DNA,然后对角蛋白9基因的突变热点区进行PCR扩增,测序分析PCR产物。结果：该家系中3例患者的角蛋白9基因编码区第485位碱基发生G→A的突变,导致第162位的精氨酸被谷氨酰胺取代（R162Q）,而4位家系内正常人和家系外10位正常人未发现此突变。结论：角蛋白9基因的G485A突变是导致该家系发生弥漫性掌跖角化病的原因。     

基于人类遗传资源收集、保藏及生物信息学技术的遗传病致病基因定位与克隆

Mappingandidentificationofdiseaseassociatedgeneswilldemonstratethegeneticbasisforthehumangeneticdisorders,andprovidethefundamentaldataforelucidationofpathogenesismechanismofthedisorders.Geneticre sources,includingpedigreeinformation,bloodsample,andtissues,etc.,areessentialmaterialsforfindingofthelinkedlocusandgeneforcertaingeneticdisease.Genomewidescanning,positionalcloningandcandidateap proacharemostwidelyusedmethodsorstrategy,bywhich,thousandsofdiseasesresponsiblegeneshavebeeni dentified.Nat…     

皮肤成纤维细胞体外培养的安全性实验研究

目的：对所建立的人皮肤成纤维细胞系进行安全性检测。方法：对人皮肤成纤维细胞进行形态学观察、染色体核型分析、软琼脂试验、裸鼠致瘤试验、内毒素试验、支原体检测、病毒因子检测、细菌、真菌检测、异常毒性试验。结果：结果均为阴性。结论：所获取的皮肤成纤维细胞可作为一种安全、可靠的靶细胞用于基因治疗研究。     

人皮肤角质形成细胞的分离与原代无血清培养

目的：建立一种体外人皮肤角质形成细胞分离与原代培养的方法。方法：采用两步消化法对皮肤进行消化，获取角质形成细胞进行体外无血清培养基培养，进行细胞形态学观察、免疫组织化学、透射电镜鉴定及生长曲线的绘制与分析。结果：该方法可获取较多高纯度的角质形成细胞，且在体外可快速稳定增殖。结论：两步消化法和体外无血清培养是一种理想的皮肤角质形成细胞分离培养的方法。     

人皮肤角质形成细胞的分离与原代无血清培养

目的 :建立一种体外人皮肤角质形成细胞分离与原代培养的方法。方法 :采用两步消化法对皮肤进行消化 ,获取角质形成细胞进行体外无血清培养基培养 ,进行细胞形态学观察、免疫组织化学、透射电镜鉴定及生长曲线的绘制与分析。结果 :该方法可获取较多高纯度的角质形成细胞 ,且在体外可快速稳定增殖。结论 :两步消化法和体外无血清培养是一种理想的皮肤角质形成细胞分离培养的方法