人脂联素受体1和2的真核表达

目的 扩增和表达人脂联素受体1（AdipoR1）和人脂联素受体2（AdipoR2）基因。方法 利用RT-PCR方法扩增AdipoR1和AdipoR2全长cDNA。将AdipoR1和AdipoR2的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3．1。重组质粒转染HEK293细胞。通过免疫荧光技术标记HEK293细胞的AdipoR1和AdipoR2融合蛋白，共聚焦显微镜观察AdipoR1和AdipoR2在细胞中的定位。结果 成功构建真核表达重组质粒pcDNA3．1-adipoR1和pcDNA3．1-adipoR2．重组质粒转染HEK293细胞后。定位于HEK293细胞膜上。结论 AdipoR1和AdipoR2重组质粒的构建和在HEK293细胞中的成功表达。为进一步研究其与胰岛素抵抗的关系创造了条件。     

人β3肾上腺素受体真核表达质粒pcDNA3.1(+)-β3-AR的构建及表达

目的构建人β3肾上腺素受体(β3-AR)的真核表达质粒pcDNA3.1( )-β3-AR,并通过脂质体介导转染HEK293细胞使之表达该受体蛋白。方法以pENTR_ADRB3-Stop质粒为模板,采用PCR法扩增出人β3-AR cDNA,将其插入真核表达载体pcDNA3.1( )中,构建成真核表达质粒pcDNA3.1( )-β3-AR。将该质粒转染HEK293真核细胞,通过RT-PCR检测β3-AR mRNA在HEK293细胞内的表达,通过免疫荧光法检测β3-AR蛋白在HEK293细胞中的表达。结果酶切和DNA测序鉴定均证实重组质粒含有人β3-AR编码区全长。在转染重组质粒pcDNA3.1( )-β3-AR的HEK293细胞中检测到了β3-AR基因的转录和翻译产物。结论通过基因工程方法成功构建了β3-AR的真核表达质粒pcDNA3.1( )-β-AR,为进一步建立β-AR的稳定表达细胞株,用于筛选高效、高选择性β-AR激动剂奠定了基础。     

靶向CCR7基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的设计并构建靶向CCR7基因shRNA真核表达质粒,并检测其干扰效果。方法以CCR7为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pGC-silencer-CRM30载体,构建的3条重组短发夹shRNA表达载体分别命名为pGC-silencer-CRM30-CCR7A、-CCR7B和-CCR7C。采用测序法鉴定寡核苷酸序列。将构建好的真核表达载体转染人结肠癌SW480细胞,荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR法检测CCR7干扰效率。结果重组质粒测序结果与Genebank中的CCR7 cDNA序列相符,转染SW480细胞后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白,RT-PCR结果表明,pGC-silencer-CRM30-CCR7C干扰效果最强。结论靶向CCR7基因shRNA表达载体构建无误,为进一步探讨趋化因子受体CCR7在胃肠道恶性肿瘤生物学行为中的作用奠定了基础。     

携EGFP的人低氧诱导因子-1α真核表达载体的构建及表达

目的 构建携EGFP的人低氧诱导因子（HIF-1α）真核表达载体，为研究人HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用奠定基础。方法 采用分子克隆技术，KpnⅠ、XbaⅠ双酶切pcDNA3．1／V5-Hin—HIF-1仅获得HIF-1仅cDNA，克隆到质粒pcDNA3．1（＋），得到质粒pcDNA3．1（＋）-HIF-1α，以KpnⅠ，ApaⅠ双酶切质粒pcDNA3．1（＋）-HIF-1仅获得HIF-1α cDNA，克隆到质粒pEGFP—c1得到pEGFP-HIF-1α-c1质粒。脂质体法转染HEK293细胞，用荧光显微镜和Western blotting检测EGFP和HIF-1α 在HEK293细胞的表达。均显示融合蛋白在细胞中表达。结果经酶切鉴定及PCR证实重组pEGFP-HIF-1α-c1质粒构建成功。荧光显微镜和Westom blotting显示EGFP和HIF-1α融合蛋白在HEK293细胞中表达。结论 成功构建重组真核表达载体pEGFP—HIF-1α—c1并在HEK293细胞表达，为冠心病的HIF-1基因治疗研究奠定更直观的基础。     

PSNAV2-CTGF重组质粒构建及其在人胚肾293细胞中的表达

目的 构建含人结缔组织生长因子（CTGF）的腺相关病毒（AAV）表达载体,并观察其在人胚肾293（HEK293）细胞中的表达。方法 以含有人CTGF基因序列的质粒pCMV-SPORT6为模板,应用PCR克隆出CTGF基因,采用分子克隆的方法把CTGF克隆到AAV表达载体pSNAV2.0上构建重组质粒pSNAV2-CTGF。把重组质粒转染HEK293细胞,用免疫荧光法对重组质粒目的蛋白的表达进行研究,MTT法检测细胞培养上清液中CTGF蛋白的生物学活性。结果 成功构建完全正确的CTGF基因序列的AAV表达载体pSNAV2-CTGF,将其转染HEK293细胞后,免疫荧光检测到目的蛋白的表达,转染后的细胞上清具有促使成纤维细胞增殖的生物学活性。结论 成功构建了真核表达载体pSNAV2-CTGF,转染HEK293细胞后能够表达具有生物学活性的CTGF蛋白。     

成纤维细胞生长因子受体FGFR1真核表达质粒的构建及其在HEK293T细胞的表达

目的建立一个有效表达FGFR1的真核系统。方法从人胎盘组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增得到FGFR1基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1上,构建成pcDNA3.1-FGFR1质粒表达载体,并在HEK293T细胞重组表达;将pcDNA3.1-FGFR1质粒转染HEK293T细胞,通过免疫印迹和免疫荧光检测FGFR1在细胞中的表达情况。结果扩增的FGFR1序列与数据库一致;通过构建表达载体和转染细胞实现了FGFR1c DNA在HEK293T细胞膜上的表达。结论成功扩增出FGFR1 c DNA基因,经过转染HEK293T细胞,实现了FGFR1在HEK293T细胞的高效表达。     

人β4GalTⅡ基因在哺乳动物细胞株中的表达与定位

目的：运用基因克隆技术构建人源β1,4-半乳糖转移酶Ⅱ（β4GalTⅡ）真核表达质粒,并将其转染到 COS7细胞中,观察蛋白在细胞内的定位,同时转染到 HEK 293T 细胞中检测其表达。方法分别设计带 FLAG 标签和 GFP 标签的β4GalTⅡ基因的特异性引物,以含人β4GalTⅡ全长 cDNA序列为模板,定向构建到 pcDNA3．1（＋）及 pCDGFP 真核表达载体中,构建重组表达质粒。通过酶切和测序鉴定阳性重组质粒,利用 Lipofectamine 2000分别转染 COS7、HEK 293T细胞,免疫荧光显微镜观察重组蛋白在细胞内的定位,West-ern blot 法鉴定重组蛋白的表达。结果成功构建 pcD-NA3．1-β4GalTⅡ-FLAG 和 pCDGFP-β4GalTⅡ重组表达载体,定位实验表明：β4GalT Ⅱ-FLAG 和 GFP-β4GalT Ⅱ二者在COS7细胞中均主要定位在细胞核周围,并有明显的块状染色,胞核中未见明显分布;Western blot 法检测显示重组β4GalTⅡ蛋白在 HEK 293T 细胞中稳定表达。结论获得了人β4GalTⅡ的真核表达质粒,并能在 COS7和 HEK 293T 细胞中表达,为进一步研究β4GalTⅡ的功能及其与其他蛋白的相互作用奠定了一定基础。     

甲状旁腺素受体真核表达载体的构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建小鼠甲状旁腺素受体（PTHR）及其突变受体（DSEL）全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达PTHR及
DSEL的HEK293细胞系,以应用于甲状旁腺素（PTH）模拟肽活性药物筛选及其信号通路的研究。方法通过双酶切、胶回收方
法分别纯化目的片段(PTHR、DSEL基因)和质粒pcDNA3.1（+）,二者分别由DNA限制性内切酶EcoRⅠ与Not Ⅰ双酶切,经T4
DNA Ligase连接的方法将PTHR、DSEL基因克隆到质粒表达载体pcDNA3.1（+）中,采用测序方法及DNA限制性内切酶EcoR
Ⅰ与Not Ⅰ双酶切方法鉴定重组质粒,脂质体转染法将重组体pcDNA3.1（+）-PTHR、pcDNA3.1（+）-DSEL及空质粒pcDNA3.1
（+）分别转染至HEK293细胞,经G418筛选抗性细胞克隆,、RT-PCR及ELISA检测转染细胞PTHR、DSEL的表达情况。结果重
组质粒经基因测序及DNA限制性内切酶EcoRⅠ与Not Ⅰ双酶切证实质粒表达载体pcDNA3.1（+）-PTHR、pcDNA3.1（+）- DSEL
构建正确。重组体经脂质体法转染HEK293 48 h后,经G418筛选3周得到细胞抗性克隆,ELISA检测到PTHR、DSEL基因在
重组质粒表达载体pcDNA3.1（+）-PTHR、pcDNA3.1（+）-DSEL转染的HEK293中成功表达。RT-PCR方法检测到PTHR、DSEL
基因在转录水平的表达。ELISA方法检测到重组质粒转染的HEK293中,加入甲状旁腺激素刺激后,PLC、cAMP蛋白表达量远高
于空质粒pcDNA3.1（+）转染的HEK293中PLC、cAMP的表达。结论成功构建了稳定高表达PTHR、DSEL的HEK293细胞,该
稳定转染细胞系的建立为进一步研究甲状旁腺素受体下游信号通道的分子机制以及筛选其模拟肽作用的活性奠定了实验基础。
     

HPC2真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的HPC2真核表达载体,并分析其在HEK293细胞中的表达。方法从重组pcDNA3/HPC2载体上将HPC2cDNA序列亚克隆至带有flag标记的真核表达载体pcDNA3-flag上,经PCR、酶切和测序鉴定,将重组质粒pcDNA3-flag/HPC2用脂质体瞬时转染HEK293细胞,细胞裂解后,用Westernblot分析并观察HPC2在HEK293细胞中的表达情况。结果PCR、酶切和DNA测序结果均表明重组质粒pcDNA3-flag/HPC2构建正确,并可在HEK293细胞内高效表达。结论成功构建了pcDNA3-flag/HPC2真核表达载体,该载体能在哺乳动物细胞中有效表达,为进一步研究HPC2的功能提供了重要的实验材料。     

抗肿瘤血管生成VEGFR2 DNA疫苗的构建

目的 构建一种新的抗肿瘤血管生成DNA疫苗pcDNA3．1＋／flk-1（nl-4）．方法 采用RT-PCR技术，从BALB／c胎鼠组织中扩增出鼠血管内皮生长因子受体flk-1胞外区1-4个袢的cDNA片段，并将其插入真核表达载体质粒pcDNA3．1＋中，构建成重组质粒pcDNA3．1＋／flk-1（nl-4），经DNA序列分析证实后，将重组质粒经脂质体法转染真核表达系统COS-7细胞，通过Western blot实验检测重组质粒在真核表达系统COS一7细胞中蛋白的表达．结果 RT-PCR扩增产物为1248bp大小的基因片段，经过DNA序列分析证明与GeneBank所公布的flk-1胞外区1-4结构域碱基一致，成功构建了重组质粒pcDNA3．1＋／ilk-1（nl-4），并且该重组质粒在真核表达系统COS-7细胞中成功得到表达．结论 成功地制备了抗肿瘤血管生成DNA疫苗pcDNA3．1＋／flk-1（nl-4），为进一步开展有关抗肿瘤血管生成的动物实验和临床应用奠定了基础。     

人CCR5基因真核表达质粒的构建及其鉴定

目的:构建人CCR5基因的真核表达质粒并对其进行功能鉴定.方法:PCR扩增人CCR5基因,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1内,构建含人CCR5基因的真核表达质粒pcDNA3.1-CCR5.使用RT-PCR、流式细胞术和HIV假病毒感染实验的方法,鉴定CCR5在真核细胞中的表达和功能.结果:克隆的人CCR5基因与GenBank中已登记的基因序列100%同源.瞬时转染真核细胞后,RT-PCR在预期的位置检测出目的条带,流式细胞术检测到约25.6%的细胞表达CCR5蛋白,且该蛋白能介导HIV假病毒的感染.结论:成功构建了含人CCR5基因的真核表达质粒.     

大鼠GPR17基因真核表达载体的构建及其功能鉴定

目的:构建大鼠GPR17(rGPR17)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并对其功能进行初步研究.方法:从大鼠脑组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增rGPR17 cDNA,与载体pcDNA3.1(+)连接,并转化到大肠杆菌DH5α以获得重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,以PCR、双酶切和测序鉴定;将重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17通过脂质体转染方法,转染HEK293细胞,RT-PCR、免疫荧光法检测rGPR17的表达,Fluo-4测定激动剂LTD_4处理后细胞内钙变化.结果:RT-PCR、双酶切和测序证明,重组的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17构建成功,并在HEK293细胞获得表达,加入外源性激动剂LTD_4可诱导细胞内钙的增加.结论:成功构建了rGPR17的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并在HEK293细胞功能性表达,为GPR17受体及其拮抗剂的研究提供了基础.     

DDR2/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建DDR2/Fc真核表达载体,使其在HEK293细胞中进行表达. 方法:采用PCR技术,分别从大鼠脑组织、含人IgG1 Fc全长互补DNA(cDNA)的质粒中扩增出盘状结构域受体2(DDR2)的DS区域、Fc段,以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,获得重组表达载体DDR2/Fc-pcDNA3.1(-);采用脂质体转染技术转染HEK293细胞; RT-PCR、免疫印迹检测融和蛋白的表达. 结果:DNA测序和限制型酶切鉴定证明两段基因正确克隆至pcDNA3.1(-)的多克隆位点,细胞裂解物中检测到融合蛋白的表达,其分子质量与预期大小一致,该融合蛋白能正确表达于HEK293细胞中. 结论:成功构建了DDR2/Fc融和表达载体,表达了融合蛋白.     

pcDNA3．1^＋-HIF-1α载体的构建和初步表达鉴定

目的 克隆和构建带人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因真核表达载体pcDNA3-1^ -HIF-1α。方法 以大肠癌细胞株HT29的总RNA为模板，进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，获得HIF-1α的cDNA，克隆入T载体，测序证实后克隆入真核表达载体pcDNA3．1^ ，酶切鉴定重组子。将构建好的pcDNA3．1^ -HIF-1α用脂质体法转入HEK293细胞，RT-PCR鉴定重组质粒的表达。结果 扩增出HIF-1αcDNA全长，测序结果与Genbank记载完全一致，成功克隆入真核表达载体pcDNA3．1^ ；建立了稳定的细胞株HEK293／pcDNA3．1^ -HIF-1α。结论 成功克隆和构建带人HIF-1α基因真核表达载体pcDNA3．1^ -HIF-1α并证明其能在真核细胞内表达。     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的:构建人MCHR2真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染细胞系. 方法:采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和PCR鉴定后,脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,RT-PCR,Western Blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达. 结果:成功构建了pcDNA3.1-MCHR2真核表达载体并已稳定转入HEK293细胞,建立了稳定转染细胞系,成功地表达目的基因. 结论:稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究MCHR2的功能提供了良好的实验基础.     

大鼠细胞色素P450—2J3基因的克隆及其在293细胞中的表达

目的克隆大鼠CYP2 J3基因并构建pcDNA 3.1( )-CYP2 J3真核表达载体,检测其在293细胞中的表达。方法提取大鼠肝脏组织总RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和重叠延伸聚合酶链反应(OE-PCR)扩增大鼠CYP2 J3基因,克隆入真核表达载体pcDNA 3.1( )。脂质体转染293细胞,用W estern b lotting鉴定其在293细胞表达。结果运用RT-PCR和OE-PCR获得CYP2 J3基因开放读码框架(ORF)全长序列,经酶切鉴定正确。测序结果与基因Gen Bank提交序列完全一致并成功构建真核表达载体pcDNA 3.1( )-CYP2 J3。W estern b lotting结果显示,转染pcD-NA 3.1( )-CYP2 J3后的293细胞能稳定有效表达CYP2 J3蛋白。结论大鼠CYP2 J3基因的成功克隆以及pcDNA3.1( )-CYP2 J3载体的成功构建,为CYP2 J3基因的功能研究和相关疾病的研究提供了可行的工具。     

甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及初步表达

目的:构建含有甲型流感病毒M2基因的真核表达载体。体外转染真核细胞株HEK293细胞并检测目的蛋白的表达。方法:从接种人流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增M2基因。通过分子克隆技术将所扩增片段插入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)。经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到HEK293细胞中,通过免疫荧光技术鉴定其表达。结果:经双酶切、PCR及测序鉴定证实M2基因的真核表达载体构建成功。免疫荧光技术证实流感病毒M2基因的表达。结论:甲型流感病毒M2蛋白是一种具有高保守性,可形成离子通道并影响流感病毒表面蛋白血凝素(HA)天然构象的形成,被认为是具有交叉免疫保护性的结构蛋白。甲型流感病毒M2基因真核表达质粒的构建及成功表达将为甲型流感病毒基因工程疫苗,通用疫苗和核酸疫苗的研究打下基础。     

人宫颈癌Ca Ski 细胞 IL-24基因的克隆鉴定与真核表达

目的:克隆人IL-24基因并构建真核表达载体,转染Ca Ski细胞进行真核表达.方法:利用RT-PCR技术扩增出Ca Ski细胞中的IL-24基因.将IL-24基因克隆人pcDN3.1( )中,构建真核表达质粒pcDN3.1( )-hIL-24的表达.结果:PCR及测字结果均证实在功克隆了人IL-24,该质粒被转染人Ca Ski细胞中能表达出hIL-24蛋白.结论:成功构建了hIL-24基因的真核表达载体.     

Construction of Eukaryotic Expressing Plasmids Encoding HA and HA1 of Influenza A Virus and Their Transient Expression in HEK293 Cells

The high variability of influenza virus resultsin influenza epidemics , which occurs as numerouslocalized outbreaks or regional epidemics each yearand occasionally as a global pandemic every 10 -30years . Therefore ,seeking a promising approach tocontrol and prevent influenza is a hot subject thathas attracted the attention of researchers world-wide . DNAvaccine has become the focus of wide-spread interest , because of not only the noveltyand si mplicity , but also its efficacy to inducebroad-…     

S1P1真核表达载体的构建及在HEK293细胞膜上的表达

目的构建含人Ⅰ型1-磷酸鞘氨醇受体(SIPI)-全长cDNA序列及HA和/或EGFP标签的真核表达载体,并观察其在HEK293细胞上的表达。方法合成2条HA寡核苷酸,克隆入S1P1-Myc-EGFP-N1载体。以HA-S1P1-Myc-EGFP-N1为模板,用PCR的方法扩增HA-S1P1并克隆入pcDNA3.1(+)载体。限制性酶切消化、PCR、测序的方法鉴定,载体经Polyfect转染入HEK293细胞。G418筛选出稳定细胞株。用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测S1P1在HEK293细胞上的表达。结果限制性酶切消化、PCR、测序结果证实载体构建成功。S1P1表达在HEK293稳定细胞株的表面。结论成功构建带有HA和/或EGFP标签的S1P1真核表达载体,表面表达S1P1的HEK293稳定细胞株可作为我们进一步研究的细胞模型。