血管内皮生长因子_(165)反义RNA治疗人脑胶质瘤的实验研究

目的　探讨应用血管内皮生长因子165(VEGF165)反义RNA治疗人脑胶质瘤的可行性。方法　构建和鉴定反义VEGF165真核表达载体 ;将其转染入人脑胶质瘤细胞SHG44 ,检测其转染前、后的生物学性状 ;比较转染前、后SHG44细胞的裸鼠皮下致瘤性 ;分别应用免疫印迹、免疫组织化学、微血管计数、电镜和流式细胞仪检测上述改变。结果　成功构建反义VEGF165真核表达载体并在SHG44细胞获得表达 ,该细胞生物学性状不受外源基因表达影响 ,其在裸鼠皮下致瘤性和血管生成能力明显下降。肿瘤终体积 :实验组 2 12mm3,对照组 7897mm3(P <0 .0 1) ;血管计数 :实验组 5 .5 0 ,对照组11 2 2 (P <0 .0 1)。结论　VEGF165反义RNA能有效抑制人脑胶质瘤血管生成和肿瘤生长 ,为基因治疗实体瘤奠定了基础     

杂志信息

血管内皮生长因子165反义RNA治疗人脑胶质瘤的实验研究 据《中华医学杂志》2000年5月80卷第5期报道 第四军医大学西京医院全军神经外科研究所章翔等,为探讨应用血管内皮生长因子_165(VECF_165)反义RNA治疗人脑胶质瘤的可行性,构建和鉴定了反义VEGF_165真核表达载体,并将其转染入人脑胶质瘤细胞SHG44,检测其转染前、后的生物学性状,比较转染前、后SHG44细胞的裸鼠皮下致瘤性,分别应用免疫印迹、免疫组织化学、微血管计数、电镜和流式细胞仪检测上述改变。     

血管内皮生长因子165反义RNA治疗人脑胶质瘤的实验研究

目的 探讨应用血管内皮生长因子１６５（ＶＥＧＦ１６５）反义ＲＮＡ治疗人脑胶质瘤的可行性。方法 构建和鉴定反义ＶＥＧＦ１６５真核表达载体;将其转染入人脑胶质瘤细胞ＳＨＧ４４,检测其转染前、后的生物学性状;比较转染前、后ＳＨＧ４４细胞的裸鼠皮下致瘤性;分别应用免疫印迹、免疫组织化学、微血管计数、电镜和流式细胞仪检测上述改变。结果 成功构建反义ＶＥＧＦ１６５真核表达载体并在ＳＨＧ４４细胞获得表达,该细胞     

人反义VEGF_(121) cDNA表达质粒的构建及其对膀胱癌细胞增殖的影响

目的 构建人反义VEGF121 cDNA真核表达质粒,研究反义基因治疗对膀胱癌细胞增殖的影响。方法将VEGF121反向克隆入真核表达载体pcDNA3中,酶切鉴定。用此真核表达重组质粒转染人膀胱癌细胞株T24,G418筛选获得阳性克隆,RT-PCR法测定转染前后T24细胞中VEGF mRNA表达,ELISA法检测转染前后T24细胞中VEGF蛋白表达。利用MTT法、软琼脂克隆形成试验、流式细胞仪和电镜等检测转染前后T24细胞的生物学性状。结果 获得反义VEGF121 cDNA质粒表达重组质粒。VEGF121反义RNA部分阻断了T24细胞中VEGF表达,转染后肿瘤细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白表达都明显减少;转染后单个细胞的克隆形成能力明显减弱;形态学超微结构显示细胞器扩张和肿胀,核染色质边集,凝集成块,可见明显的凋亡改变。结论成功构建了反义VEGF121 cDNA真核表达质粒,转染该质粒可明显抑制膀胱癌细胞增殖,为膀胱癌的基因治疗提供了一定的实验依据。     

VEGF165真核表达载体的构建及其在鼠膀胱平滑肌细胞的表达

目的 构建血管内皮生长因子(VEGF165)真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165,转染鼠膀胱平滑肌细胞并检验其生物学活性.方法 将VEGF165 cDNA克隆于真核表达载体pcDNA3.1(-),构建真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165;并转染入鼠膀胱平滑肌细胞,采用RT-PCR和免疫荧光染色检测VEGF165基因在鼠膀胱平滑肌细胞中的表达,并用MTT法检测转染后细胞上清液中VEGF165的生物学活性.结果 和结论将构建的真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165转染入鼠膀胱平滑肌细胞后,VEGF的表达增高,转染后细胞上清液具有促使内皮细胞增殖的生物学活性.     

人反义VEGF121 cDNA表达质粒的构建及其对膀胱癌细胞增殖的影响

目的 构建人反义VEGF121cDNA真核表达质粒，研究反义基因治疗对膀胱癌细胞增殖的影响。方法 将VEGFl21反向克隆人真核表达载体pcDNA3中，酶切鉴定。用此真核表达重组质粒转染人膀胱癌细胞株T24，G418筛选获得阳性克隆，RT-PCR法测定转染前后T24细胞中VEGF mRNA表达，ELISA法检测转染前后T24细胞中VEGF蛋白表达。利用MTT法、软琼脂克隆形成试验、流式细胞仪和电镜等检测转染前后T24．细胞的生物学性状。结果 获得反义VEGF121cDNA质粒表达重组质粒。VEGFl21反义RNA部分阻断了T24细胞中VEGF表达，转染后肿瘤细胞VEGFmRNA和VEGF蛋白表达都明显减少；转染后单个细胞的克隆形成能力明显减弱；形态学超微结构显示细胞器扩张和肿胀，核染色质边集，凝集成块，可见明显的凋亡改变。结论 成功构建了反义VEGF121cDNA真核表达质粒，转染该质粒可明显抑制膀胱癌细胞增殖，为膀胱癌的基因治疗提供了一定的实验依据。     

含绿色荧光蛋白和PLCZ的逆转录病毒载体的构建及其在SHG44细胞中的表达

目的构建含有PLC-γ1分子Z区(PLCZ)和绿色荧光蛋白基因的双顺反子逆转录病毒载体,并将其导入SHG44胶质瘤细胞中,以探索PLC-γ1分子对胶质瘤细胞侵袭作用的影响. 方法 PCR法扩增PLCz基因,测序后克隆入pIRES-EGFP荧光蛋白表达载体中,酶切鉴定重组体. 将PLCz-IRES-EGFP片段克隆入逆转录病毒载体pLXSN的相应位点,构建含有PLCz和EGFP基因的逆转录病毒载体,脂质体介导下转染包装细胞PA317,G418筛选并检测病毒滴度后挑选细胞克隆. 病毒上清感染人脑胶质瘤SHG44细胞,G418筛选获得稳定转染细胞,PCR检测外源基因的整合,Northern blot检测外源基因的转录,Western blot和荧光显微镜分别检测PLCz分子和EGFP的表达. 结果 PCR扩增得到大小约650 bp的特异性条带,序列测定结果与发表序列一致. 构建得到含有PLCz和EGFP基因的双顺反子逆转录病毒载体,转染人脑胶质瘤细胞SHG44,得到稳定转染的细胞株SHG44-PIE. PCR扩增显示目的片段已整合入细胞基因组. Northern blot分析显示为单一的转录本. Western blot可见大小约50×103的特异性条带,荧光显微镜检测显示EGFP获得良好表达. 结论成功构建含有PLCz和绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体,并获得稳定转染该载体的SHG44胶质瘤细胞株.     

Survivin反义核酸真核表达载体的构建及在胶质瘤细胞中的表达

目的构建survivin反义核酸真核表达载体pIRES2-EGFP-SVVas,并检测其在恶性胶质瘤细胞SHG-44中的表达。方法构建survivin反义核酸真核表达载体pIRES2-EGFP-SVVas,并用脂质体介导转染入SHG-44细胞,通过RT-PCR及western blot检测细胞中survivin mRNA和蛋白的表达。结果构建了survivin反义核酸真核表达载体pIRES2-EGFP-SWas,并成功导入SHG-44细胞中,且有效表达,使SHG-44细胞中survivin mRNA和蛋白表达水平均降低。结论Survivin反义核酸真核表达载体pIRES2-EGFP-sVVas可以降低SHG-44细胞survivin基因的表达。     

稳定转染CDK2干扰RNA真核表达载体的人脑胶质细胞瘤SHG44细胞系的建立

目的：构建CDK2的干扰RNA真核表达载体,并且稳定转染人脑胶质细胞瘤SHG44细胞来抑制CDK2的表达,为人脑胶质细胞瘤的研究提供有价值的资料。方法：1.根据siRNA设计原则和GeneBank数据库中CDK2的cDNA序列,构建CDK2干扰RNA真核表达载体PGenesil-1-CDK2,并测序鉴定。2.利用脂质体法转染CDK2的干扰RNA真核表达载体,G418筛选阳性转染细胞克隆,制备稳定转染干扰RNA真核表达载体的SHG44细胞系,用倒置荧光显微镜观察荧光蛋白表达量。结果：1.成功构建了CDK2干扰RNA真核表达载体。经鉴定证实,构建的siRNAs序列与基因库中序列完全相同,并且未发现有突变、缺失、插入等异常存在。2.获得稳定转染CDK2干扰RNA真核表达载体的SHG44细胞系,命名为PGenesil-1-CDK2-SHG44。结论：成功的建立稳定转染CDK2干扰RNA的SHG44细胞系。     

外源性血管抑素K(1-3)基因在人脑胶质瘤中的表达意义

目的 探讨外源性血和抑素Ｋ（１－３）基因「ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎＫ９１－３）,ＡＫ（１－３）」在人脑胶质瘤中的表达及其作用。方法 应用ＰＣＲ法,使人Ｉｇｋａｐｐａ链分泌信号肽序列Ｓ中装在ＡＫ（１－３）基因上－ＳＡＫ（１－３）;构建ＳＡＫ（１－３）基因的真核表达载体ｐｃＤＮＡ－ＳＡＫ（１－３）。经脂质体法将其转染入ＳＨＧ４４人脑胶质瘤细胞,行Ｇ４１８筛选获得转基因瘤细胞克隆,比较转基因和内皮细胞抑制     

人血管内皮生长因子基因cDNA的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的：克隆和在COS－7细胞中表达人血管内皮生长因子165（VEGF165）。方法：利用RT－PCR方法，从新鲜卵巢癌组织中扩增到人VEGF165的全长cDNA，并测定其核酸序列；利用基因重组技术构建VEGF165的真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165；应用脂质体介导的基因转移术将这一表达载体导入COS－7细胞后，免疫组化（SP法）检测瞬时表达的产物。结果：经酶切鉴定和基因测序证实，克隆的基因片段为人VEGF65cDNA，重组质粒pcDNA3．1－VEGF165转染COS－7细胞后，免疫组化检测有VEGF表达，结论：成功克隆人VEGF165基因，并在COS－7细胞获得表达。     

Angiostatin K(1-3) gene for treatment of human gliomas: an experimental study

Objective To discuss the feasibility of gene therapy of human glioma by antiangiogenesis method.
Methods Angiostatin K(1-3) cDNA with secretive signal was inserted into the polylinker s ites of eukaryotic expression vector pcDNA3 to construct pcDNA-SAK(1-3).The vector was transfected into human SHG44 glioma cells by lipofectamine and the po sitive clone was screened by G418.The biological characteristics of glioma cel ls were examined by electronmicroscope and flow cytometry.The activity of angi ostatin K(1-3) protein expressed by SHG44 cells was examined by the bovine micr a ngium endotheliocyte inhibition assay and immunofluorescence assay.When SHG44 cells were implanted into the strata subcutaneum of nude mice, tumor necrosis an d micrangium were calculated immunohistochemically and electronmicroscopically f or determining their charac-teristics and validity in gene therapy of human glio ma by antiangiogenesis method.
Results The eukaryotic expression vector pcDNA-SAK(1-3) was successfully constructed and transfected into glioma cells.The cells expressed angiostatin K(1-3) prote i n, and their tumorigenesis and angiogenesis in nude mice were greatly reduced.
Conclusion Angiostatin K(1-3) gene is feasible to treat human glioma.This experiment lay s a foundation for gene therapy of the other solid tumors by antiangiogenesis method.     

血管内皮细胞生长因子在哺乳动物细胞的表达

目的：本实验试图构建具有生物学活性的ＶＥＧＦ真核表达载体,为ＶＥＧＦ基因治疗提供载体。方法：将已获得的ｈＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ克隆到ＧＳＴ融合表达载体,构建原核表达质粒,转染大肠杆菌ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定表达产物。在此基础上构建真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ ／ｈＶＥＧＦ１６５,脂质体介导转染ＣＨＯ－Ｋ１细胞,Ｇ－４１８筛选,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ,Ｗｅｓｔ－ｅｒｎ ｂｌｏｔ分别检测其在细胞内的转录和表达情况,３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测表达蛋白的活性。结果：实验组的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ出现特异性条带,而对照组在相应部位未出现条带。实验组的大鼠心肌血管内皮细胞３Ｈ－ＴｄＲ掺入率明显高于对照组（Ｐ＜ ０．００１）。结论：本实验所构建的ＶＥＧＦ真核表达质粒能够在真核细胞内获得表达,其表达产物具有血管内皮细胞增殖刺激活性。     

pcDNA3.1/hVEGF165的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的　克隆人血管内皮生长因子基因VEGF165片段,构建pcDNA3·1 /hVEGF165,观察其在COS 7细胞中的表达,为基因治疗缺血性心脏病奠定基础。方法　从胎儿心肌组织中提取总RNA,应用RT PCR方法获得hVEGF165基因,将其重组入T载体,PCR法鉴定并测序,双酶切后克隆入真核表达载体pcDNA3 1 /myc his B中,构建pcDNA3 1 /hVEGF165重组体。用脂质体介导将其转染COS 7细胞,WesternBlotting方法检测rhVEGF165的表达蛋白。结果　RT PCR方法从胎儿心肌组织获得正确的hVEGF165基因序列,成功构建pcDNA3·1 /hVEGF165且实现转染COS 7细胞的瞬时表达。结论　该实验构建的pcDNA3· 1 /hVEGF165转染真核细胞COS 7能够表达rhVEGF蛋白。