重组杆状病毒的构建及其产生HPV4病毒样颗粒

为得到HPV4病毒样颗粒（VLPs)，用EcoR I、Bam H I双酶酶切克隆载体pUHPV4-L1并回收1.5kb L1片段；将L1基因定向插入穿梭质粒pVL1 392中并与线形BaculoGold^TM DNA共转染昆虫细胞Sf-9，经胞内同源重组获得重组杆状病毒。对该重组病毒在细胞内的基因转录与表达进行检测得知，L1基因可特异性转录并表达一54.57ku特异性蛋白。该蛋白经透射电镜观察，呈现众多直径为50nm的圆形颗粒，为重组杆状病毒在胞内产生的HPV4 VLPs。     

谷氨酸脱羧酶重组杆状病毒表达载体的构建

谷氨酸脱羧酶 (ＧＡＤ)是胰岛β细胞的一种主要的自身抗原 ,与１型糖尿病细胞免疫和体液免疫均有密切关系。由于抗ＧＡＤ抗体是最重要的免疫学标志之一和可靠的早期诊断指标 ［１］,所以ＧＡＤ抗原的制备对１型糖尿病的早期诊断及其病因和机制的研究都具有重要意义。本实验将ＧＡＤ６５基因在真核细胞中的表达打下基础。１材料和方法１．１菌株Ｅ．ｃｏｉｌＤＨ５α和质粒 ｐＵＣ１８ -ＧＡＤ６５ 均为本室保存 ;ＲＮＡａｓｅ购自华美生物工程公司 ;限制性内切酶ＸｂａⅠ、ＥｃｏＲⅠ、ＰｓｔⅠ和Ｔ４-ＤＮＡ连接酶、ＤＬ -２０００Ｍａｒｋ…     

HIV—1gag—gp120嵌合基因重组杆状病毒载体的构建

目的：构建含有HIV-1(中国株）gag-gp120嵌合基因的重组杆状病毒表达载体。方法：利用基因重组技术将B亚型中株HIV-1的结构基因gag与gp120嵌合后再通过大肠杆菌/杆状病毒系统构建重组杆状病毒载体。结果：酶切电泳显示基因重组正确,电镜显示重组杆状病毒大量扩增。结论：含有B亚型HIV-1（中国株）gag-gp120嵌合基因的重组杆状病毒表达载体构建成功,为进一步研究Gag-gp120嵌合蛋白的表达及其生物学活性奠定了基础。     

庚型肝炎病毒NS3蛋白在杆状病毒载体中的表达及其抗原性研究

目的：利用Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ ＨＴ杆状病毒系统在Ｓｆ９昆虫细胞中表达庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）ＮＳ３蛋白,并对表达产物的免疫原性进行研究。方法：将ＨＧＶ ＮＳ３基因片段定向克隆至转座载体ｐＥａｓｔＢｓｃ ＨＴａ,转化ＤＨ１０Ｂａｃ感受态细胞,３７℃振荡培养４ｈ使发生转座,用抗生素平皿筛选重组ｂａｃｍｉｄ。脂质体介导转染Ｓｆ９昆虫细胞,待细胞形态明显改变后收获细胞和培养上清液,将上清液再次感染Ｓｆ９细     

EV71病毒P1和3CD基因共表达重组杆状病毒双顺反子穿梭载体的构建及鉴定

目的通过克隆EV71病毒结构前体蛋白P1和非结构蛋白3CD,构建共表达P1前体蛋白和非结构蛋白3CD的重组杆状病毒表达载体。方法设计合成EMCV病毒IRES序列的特异性引物,克隆至含有CMV启动子的杆状病毒穿梭载体pFastBacDual-CMV上,命名为pFBCMV-IRES。从手足口病重症患者分离EV71病毒株,经RT-PCR技术分别扩增出EV71病毒的P1前体蛋白区与3CD区的片段,定向克隆至杆状病毒穿梭载体pF-BCMV-IRES的IRES序列的上游和下游,随后转化到大肠杆菌DH5α中,经PCR和双酶切鉴定转化菌落。结果通过对重组杆状病毒穿梭载体pFBCMV-IRES-P1-3CD进行酶切和DNA序列分析,证明共表达EV71病毒P1和3CD基因的重组杆状病毒双顺反子穿梭载体构建成功。结论共表达EV71病毒P1和3CD基因重组杆状病毒双顺反子穿梭载体的成功构建,将为下一步制备EV71病毒的类病毒颗粒疫苗打下基础。     

介导人血红素加氧酶-1基因的重组腺相关病毒载体的构建

目的:构建含人血红素加氧酶-1(hHO-1)基因的重组腺相关病毒(AAV)载体并进行鉴定。方法:利用基因重组技术,采用限制性内切酶HindⅢ从质粒XM-6/hHO-1中将目的基因hHO-1基因片段切出,克隆到质粒PAAV-MCS的HindⅢ位点中,构建重组质粒pAAV-hHO-1,采用限制性内切酶酶切,PCR和DNA测序鉴定。结果:PCR扩增出1 317 bp大小的片段,酶切鉴定证实插入位点及方向与预期的完全一致;测序证实hHO-1与Gene Bank提供的原始序列完全一致。结论:成功构建了含hHO-1基因的重组腺相关病毒载体,为缺血性疾病基因治疗的研究奠定了基础。     

一种通用型重组2型腺伴随病毒载体的构建及外源基因表…

以野生型２型人腺伴随病毒（ＡＡＶ－２）基因组载体ｐＳＳＶ９－ｉｎｔ＾－为基础，构建了一种携带和表达真核基因的基础ＡＡＶ载体ｐＳＳＶ９／ＭｕｌＶ－ｎｅｏｓｖ，表达了ｎｅｏ基因，并采用该载体组建了携带人白细胞介素－２ｃＤＮＡ的重组ＡＡＶ载体ｐＳＳＶ９／ＭｕｌＶ－ｎｅｏｓｖ－ＩＬ２，转染Ａ５４９细胞后表达了人白细胞介素－２基因。为应用腺伴随病毒作基国治疗研究提供了实验基础。     

HIV-1 gag-gp120嵌合基因重组杆状病毒载体的构建

目的 :构建含有 HIV- 1(中国株 ) gag- gp12 0嵌合基因的重组杆状病毒表达载体。方法 :利用基因重组技术将 B亚型中国株 HIV- 1的结构基因 gag与 gp12 0嵌合后再通过大肠杆菌 /杆状病毒系统构建重组杆状病毒载体。结果 :酶切电泳显示基因重组正确 ,电镜显示重组杆状病毒大量扩增。结论 :含有B亚型 HIV- 1(中国株 ) gag- gp12 0嵌合基因的重组杆状病毒表达载体构建成功 ,为进一步研究Gag- gp12 0嵌合蛋白的表达及其生物学活性奠定了基础。     

日本血吸虫Sj16基因重组杆状病毒的构建和鉴定

目的利用杆状病毒-昆虫细胞系统构建日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj)Sj16基因重组杆状病毒。方法从日本血吸虫尾蚴提取总RNA,通过RT-PCR扩增出Sj16基因全编码区序列,将其克隆到载体pET30a(+)中,通过PCR将Sj16基因连同pET30a(+)多克隆位点下游的6×His·Tag一起扩增出来,插入donor载体pFastBacHTa中,构建重组杆状病毒donor载体pFastBacHTa-Sj16-His,转化大肠杆菌DH10Bac-GFP进行转座,提取重组Bacmid,用Lipofectin法转染昆虫细胞Sf9使其包装成有感染性的重组杆状病毒。结果构建了含日本血吸虫Sj16基因的重组Bacmid-GFP-Sj16-His,转染Sf9细胞后,获得了有感染力的重组杆状病毒。结论成功构建了日本血吸虫Sj16基因重组杆状病毒,为下一步重组Sj16蛋白表达和Sj16基因功能研究打下了基础。     

人VEGF基因昆虫杆状病毒表达载体的构建

为了在昆虫杆状病毒表达系统表达人血管内皮细胞生长因子 (VEGF)基因 ,用HindⅢ对 pcDNA3 .1 /VEGF进行酶切 ,回收 5 75bp的VEGF片段 ,与 pFastBacI载体连接 ,得到含VEGF基因的转座载体 pFast/VEGF ,NcoI酶切鉴定方向 ;将其转化到含有穿梭载体杆粒 (Bacmid)的DH1 0Bac感受态细胞 ,得到重组杆状病毒穿梭载体Bacmid/VEGF ,采用琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增对重组转座载体、穿梭载体进行鉴定。将Bacmid/VEGF转染sf 9细胞 ,进行病毒重组及噬斑筛选。结果 :琼脂糖电泳得到杆粒 (Bacmid)DNA条带 ,PCR扩增得到 5 75bp的VEGF片段 ,病毒液在 1 0 - 7稀释度时出现噬斑 ,约 5 0个 /孔。说明已成功构建了重组杆状病毒穿梭载体并重组出杆状病毒。     

丙型肝炎病毒Core基因重组表达载体Pet32a-Core的构建

目的扩增丙型肝炎病毒核心区（HCV-Core）基因，并构建HCV-Core基因的重组表达载体。方法设计合成HCVCore基因全长引物，提取丙型肝炎患者血清中的HCVRNA，应用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）扩增c区基因片段，用限制性内切酶BamH1和SaL1双酶切后，连接到Pet32a表达载体中，并转化到BL21大肠杆菌中：然后PCR和双酶切鉴定转化茵落。结果扩增得到目的基因长度约600bp，经测序证实为HCV-Core基因，表明HCV-Core基因重组表达载体Pet32a-Core构建成功。结论成功构建HCV-Core基因表达载体Pet32a-Core，为下一步Core蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备奠定基础。     

HCV NS4B表达载体的构建及其对细胞凋亡的影响

目的构建丙型肝炎病毒（HCV）2a 型非结构蛋白4B（NS4B）的真核表达载体,并观察其对骨肉瘤细胞U2OS凋亡的影响。方法以质粒PJFH1为模板,通过PCR反应扩增4 目的基因片段,采用同源重组法与PCMV-tag2b 载体相连,转化大肠杆菌感受态DH5α,筛选正确的克隆。以脂质体为介导转染U2OS 细胞,通过Western blot 检测NS4B蛋白的表达,免疫荧光检测细胞的凋亡。结果构建pCMV-tag2b-NS4B 重组质粒,经测序其与NCBI 公布的序列完全一致,并可在U2OS 细胞中表达,DAPI 检测显示细胞凋亡率为（17.25±2.5）%,对照组凋亡率为（6.53±2.36）%。结论成功构建NS4B 的真核表达载体,并可在U2OS 细胞中表达,诱导细胞凋亡。     

HCV E2和HBV preS融合蛋白真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)E2和乙型肝炎病毒(HBV)preS融合蛋白的真核表达载体.方法:用PCR方法扩增HBV preS和HCV E2蛋白基因,并将二者克隆到真核表达载体pcDNA3中,用脂质体转染试剂将其转入COS7细胞,通过免疫荧光检测细胞瞬时表达的融合蛋白.结果:E2-preS融合蛋白基因包括了全长的HBV preS和HCV E2蛋白基因,嵌合基因长度约1.6 kb.表达载体在COS7细胞表达出了E2-preS融合蛋白.结论:构建的E2-preS融合蛋白表达载体能在哺乳动物细胞中表达融合蛋白,为获得真核表达的融合蛋白及研究此蛋白的免疫原性打下基础.     

稳定表达丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶的HepG2细胞克隆的建立

目的：构建丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶（scNS4A／NS3）的真核表达载体;建立重组质粒稳定转染的HepG2细胞克隆．方法：根据文献报道设计扩增scNS4A／NS3编码基因的引物,从HCV阳性患者血清中提取病毒RNA,RT-PCR方法扩增出scNS4A／NS3基因片段,BamH Ⅰ／HindⅢ双酶切后连接到经同样酶切的真核表达载体pcDNA3,1（-）,转化菌株JM109感受态细胞,获得重组质粒pcDNA3．1（-）～scNS4A／NS3,经酶切鉴定及序列测定．将阳性重组质粒用脂质体法转染HepG2细胞,经持续G418压力选择和克隆化获得稳定转染的细胞系,用RT-PCR,IFA,Western-blot证实该稳定细胞系可以表达单链丝氨酸蛋白．结果：成功构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-scNS4A／NS3;建立了稳定转染的HepG2细胞克隆,命名为scpHepG2．结论：获得稳定的scpHepG2细胞克隆可表达单链丝氨酸蛋白,为下一步建立以细胞为基础的评价抗HCV丝氨酸蛋白酶药物系统奠定基础．     

肝细胞癌组织中丙型肝炎NS3蛋白对P53蛋白表达的影响

目的探讨肝细胞癌（ＨＣＣ）及其癌旁肝组织中丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ３蛋白对Ｐ５３蛋白表达的影响及其在肝癌发生中的作用。方法用免疫组织化学技术检测４７例乙型肝炎病毒阴性的ＨＣＣ及其癌旁肝组织中ＨＣＶＮＳ３蛋白和Ｐ５３蛋白的表达。结果ＨＣＶＮＳ３蛋白在ＨＣＣ中的阳性率（６２％）明显低于癌旁肝组织（８３％）,Ｐ＜００２５。癌组织中其表达强度与癌细胞分化程度呈相关性（Ｐ＜００２５）。Ｐ５３蛋白在癌组织中的阳性率（８１％）明显高于癌旁组织（４７％）,Ｐ＜００２５;癌细胞分化愈差,表达愈强（Ｐ＜００５）;癌组织中Ｐ５３蛋白表达与ＨＣＶＮＳ３蛋白的表达无相关性（Ｐ＞０５）,而癌旁肝组织中两者表达呈显著相关性（Ｐ＜００１）,ＨＣＶＮＳ３蛋白阳性患者中Ｐ５３蛋白表达明显高于ＨＣＶＮＳ３阴性病例,Ｐ＜００５。结论ＨＣＶＮＳ３蛋白可能是在肝细胞转化早期通过内源性机制间接作用于Ｐ５３基因使其突变导致肝细胞癌变。     

人胃蛋白酶原A基因原核表达载体构建及鉴定

目的构建人胃蛋白酶原A(Pepsinogen A)原核表达载体,用于下一步人胃蛋白酶的表达。方法以Pepsinogen A CDNA为模板,利用PCR技术扩增Pepsinogen A基因,与pMD18-T载体相连构建载体pMD18-T/Pepsinogen A,提取质粒进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切并测序鉴定,插入原核表达载体pET30a的相应位点,构建原核表达载体pET30a-Pepsinogen A,经菌落PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切分析鉴定重组质粒。结果 PCR扩增出约1 000bp的Pepsinogen A基因片段,经酶切和测序验证Pepsinogen A基因正确;克隆至表达载体后,菌落PCR及双酶切证明pET30a-Pepsinogen A原核表达载体构建成功。结论成功构建了pET30a-Pepsinogen A原核表达载体,为进一步分析研究人胃蛋白酶提供了实验基础。     

7株不同原核质粒表达丙型肝炎核心蛋白的差异研究

目的通过比较不同原核质粒表达丙型肝炎核心蛋白(CORE)的差异,筛选出能高效表达CORE的原核质粒。方法用PCR扩增并获得CORE基因,扩增产物分别构建到7种不同原核表达质粒中,重组质粒用IPTG诱导表达,聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)初步鉴定表达产物,并经Western blot验证。结果 PCR及双酶切验证表明CORE基因成功构建到7种原核质粒中,SDS-PAGE验证各融合质粒表达目的蛋白存在差异,其中pTrc-CKS-CORE及Pmbp-C-CORE可见相应的融合蛋白表达,以pTrc-CKS-CORE表达量高,表达产物经Western blot验证表达成功。结论成功构建7株不同CORE原核表达质粒,各融合质粒表达CORE存在较大差异,筛选出高表达CORE质粒,为下一步研究奠定基础。     

丙型肝炎病毒NS5区部分基因的克隆和表达及其抗体动态研究

分析丙型肝炎病毒ＮＳ５蛋白的抗原性,研究抗－ＮＳ５抗体的性质,动态变化规律及临床诊断意义。方法 用Ｇｏｌｄｋｅｙ程序对ＮＳ５蛋白的抗原决定簇进行预测分析,以ＲＴ－Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ方法扩增ＮＳ５基因片段,并进行核酸序列分析。通过基因体外重组技术克隆表达目的的基因。     

HCV结构基因腺病毒表达载体骨架质粒pAd.HCV-S的构建、鉴定及表达

目的：构建能表达HCV结构基因（C＋E1＋E2）的腺病毒表达载体的重组骨架质粒,为进一步包装能高效表达HCV结构基因的腺病毒载体做准备,方法：用分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的HCV结构基因上、下游引物,以含有HCVH株基因序列的质粒pBRTM/BCV1-3011为模板,通过PCR扩增获得HCV结构基因片段,基因片段回收后,以BglⅡ及HindⅢ双酶切,定向插入到腺病毒骨架质粒pAd.CMV-Link.1中CMV启动子下游BglⅡ及HindⅢ位点之间,获得重组表达质粒pAd.HCV-S.通过BglⅡ／HindⅢ双酶切、PCV及插入片段序列测定对质粒进行了鉴定。以抗HCVC单克隆抗体为一抗,利用间接免疫荧光法检测了pAd.HCV-S在人肝癌细胞7721中的瞬时表达。结果：酶切、PCR及测序鉴定证实,pAd.HCV-S插入片段为HCVCE1＋E2区基因片段,免疫荧光法检测表明其可以在7721细胞中瞬时表达。结论：构建的质粒pAd.HCV-S 可以表达HCV结构基因,为包装表达HCV结构基因的腺病毒载体奠定了基础。