以AdMax载体系统构建携带HCV NS5B基因的重组腺病毒表达载体

目的构建表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS5B的重组腺病毒表达载体,并对其相关指标进行鉴定,为进一步研究防止丙型肝炎感染的基因免疫和基因治疗奠定实验基础。方法应用基因工程技术将HCVNS5B基因定向克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGloxΔE1、3Cre和穿梭质粒pDC316-NS5B共转染293细胞,进行同源重组,产生重组腺病毒pAd-NS5B并进行鉴定、反复感染293细胞进行扩增,扩增后测定重组病毒滴度。结果重组病毒颗粒pAd-NS5B经双引物PCR、凝胶电泳证明插入片段与HCV非结构基因NS5B片段大小相符;经测序证明其插入序列与设计HCV NS5B基因序列完全一致,扩增后重组病毒滴度达到2.3×1013IU/L。结论成功构建了表达HCV NS5B基因的重组腺病毒载体。     

晚期糖基化终末产物受体真核表达载体的构建与表达

目的 构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体真核细胞表达载体.方法 采用PCR方法从人cDNA文库中扩增RAGE基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pcDNA3真核表达载体中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定.以RAGE/pcDNA3重组质粒为模板,运用突变方法在RAGE氨基末端信号肽后插入HA序列.利用Western blotting在HEK 293细胞中对经过测序鉴定的HA-RAGE\pcDNA3重组质粒的表达进行了检测.结果 RAGE/pcDNA3重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,HA-RAGE\pcDNA3重组质粒可在HEK 293细胞中表达.结论 成功构建了带HA标签的RAGE真核细胞表达载体,该载体能在真核细胞中表达,为进一步研究RAGE在细胞信号转导途径中的作用提供了一个重要的工具.     

丙型肝炎病毒核心区与IgG Fc段融合基因疫苗的构建及表达

目的：构建能同时表达丙型肝炎病毒核心区与IgG Fc段的融合基因真核表达载体pcDNA3 HCV C-Fe，为下一步修饰和转染树突状细胞，制备能高效表达HCV C和Fc基因的树突状细胞疫苗做准备。方法：用分别含有Xhol I和Xba I初位点的人免疫球蛋白(IgG)Fc区基因上、下游引物，以含有人IgG基因序列的质粒pCMVsFc为模板，通过PCR扩增获得Fc区基因片段，基因片段回收后，以Xhol I和Xba I双酶切，定向插入到含HCV C基因的质粒PcDNA3 HCV C下游双粘端位点之间，获得重组表达质粒pcDNA3 HCVFc。通过酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行鉴定。以抗HCV C和抗Fc单克隆抗体为一抗，利用间接免疫荧光法检测pcDNA3 HCV-Fc在人肝癌细胞7721中的瞬时表达。结果：酶切、PCR及测定鉴定证实，pcDNA3 HCV—Fc插入片段为Fc区基因片段，免疫荧光法检测表明其可以在7721细胞中瞬时表达。结论：构建的质粒pcDNA3 HCV—Fc可以在7721细胞中瞬时表达Fc基因，为研究HCV C—Fc融合基因修饰的树突状细胞的功能奠定了基础。     

人PSCA真核表达载体的构建及表达

目的构建含有信号肽及FLAG标签的人前列腺干细胞抗原（PSCA）真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法通过PCR方法获得SIG-FLAG基因片段及人PSCA基因片段,插入到真核表达载体pIRES-neo中。构建的重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及RT-PCR方法检测其表达情况。结果PCR扩增出的SIG-FLAG及PSCA基因测序正确,酶切鉴定证明重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA构建成功;检测结果显示重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA在293T细胞中得到表达。结论成功构建了重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA,且在293T细胞中能有效表达,为后续转人PSCA基因细胞系的构建工作奠定了基础。     

喉癌来源的MAGE-A3基因真核表达载体及其稳定表达模型的构建和鉴定

目的：克隆人黑色素瘤相关抗原MAGE—A3基因,构建真核表达载体,检测、鉴定其在细胞中的表达。方法：MAGE-A3基因进行PCR扩增,凝胶回收PCR产物片段并连接至pMDl8一T载体。测序后将MAGE—A3基因片段亚克隆至真核表达载体,构建成plRES2-EGFP／MAGE—A3重组质粒。经脂质体转染至293T细胞株后,荧光定量PCR、Western-blotting法鉴定MAGE—A3基因的表达。结果：MAGE-A3基因正确克隆在plRES2-EGFP／MAGE-A3,测序结果与GenBank公布的MAGE—A3序列一致。转染293T细胞后能检测到MAGE-A3基因和蛋白的表达。结论：成功构建plRES2-EGFP／MAGE—A3真核表达质粒,并能在293T细胞中有效表达MAGE—A3蛋白,奠定了其作为DNA疫苗应用的基础。     

pCMV －Myc －MyD88重组质粒构建及其在293 T细胞中的表达

目的：构建髓样分化因子88（MyD88）真核表达质粒,并检测其在293T细胞中的表达,为进一步研究应用奠定实验基础。方法从大鼠肝星状细胞株T－6中提取总RNA,应用PCR技术扩增MyD88基因编码序列片段,克隆入真核表达载体pCMV－Myc质粒中,对重组质粒经酶切和测序鉴定后,以钙离子转染法转染至293T细胞中,采用Western blot的方法检测MyD88蛋白的表达,以观察转染及表达效果。结果酶切及测序结果证明pCMV－Myc－MyD88重组质粒的DNA序列正确,将其转染至293T细胞后,MyD88蛋白表达明显增加。结论pCMV－Myc－MyD88重组质粒构建成功,并能在293T细胞中表达,为进一步研究针对MyD88分子的疾病治疗及其生物学功能奠定了实验基础。     

HBV X-HCV C融合基因重组腺病毒的构建及鉴定与表达

目的:应用重叠区扩增基因拼接法(gene SOEing)获得HBV X-HCV C融合基因,构建HBV X-HCV C融合基因重组腺病毒。方法:应用gene SOEing法扩增HBV X-HCV C融合基因并将其克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-XC,经PmeⅠ酶切线性化后电转化BJ/AdEasy菌,构建重组腺病毒质粒pAd-XC;鉴定正确的pAd-XC经Pac I酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装,扩增,利用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)监测病毒滴度和感染效率,Western-blot法检测目的蛋白的表达。结果:测序结果显示,pAdTrack-CMV-XC构建成功;PCR及Pac I酶切鉴定结果表明pAd-XC构建成功;经Pac I酶切线性化的pAd-XC转染293细胞后24 h即可观察到GFP的表达;回收的病毒可重复感染293细胞,Western-blot法检测到目的蛋白的表达,证实有感染能力且可表达目的蛋白的病毒颗粒包装成功。结论:HBV X-HCV C融合基因重组腺病毒构建成功,为进一步研究HBV X蛋白和HCV C蛋白的生物学功能奠定了基础。     

HCV结构基因腺病毒表达载体骨架质粒pAd.HCV-S的构建、鉴定及表达

目的：构建能表达HCV结构基因（C＋E1＋E2）的腺病毒表达载体的重组骨架质粒,为进一步包装能高效表达HCV结构基因的腺病毒载体做准备,方法：用分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的HCV结构基因上、下游引物,以含有HCVH株基因序列的质粒pBRTM/BCV1-3011为模板,通过PCR扩增获得HCV结构基因片段,基因片段回收后,以BglⅡ及HindⅢ双酶切,定向插入到腺病毒骨架质粒pAd.CMV-Link.1中CMV启动子下游BglⅡ及HindⅢ位点之间,获得重组表达质粒pAd.HCV-S.通过BglⅡ／HindⅢ双酶切、PCV及插入片段序列测定对质粒进行了鉴定。以抗HCVC单克隆抗体为一抗,利用间接免疫荧光法检测了pAd.HCV-S在人肝癌细胞7721中的瞬时表达。结果：酶切、PCR及测序鉴定证实,pAd.HCV-S插入片段为HCVCE1＋E2区基因片段,免疫荧光法检测表明其可以在7721细胞中瞬时表达。结论：构建的质粒pAd.HCV-S 可以表达HCV结构基因,为包装表达HCV结构基因的腺病毒载体奠定了基础。     

Math1基因重组慢病毒的构建及其在293T细胞中的表达

目的 构建携带Math1基因的重组慢病毒载体,检测其滴度,检测其在293T细胞中的表达.方法 PCR扩增Math1基因,将其连入慢病毒栽体pLenti-GFP中;在感受态细胞DH5α中培养扩增,并行Math1基因的测序鉴定;将重组的慢病毒四质粒共转染293T细胞,收获并浓缩病毒;感染293T细胞和提取细胞DNA后用实时定量PCR法检测病毒滴度.用逆转录PCR和westem blot法检测Mathl基因在感染病毒的293T细胞中的表达.结果 构建的慢病毒载体pLenti-Math1-GFP经测序分析证实基因序列正确.四质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光.包装后慢病毒测定滴度约为3X10"Tu/L.逆转录PCR和Western blot法均能检测Math1基因在感染病毒的293T细胞中的表达.结论 成功构建携带Math1基因的重组慢病毒,并能在293T细胞中表达.     

HBV preS2-S DNA免疫诱导小鼠体液免疫应答

目的:构建HBV表面抗原preS2-S基因表达质粒,并探讨其在小鼠体内的表达及诱导体液免疫应答的能力.方法:采用PCR方法,以PBR322-HBV2.0(adr亚型)质粒DNA为模板获得HBV preS2-S基因,并将其重组进入pcDNA3.0表达载体中,转染7721细胞系进行稳定表达;以此重组质粒免疫小鼠,ELISA方法检测免疫小鼠抗HBs抗体浓度.结果:构建了HBV preS2-S基因的表达质粒pcDNAS2-S,该表达质粒可在7721细胞中稳定高效表达;免疫接种小鼠2周后抗HBs抗体浓度明显升高,接种后第4周布比卡因处理组小鼠抗HBs抗体的浓度达到峰值161.4 mIU/ml,布比卡因非处理组第5周抗HBs抗体的浓度可达133.7 mIU/ml.结论:所构建的pcDNAS2-S表达质粒能有效表达并诱导小鼠体液免疫应答.     

丙肝病毒NS3-4A基因的重组杆状病毒穿梭载体的构建

目的通过克隆丙肝病毒非结构蛋白NS3-4A基因,构建表达HCV-NS3-4A基因的重组杆状病毒穿梭载体。方法设计合成HCV NS3-4A基因全长的特异性引物,应用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）扩增非结构蛋白区NS3-4A基因片段,经限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切后克隆到pFastbacDual上,并转化到大肠杆菌DH5α中,最后经PCR和双酶切鉴定转化菌落。结果扩增得到的基因片段长度为2.2kb,该片段成功克隆在杆状病毒穿梭载体pFastBacDual上,经测序证实为HCV NS3-4A基因,这表明HCV-NS3A基因重组杆状病毒穿梭载体构建成功。结论成功构建了表达HCV NS3-4A基因的杆状病毒穿梭载体,这将为下一步HCV杆状病毒载体疫苗的制备打下基础。     

HBV前C/C基因与绿色荧光蛋白基因融合表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的 :构建含HBV前C C基因与绿色荧光蛋白基因的融合表达载体 ,并在真核细胞中表达。方法 :用PCR法扩增含 1.3倍HBVayw型全基因组真核表达载体pHBV1.3的前C C基因片断 ,应用含绿色荧光蛋白基因的真核表达质粒构建融合表达载体 ,采用脂质体介导方法将其转染到HEK2 93细胞 ,并用荧光显微镜及ELISA法检测融合蛋白的表达。结果 :经PCR及酶切鉴定 ,证实成功构建了含HBV前C C基因的真核表达重组体pEGFP -HB VC ,显微镜下观察及ELISA法证实在HEK2 93细胞中表达了相应融合蛋白。结论 :构建的重组表达载体能在真核细胞中表达目的蛋白与GFP的双功能融合蛋白 ,适合于针对HBV前C C区的相关研究。     

丙型肝炎病毒核心区截短型基因真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的：建立截短的丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的真核表达载体，并在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中瞬时表达：方法：应用多聚酶链反应（PCR），以HCV-H株全长cDNA序列为模板，扩增获得C区羧基端部分缺失的基因片段，克隆人真核表达载体pcDNA3．1（-），并通过脂质体转染至CHO细胞。结果：构建了真核表达载体pcDNA3．1-Ct，成功转染CHO细胞，间接免疫荧光和RT-PCR证实pcDNA3．1-Ct在CHO细胞中表达截短型的C蛋白。结论：成功构建羧基端部分缺失的HCVC区基因的真核表达载体，瞬时转染CHO细胞，为进一步基因免疫和构建多表位卡介苗（BCG）活载体疫苗奠定基础。     

HCV核心和截短的包膜蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达及其抗原性

目的:构建含HCV全长核心基因和截短的包膜蛋白E2基因的重组杆状病毒表达载体,研究其表达和抗原性.方法:以含HCV全长cDNA克隆的pGEM-HCJ4质粒为模板,PCR扩增全长的HCV核心抗原基因和截短的E2基因片段,插入转座载体pFastBacHTa构建重组转座质粒pFB-CE2t,转化DH10Bac大肠杆菌,获得重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-CE2t,以之转染昆虫Sf 9细胞进行外源基因的表达,并对其抗原性进行ELISA检测.结果:SDS-PAGE和Western blot分析表明Bacmid-CE2t在Sf 9细胞表达了HCV C-E2蛋白,并能利用细胞内蛋白酶将其裂解为单独的C蛋白和截短的E2蛋白.纯化后的蛋白能分别与HCV C蛋白、E2蛋白单抗以及慢性丙型肝炎患者血清反应.结论:HCV核心蛋白和截短的E2蛋白在昆虫细胞中成功表达并具有抗原性.     

HCV E2和HBV preS融合蛋白真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)E2和乙型肝炎病毒(HBV)preS融合蛋白的真核表达载体.方法:用PCR方法扩增HBV preS和HCV E2蛋白基因,并将二者克隆到真核表达载体pcDNA3中,用脂质体转染试剂将其转入COS7细胞,通过免疫荧光检测细胞瞬时表达的融合蛋白.结果:E2-preS融合蛋白基因包括了全长的HBV preS和HCV E2蛋白基因,嵌合基因长度约1.6 kb.表达载体在COS7细胞表达出了E2-preS融合蛋白.结论:构建的E2-preS融合蛋白表达载体能在哺乳动物细胞中表达融合蛋白,为获得真核表达的融合蛋白及研究此蛋白的免疫原性打下基础.     

FXR1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建携带人脆性X相关基因1(FXR1)的真核表达载体pCMV-HA,为研究FXR1P互作蛋白奠定基础。方法以pYESTrp3-FXR1为模板进行聚合酶链反应(PCR)特异扩增FXR1基因片断,将扩增片段经EcoR I和XhoI双酶切后克隆到pCMV-HA载体,酶切鉴定阳性克隆并测序鉴定。结果成功构建了pC-MV-HA/FXR1真核表达载体。结论pCMV-HA/FXR1真核表达载体的构建为进一步在细胞内鉴定FXR1互作蛋白奠定了基础,从而对研究FXR1在脆性X综合征中的作用机理具有深远意义。     

丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建

目的：构建HCV NS5A/pCI-neo真核表达载体,转染Huh-7细胞系,为体外高效表达NS5A蛋白奠定基础。方法：用PCR方法从带有丙型肝炎病毒NS5A基因的pC DNA 3.1（+）/HCV NS345质粒中扩增出HCV NS5A基因,然后TA克隆于pGEM-T载体中,转化大肠杆菌JM109。阳性克隆经测序鉴定,再经双酶切消化后插入真核表达载体pCI-neo上,经酶切鉴定与测序证实。结果：用PCR方法扩增出HCV NS5A基因全序列,因其 cDNA的G+C含量高直接测序未成功,后经TA克隆,筛选得到的阳性克隆经测序鉴定,与设计的HCV NS5A基因序列完全一致。经酶切连接并成功插入pCI-neo上。结论：成功构建了高效表达丙型肝炎病毒NS5A基因的pCI-neo真核表达载体。