HLA-G5-IgGFc融合蛋白真核表达载体的克隆及鉴定

目的构建人HLA-G5-IgGFc融合蛋白真核表达载体。方法经重组PCR将HLA-G5和IgGFc基因拼接并插入T载体。鉴定后,双酶切得到融合基因并插入真核表达载体pcDNA3.1。结果PCR、限制性内切酶酶切和序列分析表明已构建pcDNA3.1-HLA-G5表达载体。结论成功构建了HLA-G5-IgGFc段融合蛋白真核表达载体。     

IL-2/Fc融合基因真核表达载体的构建和表达

目的：构建含人IL-2 cDNA基因和免疫球蛋白Fc片段融合基因的真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在真核细胞中表达，以期用于乙型肝炎病毒(HBV)DNA疫苗的研究。方法：应用重叠延伸剪切技术(SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段IL-2／Fc，回收后克隆到中间pGEM—T：Easy TA克隆载体，得到合适的酶切位点后，用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA 3．1中，得到真核重组载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc。然后用脂质体法转染SP2／0细胞。结果：对重组载体进行限制性酶切鉴定及测序分析，证明连接正确；经ELISA检测证实，该重组载体能够在真核细胞中外分泌表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在SP2／0细胞中有效表达。     

三叶因子2基因真核表达载体的构建

目的：构建TFF2-pcDNA3．1真核表达载体．方法：应用体外基因拼装方法合成TFF2,然后TA克隆于pGM—T easy载体中．阳性克隆经测序鉴定．再经双酶切消化后,插入真核表达载体pcDNA3．1上,经酶切鉴定与测序证实．结果：合成的TFF2经TA克隆后,筛选得到的阳性克隆,经测序鉴定,与设计的TFF、2基因序列完全一致．经酶切连接并成功插入pcDNA3．1上．结论：成功构建了TFF2基因的真核表达载体,为以后的胃溃疡研究奠定了基础．     

人核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人核心蛋白聚糖（DCN）真核表达载体,为进一步研究其生物学活性奠定基础。 方法：采用聚合酶链反应（PCR）扩增目的片段,PCR产物及真核表达载体pcDNA3分别双酶切后进行连接,并转化入大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体。 结果：PCR获得与预期大小一致的、约1 000 bp的特异性DNA片段,PCR产物与表达载体经双酶切后连接,构建重组载体pcDNA-dec,经双酶切鉴定及测序证实,人DCN基因cDNA片段正确插入真核表达载体中。结论：成功构建人DCN真核表达载体pcDNA-dec。     

人巨噬细胞金属弹力酶催化域基因的克隆及表达

目的克隆人巨噬细胞金属弹力酶催化域（HMEcd）基因,构建原核表达质粒,在大肠杆菌中表达HMEcd基因融合蛋白。方法用RT-PCR方法提取人胃癌组织总RNA并扩增出HMEcd cDNA,克隆入pMD18-T载体,构建克隆载体pMD18-T-HM Ecd,双酶切鉴定及DNA测序正确后再将HMEcd cDNA亚克隆至pET-28a（＋）载体,构建原核表达载体pET-28a（＋）-HM Ecd,转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,并行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果RT-PCR获得预期的HMEcd cDNA,双酶切鉴定及DNA测序证实将HM Ecd基因分别正确插入克隆载体和原核表达载体中,SDS-PAGE及Western blotting鉴定证实表达出HMEcd融合蛋白。结论成功表达出HMEcd基因融合蛋白,为进一步功能实验研究奠定基础。     

人乳头瘤病毒16型E6蛋白真核表达载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的人乳头瘤病毒16型早期蛋白6真核表达载体pcDNA3．1（-），E6，为研究HPV16 E6蛋白在细胞永生化作用中的机制奠定实验基础。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增E6基因。将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接，经蓝白斑筛选、双酶切鉴定及序列分析后，亚克隆至pcDNA3．1（-）真核表达载体中；阳性克隆经双酶切鉴定后转染RAW264．7巨噬细胞，Western blotting鉴定其在RAW264，7细胞中的表达。结果重组载体经酶切、PCR及测序证明插入片断序列正确无误，转染RAW264．7细胞后可在细胞中表达HPV16E6蛋白。结论成功构建的HPV16E6真核表达载体pcDNA3，1（-）／E6能在RAW264．7细胞中表达E6蛋白。     

阿片肽结合蛋白真核表达载体的构建

目的：构建阿片肽结合蛋白的真核表达载体。方法：从人卵巢上皮组织中提取总RNA进行反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）,扩增出阿片肽结合蛋白（OPCML）基因片段,与真核表达载体pcDNA4/HisMaxB连接,得到重组载体pcDNA4/HisMaxB-OPCML,并酶切鉴定和测序。结果：真核表达载体pcDNA4/HisMaxB-OPCML中OPCML基因的序列和插入方向均正确。结论：本实验成功构建了阿片肽结合蛋白真核表达载体。     

表达载体sHLA-A2-IgG1-Fc的构建与鉴定

目的构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgGl-Fc,为进一步真核表达可溶性HLA-A2-IgG1-Fc蛋白奠定基础。方法从T2细胞中提取总RNA,借助RT-PCR技术扩增包括信号肽的可溶性HLA-A2的cDNA序列并把其插入真核表达载体pcDNA3.0,然后经酶切和测序法鉴定;用PCR的方法从含IgG1-Fc基因的PIG质粒中扩增目的基因IgG1-Fc段,然后经酶切后插入前面构建好的表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2中,最后经酶切和测序法鉴定。结果经酶切鉴定及测序分析,证实已将目的基因HLA-A2和IgG1-Fc片段插入载体pcDNA3.0。结论本研究成功构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgG1-Fc。     

人IGF-I基因真核表达质粒pIRES2-EGFP-IGF-I的构建

目的利用基因工程原理构建人胰岛素样生长因子I(IGF—I)全长基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-IGF-I。方法应用PCR方法从人肝细胞eDNA文库中提取人IGF-I全长cDNA序列，克隆人T载体pMDl8中，经测序证实序列正确后，进行双酶切并定向插入真核表达载体pIRES2-EGFP中，利用双酶切、电泳和PCR证实插入片段的正确性。结果经测序证实，目的基因人IGF-I的全长基因序列被正确扩增；构建的真核表达载体经双酶切和PCR鉴定证实，hIGF-I被定向插入到真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点中：结论利用基因工程原理可以正确地构建人IGF-I全长基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-IGF-I。     

HGFK1基因真核表达载体的构建及鉴定研究

目的构建携带人HGFK1基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）-HGFK1。方法通过PCR方法从已经构建好的病毒穿梭载体中扩增出HGFK1基因,构建pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表达载体,经PCR、酶切、测序、蛋白表达等方法进行鉴定。结果PCR、酶切、测序以及蛋白表达证实pcDNA3.1（-）-HGFK1载体序列正确。结论本研究成功构建了pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表达载体,可为后续进行肝癌细胞的生物学研究提供帮助。     

乙酰肝素酶稳定表达细胞株的建立

目的：在真核细胞中表达人乙酰肝素酶（HPA）并建立该酶的稳定表达细胞株。方法：构建包含人乙酰肝素酶全长编码序列的真核表达载体pcDNA-hpaFL，转染CHO-K1细胞，G418筛选稳定表达细胞株。通过RT-PCR，Western-blot分析与鉴定蛋白的表达；用荧光HPLC法检测蛋白的活性．结果：在CHO-K1细胞中成功地表达出有活性的人乙酰肝素酶，并获得该酶的稳定表达细胞株。结论：成功地建立了人乙酰肝素酶稳定表达细胞株，为其抑制剂的筛选及其功能的研究奠定了基础。     

人卵巢癌组织乙酰肝素酶基因的全长扩增及真核载体的构建

目的通过基因工程技术,扩增出乙酰肝素酶基因全长,构建其真核载体。为进一步研究乙酰肝素酶与卵巢癌浸润转移的关系打下基础。方法选取浆液性卵巢癌组织作为模板提取人卵巢癌组织总mRNA,RT-PCR技术扩增cDNA,利用PCR技术进行乙酰肝素酶基因全长的扩增。将其与真核表达载体pcDNA3.1连接,进行克隆及酶切和测序鉴定。结果成功扩增出目的基因全长,并经测序验证其同源性达100%。结论采用基因工程技术成功从恶性卵巢癌组织中扩增出HPSE全长并构建了其真核表达载体。     

人趋化因子受体CCR6的克隆、表达及其功能分析

目的构建人趋化因子受体6（CCR6）cDNA序列的真核表达载体．并在HEK293细胞中表达．为研究CCR6生物学功能和筛选CCR6拮抗剂奠定基础。方法采用RT-PCR方法从人扁桃体克隆CCR6受体的DNA片段．并将该片段插入真核表达质粒pcDNA3．1（＋）中,构建重组真核表达质粒pcDNA3、1（＋）-CCR6;将该质粒pcDNA3、1（＋）-CCR6转染HEK293细胞．用流式细胞术检测转染pcDNA3．1（＋）-CCR6质粒的HEK293细胞;采用体外趋化实验、钙流实验,验证转染pcDNA3.1（-）．CCR6质粒的HEK293细胞表面表达的CCR6的生物学活性。结果经RT-PCR获得了编码人CCR6受体的DNA片段．构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-CCR6：转染HEK293细胞．经流式细胞仪检测、趋化实验、钙流实验证实．表达CCR6的HEK293细胞具有趋化因子受体CCR6的生物学活性。结论重组人趋化因子受体CCR6克隆成功．并在HEK293细胞中获得了表达．为研究CCR6的生物学功能及筛选CCR6拮抗剂奠定了基础。     

DDR2/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建DDR2/Fc真核表达载体,使其在HEK293细胞中进行表达. 方法:采用PCR技术,分别从大鼠脑组织、含人IgG1 Fc全长互补DNA(cDNA)的质粒中扩增出盘状结构域受体2(DDR2)的DS区域、Fc段,以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,获得重组表达载体DDR2/Fc-pcDNA3.1(-);采用脂质体转染技术转染HEK293细胞; RT-PCR、免疫印迹检测融和蛋白的表达. 结果:DNA测序和限制型酶切鉴定证明两段基因正确克隆至pcDNA3.1(-)的多克隆位点,细胞裂解物中检测到融合蛋白的表达,其分子质量与预期大小一致,该融合蛋白能正确表达于HEK293细胞中. 结论:成功构建了DDR2/Fc融和表达载体,表达了融合蛋白.     

携带FLAG标签的人BTG2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达 

目的：构建人B细胞易位基因2（BTG2）真核表达载体,并在HeLa细胞中表达携带FLAG标签的BTG2蛋白,为阐明BTG2基因的功能提供实验工具。方法：利用PCR法获得全长BTG2片段,将扩增得到的片段插入真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点;然后按照FLAG序列设计并合成寡核苷酸片段,插入pcDNA3.1(+)-BTG2载体,构建pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2载体;将以上重组质粒转染HeLa细胞,将细胞分为转染pcDNA3.1(+)空载体组、转染pcDNA3.1(+)-BTG2组和转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组,采用抗FLAG抗体的Western blotting法,检测FLAG-BTG2融合蛋白在HeLa细胞中的表达水平。结果：将全长BTG2片段链接于pcDNA3.1(+)质粒,经限制性核酸内切酶BamH Ⅰ酶切分析及DNA测序证实载体序列准确;该载体转染HeLa细胞后用抗FLAG 抗体进行Western blotting法检测,在空载体组和pcDNA3.1(+)-BTG2组HeLa细胞中检测不到FLAG融合蛋白的表达,而在转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组中检测到FLAG-BTG2融合蛋白的表达。结论：成功构建了pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2真核表达载体,并能在HeLa细胞中有效表达携带FLAG标签的BTG2蛋白。     

结核分枝杆菌热休克蛋白65与汉坦病毒G2糖蛋白融合基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65（HSP65）和汉坦病毒G2糖蛋白重组融合基因为基础的真核表达载体。为进一步研究其在结核病和出血热防治中的作用奠定基础。方法 采用聚合酶链反应从结核分枝杆菌H37Rv株基因中．扩增出HSP65的编码基因，从T-H8205G2质粒扩增出G2糖蛋白的编码基因．经相应限制性核酸内切酶消化后．插入真核表达载体pcDNA3．1／His，并将此重组质粒通过脂质体介导转染NIH3T3细胞．用SDS-PAGE、免疫组织化学及免疫荧光方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性。结果 获得正向插入的pcDNA3.1/ His-HSP65-G2重组表达质粒，表达产物的相对分子量为105kD．与理论预期大小一致．并且可与汉坦病毒H8205株的腹水抗体和HSP65单抗起特异反应。表明构建的pcDNA3．1／His-HSP65-G2能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性。结论 编码HSP65和G2抗原基因的重组基因的真核表达载体构建成功。     

人CTLA-4Ig融合基因减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体的构建及表达

目的构建能稳定表达人CTLA4 Ig融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体,探讨其在哺乳动物细胞中的表达并对表达产物进行鉴定。方法用touchdown PCR法扩增CTLA-4 Ig融合基因,将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3.1( ),构建pcDNA3.1( )-CTLA-4 Ig,用电穿孔仪转入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207。将表达质粒转染COS-7细胞,SDS-PAGE、W estern b lot检测转染细胞裂解上清中目的蛋白的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。在pcDNA3.1( )-CTLA-4 Ig质粒转染后48 h细胞裂解上清中,检测到CTLA-4 Ig融合蛋白的表达,该蛋白能与抗人CTLA-4单抗特异结合。结论成功构建了能稳定表达人CTLA4 Ig融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体,并在哺乳动物细胞中成功表达有生物学活性的重组人CTLA-4 Ig蛋白。     

乙酰肝素酶基因siRNA表达载体的构建及其沉寂作用

目的:构建针对人乙酰肝素酶(HPSE)基因的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对HPSE基因的干扰作用。方法:设计HPSE靶向的发夹状siRNA,合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pRNATU6.1载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹转染人恶性黑素瘤细胞A375,采用半定量PCR测定HPSE基因RNA水平变化,Western blot检测HPSE蛋白表达的变化。结果:将针对HPSE基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆到pRNATU6.1载体,经过阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确;转染A375细胞后,半定量PCR和Western blot检测显示,HPSE基因和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。结论:成功构建了针对HPSE基因的siRNA载体,转染细胞后可抑制HPSE的表达。     

结核分枝杆菌免疫优势抗原ESAT-6真核表达载体的构建及蛋白表达的鉴定

目的　克隆并表达结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT 6的编码基因 ,为研究其免疫功能奠定基础。方法　以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板 ,用PCR对ESAT 6基因进行扩增 ,扩增产物克隆到真核表达载体pcDNA3 1/Zeo( )中。对重组表达载体pcDNA ESAT 6进行酶切、PCR及测序鉴定。经鉴定无误的重组质粒用DEAE 葡聚糖法转染COS 7细胞 4 8h后 ,用Trizol法提取转染细胞总RNA进行RT PCR鉴定。结果　重组质粒pcDNA ESAT 6构建成功 ,并能在COS 7细胞中有效表达。结论　结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT 6真核重组表达质粒pcDNA ESAT 6构建成功 ,为进一步研究ESAT 6和CFP 10的免疫原性、免疫保护性及其二者之间的相互作用奠定了基础     

结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6基因测序质粒及真核表达重组质粒的构建

目的 构建结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT—6基因测序质粒及真核表达重组质粒，为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础。方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，用PCR法对基因ESAT—6进行扩增，将扩增的产物连接于测序载体pUCm—T上，经测序反应确定无误，再将PCR反应产物经酶切后，克隆于真核表达载体pcDNA3．1( )上。结果 构建了结核杆菌基因ESAT—6的重组测序质粒，并对其进行了测序。真核表达重组质粒pcDNA3．1( )—ESAT—6亦构建成功。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT—6真核表达重组质粒的成功构建为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及相应抗原、抗体的制备打下基础。