超声介导微泡靶向传输基因促血管新生的实验研究

目的探讨超声介导微泡靶向传输血管内皮生长因子VEGF165促心肌血管新生即心肌“分子搭桥”的新途径。方法利用分子生物学方法构建人血管内皮生长因子真核表达质粒pcDNA3.1-/VEGF165;制备载VEGF165基因脂质体微泡,分析其理化性质和功能,在超声场利用超声辐射向大鼠梗死心肌靶向传输VEGF165;2周后取材,逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)评价大鼠心肌中人源VEGF165mRNA表达,蛋白印迹杂交(WesternBlot)观察大鼠心肌VEGF165的蛋白表达,CD34免疫组化微血管密度(MVD)计数半定量法评价超声介导微泡靶向传输VEGF165促梗死心肌血管新生效果。结果①成功构建、克隆血管内皮生长基因VEGF165重组真核表达质粒pcDNA3.1-/VEGF165,测序分析、酶切鉴定准确无误;②研制的脂质体微泡超微结构显示可粘附或包载DNA,粒度分析显示平均粒径<5μm;③在超声介导下该脂质体载基因微泡可靶向传输VEGF165至大鼠梗死心肌,超声介导靶向传输组VEGF165的mRNA、蛋白表达及促血管新生作用(MVD表示)仅次于VEGF165基因心肌注射组。结论超声介导微泡可向大鼠心肌靶向传输VEGF165基因并产生促血管新生效应。     

沙丁胺醇在诱导培养人气管平滑肌细胞凋亡中的作用

目的 研究沙丁胺醇（商品名：舒喘灵）对于诱导培养人气管平滑肌细胞凋亡的作用。 方法 分离人气管平滑肌细胞并且在含有10％胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔（DMEM）培养基中培养,4－6代的细胞用于实验。细胞用沙丁胺醇或色满卡林（cromakalim)或8－溴－环磷酸腺苷（Br-Camp)培养24h或48h ,光镜和电镜观察形态学改变。琼脂糖电泳分析DNA碎片。链亲和素－过氧化物酶（SP）免疫组化染色监测p53、Bcl－2和Bax基因表达的改变。通过破碎DNA的原位末端标记技术（TUNEL）检测凋亡细胞的百分数。结果 （1）沙丁胺醇或8－Br-cAMP降低存活细胞的数目。在48h、300μmol/L的浓度,存活的细胞数量最低;（2）人气管平滑肌细胞用沙丁胺醇（100μmol/L、300μmol/L)孵化48h显示出凋亡的形态学特征（细胞皱缩、染色质浓聚）;（3）琼脂糖电泳显示,核酸DNA断裂片呈典型的梯状条带（大约180－200bp);（4）沙丁胺醇或8－Br-cAMP组p53或Bax基因表达显著高于对照组,但Bcl－2组基因表达低于对照组;（5）TUNEL显示,人气管平滑肌细胞的凋亡阳必用100、300μmol沙丁胺醇或100μmol8-Br-cAMP处理组与对照组比较差异有显著性（q分别为24．04、58．47、27．28,P均＜0．001）。但cromakalim组和先用普萘洛尔（商品名：心得安）后与沙丁胺醇组与对照组比较,差异无显著性（q分别为0．12、0．53;P分别为0．932、0．717）,不影响凋亡细胞的基本水平。结论 （1）在体外,沙丁胺醇以时间和浓度依赖的方式诱导人气管平滑肌细胞凋亡。（2）cAMP蛋白激酶A通路对于沙丁胺醇诱导的凋亡是必须的和充分的。     

丹参酮Ⅱ-A抑制血管合成醛固酮及醛固酮合酶基因CYP11B2信使核糖核酸表达

目的：说明丹参酮ⅡＡ对血管合成血管紧张素Ⅱ及醛固酮的作用。方法：用大鼠肠系膜动脉离体灌注、高效液相色谱法和放射免疫法检测肠系膜动脉中合成的血管紧张素Ⅱ及醛固酮。用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）及ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ法检测血管中醛固酮合酶基因ＣＹＰ１１Ｂ２信使核糖核酸（ｍＲＮＡ）的表达情况。结果：丹参酮ⅡＡ抑制血管合成醛固酮，但不能抑制血管合成血管紧张素Ⅱ。丹参酮ⅡＡ抑制血管中醛固酮合酶基因ＣＹＰ１１Ｂ２ｍＲＮＡ的表达。结论：丹参酮ⅡＡ治疗心血管疾病的机制可能与其抑制血管合成醛固酮有关。     

雌激素受体基因多态性与冠心病的关系

目的　研究雌激素受体 (ER)基因多态性是否与冠心病 (CHD)有相关性。方法　用聚合酶链反应 限制性酶切长度多态性分析方法 ,对 72例CHD组患者和 5 3例对照组的ER基因多态性进行分析 ,比较ER基因多态性在两组之间和在CHD组不同临床表现 (稳定性心绞痛和急性冠脉综合征 )之间分布的差异性 ,并比较 3种ER基因型与冠心病相关的临床指标。结果　PP基因型在CHD组和急性冠脉综合征组中的分布频率明显高于对照组和稳定性心绞痛组 (P <0 .0 5 )。PP基因型的高血压病患病率 6 4 .0 % ,纤维蛋白原浓度 (3.6± 0 .8)g/L ,体重指数 2 5 .4± 2 .8和高密度脂蛋白胆固醇浓度 (1.0± 0 .2 )mmol/L ,与其他基因型有显著性差异 (P <0 .0 5 )。结论　ER基因多态性可能通过改变ER的表达 ,而影响ER介导的心血管保护作用。     

124例冠心病患者三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因启动子区-477CT单核苷酸多态性分析

目的 研究三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因启动子区-477C/T单核苷酸多态性与血浆高密度脂蛋白胆固醇和冠心病的关系。方法 用聚合酶链反应限制片长多态性检测124例冠心病患者和111例正常人的三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因启动子区-477位点基因型，并比较基因型在冠心痛组与正常人组间、冠心痛组中不同临床表现型之间分布的差异性及三种基因型与冠心痛相关临床指标的关系。结果 TT基因型及T等位基因在冠心病组中的分布频率明显高于正常人组（P〈0．05和P〈0．01）。急性冠状动脉综合征组，TT基因型及T等位基因明显高于稳定型心绞痛组（P〈0．05和P〈0．01）。多支病变组TT基因型明显高于单支病变组（P〈0．05）。在冠心病组中，TT基因型血浆高密度脂蛋白胆固醇水平明显低于CC基因型（P〈0．001）。结论 三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因启动子区-477C／T单核苷酸多态性可显著影响中国冠心痛患者血浆高密度脂蛋白胆固醇水平，而且与冠状动脉病变程度及冠心病严重程度相关。     

ADAM33基因Met764Thr位点多态性与支气管哮喘发病及患者肺功能的相关性

目的探讨中国华南地区汉族人群ADAM33基因Met764Thr位点多态性与支气管哮喘（简称哮喘）及其患者肺功能的相关性。方法对164例中国华南汉族哮喘患者（哮喘组）及112名汉族健康者（健康对照组），应用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）、DNA测序及肺功能测定的方法。结果（1）不同种族人群ADAM33基因Met764Thr位点等位基因频率的比较差异无统计学意义（χ^2=6．77，P〉0．05）；（2）ADAM33基因Met764Thr位点3种基因型（Met764／Met764、Met764／Thr764、Thr764／Thr764）在哮喘组分布频率分别为78．7％（129／164）、18．3％（30／164）、3．0％（5／164）；健康对照组分布频率分别为91．1％（102／112）、6．3％（7／112）、2．7％（3／112）；各基因型分布频率哮喘组与健康对照组比较差异有统计学意义（χ^2=8．46，P〈0．05）。ADAM33基因Met764Thr位点，Thr764等位基因在哮喘组与健康对照组分布频率分别为0．122、0．058，哮喘组与健康对照组Met764及，Thr764等位基因频率比较差异有统计学意义（χ^2=6．27，P〈0．05）；（3）单变量Logistic回归分析Met764Thr位点基因多态性与哮喘的关系表明，相对Met764／Met764基因型而言，Met764／Thr764杂合型与Met764／Thr764＋Thr764／Thr764基因型均能显著增加哮喘发生的危险性[OR值及95％可信区间（CI）分别为3．389（1．430～8．030）、2．767（1．308～5．854），P均〈0．05]；（4）在哮喘组中3种基因型的用力肺活量（FVC）实测值／预测值％、第一秒用力呼气容积（FEV1）实测值／预测值％水平比较差异有统计学意义（F值分别为0．49、5．17，P均〈0．05）。结论ADAM33基因Met764Thr位点基因多态性与中国华南汉族人群哮喘发病及患者的肺功能相关。     

大鼠心肌梗死致心力衰竭模型不同时期Gα_(11)蛋白的表达

目的　观测心力衰竭不同时期Gα11蛋白表达的改变 ,探讨Gα11蛋白与心室重塑、心肌肥大和心力衰竭的关系。方法　通过结扎雄性SD大鼠左冠状动脉前降支建立实验性心肌肥大的心力衰竭动物模型 ;应用Gα11蛋白单克隆抗体对实验性梗死后心肌组织进行免疫组织化学方法和图像分析技术 ,结合HE染色对Gα11蛋白在心肌细胞肥大不同时期 (3d、1周、2周、3周和 6周 )的表达水平进行观察 ,测定其阳性单位 (PU)。结果　 (1)对照组Gα11蛋白保持较稳定的表达水平 ;心力衰竭动物模型术后 3d至 3周Gα11蛋白表达量显著增加 ,3周阶段达高峰 ;3周至 6周Gα11蛋白表达水平逐渐下降 ,并有缺失 ;图像分析也显示在演变过程中 ,Gα11蛋白的阳性面积和强度呈显著的动态变化 ,在1周 [左室心肌梗死面积 (LVMI≥ 2 0 %组 :P <0 .0 5 ) ]、2周 (LVMI≥ 2 0 %组 :P <0 .0 1)、3周 (LVMI≥ 2 0 %组 :P <0 .0 0 0 1)。结论　 (1)心肌肥厚时期Gα11蛋白表达增加 ;(2 )心力衰竭时期Gα11蛋白表达较心肌肥大时期下降和有缺失 ;(3)Gα11蛋白在心肌肥大、心室重塑和心力衰竭的发展演变中起重要的介导作用。     

雄激素缺乏小鼠体内活性氧和Rb蛋白表达的变化及对心脏衰老的影响

目的 探讨小鼠体内雄激素水平缺乏对心脏衰老的影响.方法 实验分为正常C57BL/ 6J雄鼠组(n=8)、去势组(n=8)、睾丸女性化鼠(tfm)组(n=10)、衰老组(n=8).测定各组血清睾酮浓度,分离心肌组织测定组织超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平以及Western印迹测定去磷酸化Rb蛋白表达量.结果 与正常组相比,衰老组、去势组和tfm组血清睾酮浓度明显下降(P<0.01);心肌组织中SOD活性下降(P<0.05,P<0.01)、MDA含量增加(P<0.01);去磷酸化Rb蛋白表达量增加(P<0.01).与衰老组相比,去势组和tfm组SOD活性、MDA含量及去磷酸化Rb蛋白表达量差异无统计学意义.结论 体内雄激素水平缺乏可能通过增加活性氧水平(ROS)及Rb蛋白表达导致小鼠心肌组织衰老.     

活性氧诱导血管平滑肌细胞衰老及脱氢表雄酮的干预研究

目的 观察三丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)衰老的诱导作用,及脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)的干预作用.方法 将VSMC分为4组:对照组、t-BHP刺激组(在80 μmol/L t-BHP的DMEM培养液中72 h);10 nmol/L DHEA干预组(给予t-BHP刺激前30 min先加用10 nmol/LDHEA);100 nmol/L DHEA干预组(给予t-BHP刺激前30 min先加用100 nmol/L DHEA).以衰老相关β-半乳糖苷酶活性和细胞的增殖能力两种衰老标志物为主要观察指标.其中衰老相关β-半乳糖苷酶活性采用免疫化学染色方法,流式细胞术检测细胞周期来反应细胞的增殖能力. 结果 经80 mmol/L的t-BHP持续作用72 h后,VSMC的G_0/G_1期细胞比例和SA-β半乳糖苷酶染色阳性细胞百分比增加[分别为(49.5±5.5)%和(89.4±3.4)%;(3.5±1.2)%和(75.3±4.3)%],差异有统计学意义(P<0.01).表明t-BHP成功诱导了VSMC衰老,而给予100 nmol/L DHEA干预后上述变化改善,为(71.3±3.9)%. 结论 随增龄,活性氧损害的累积可能是VSMC衰老的机制之一,DHEA可能通过抗氧化作用延缓VSMC的衰老.     

辛伐他汀对稳定型心绞痛患者血浆SOD,MDA及8-异构前列腺素F2α的影响

目的 观察辛伐他汀对稳定型心绞痛患者血浆超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛伽DA)、人8-异构前列腺素F2a (8-iso-prostaglandin F2a,8-iso-PGF2a)、尿酸(UA)和血脂水平的影响.方法 所有85例稳定型心绞痛患者分为高脂治疗组(HLT),高脂对照组(HLC)、血脂正常治疗组(NLT)、血脂正常对照组(NLC).所有病人都遵循冠心病稳定型心绞痛治疗指南给予常规治疗,治疗组给予辛伐他汀40mg/晚治疗3月,对照组给予安慰剂治疗3月.测量治疗前后患者血浆低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、甘油三酯(TG)、总胆固醉(TC),UA,SOD,MDA和8-iso-PGF2a浓度变化.结果 与对照组相比,治疗组经辛伐他汀治疗三个月后SOD活性升高,尿酸、血脂、MDA和8-异构前列腺素F2a 水平下降,差异具有显著性(P<0.05).结论 辛伐他汀在降低稳定型心绞痛患者血脂的同时,可抑制自由基的产生,增加自由基的清除,从而抑制体内氧化应激反应.