输注人PBMC建立“人-鼠”异种移植物抗宿主病模型1

目的:摸索X-GVHD模型的合适小鼠品系,建立稳定的“人-鼠”X-GVHD模型。方法:选取了裸鼠、NOD/SCID经亚致死剂量γ射线全身照射后,腹腔输注健康人外周血单核细胞(PBMC)建立异种X-GVHD模型。通过检测人T细胞在模型鼠外周血、组织、器官中的浸润情况等指标(采用流式细胞术和免疫组化技术),比较两种模型鼠中人免疫细胞的浸润率和各组生存时间,从而确定建立X-GVHD模型的合适小鼠品系,并摸索人PBMC的输注途径和合适细胞量,以及观察免疫细胞表型变化与功能的最佳时间窗口。结果:NOD/SCID鼠更适合诱导“人-鼠”X-GVHD模型的小鼠;腹腔输注途径和尾静脉输注途径对建立“人-鼠”X-GVHD模型无明显差异;腹腔输注5×107以上人PBMC可以成功建立“人-鼠”X-GVHD模型。在采用优化后的实验条件建立模型中,监测人T细胞表型动态变化与功能的最佳时间窗口为7~11 d;模型鼠的平均生存时间为(14.16±1.77)d。结论:NOD/SCID鼠通过腹腔注射5×107以上人PBMC可以成功建立“人-鼠”X-GVHD模型,7~11 d为监测人T细胞表型动态变化与功能的最佳时间。     

sHLA-A*2402融合蛋白的制备与特性研究

本文用含有HLA-A*2402重链胞外段基因的质粒为模板进行PCR,利用下游引物拼接上依赖BirA的可生物化序列后,构建融合基因sHLA-A*2402-BSP,与质粒pET-21d重组后,在宿主菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达。表达的融合蛋白与β2m及HLA-A*2402限制性抗原肽EB病毒BRLF1蛋白中的九肽NH2-TYPVLEEMF-COOH进行复性折叠,形成HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,并用Westernblot和夹心ELISA法鉴定。证实成功地制备出sHLA-A*2402-生物素化序列融合蛋白并使之正确折叠复性。为研究在原核系统中表达、纯化与复性及体外构建MHCI类分子四聚体,探讨免疫识别机制奠定了基础。     

人工抗原提呈细胞的制备和应用的研究

目的 制备人工抗原提呈细胞（artificial antigen presenting cell,aAPC）并用它从HLA-A2阳性健康个体外周血单个核细胞（PBMC）中诱导和扩增特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）.方法 将HLA-A2-EBV四聚体分子和抗CD28抗体分子吸附固定在细胞大小的聚苯乙烯乳胶微球（5μm）表面制成aAPC;采用流式细胞仪表型分析;aAPC和HLA-A2阳性个体人外周血单核细胞进行混合淋巴细胞反应;用HLA-A＊0201-EBV四聚体染色法检测特异性CTL的频率;应用细胞内细胞因子染色法检测特异性CTL功能性细胞因子IFN-γ的分泌;采用LDH释放法检测特异性CTL的特异杀伤活性.结果 流式细胞仪分析显示微球表面吸附有HLA-A2-EBV四聚体分子和抗CD28抗体分子;四聚体检测及细胞内细胞因子染色法检测与经典细胞毒试验结果一致,结果表明aAPC在体外可诱导抗原特异性CTL的生成.结论 aAPC制备成功,并在体外有效地诱导抗原特异性CTL的生成.     

融洽护患关系的体会

护患关系是否融洽,体现了人际关系的文明程度,也直接影响患者疾病的治疗。下面是笔者在护理工作中对融洽护患关系、增强患者对护士的信任的体会。     

表达载体sHLA-A2-IgG1-Fc的构建与鉴定

目的构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgGl-Fc,为进一步真核表达可溶性HLA-A2-IgG1-Fc蛋白奠定基础。方法从T2细胞中提取总RNA,借助RT-PCR技术扩增包括信号肽的可溶性HLA-A2的cDNA序列并把其插入真核表达载体pcDNA3.0,然后经酶切和测序法鉴定;用PCR的方法从含IgG1-Fc基因的PIG质粒中扩增目的基因IgG1-Fc段,然后经酶切后插入前面构建好的表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2中,最后经酶切和测序法鉴定。结果经酶切鉴定及测序分析,证实已将目的基因HLA-A2和IgG1-Fc片段插入载体pcDNA3.0。结论本研究成功构建表达载体pcDNA3.0-sHLA-A2-IgG1-Fc。     

H-2K~d四聚体的制备及其在检测特异性同种CTLs中的应用

目的制备H-2Kd限制性胰岛GAD抗原肽/H-2Kd四聚体并用于检测相应的特异性同种CTL。方法以原核表达的sH-2Kd-BSP为重链,β2m为轻链,与人工合成的GAD抗原肽在体外利用稀释法进行共折叠复性得到单体。然后在BirA酶作用下对其进行生物素化,通过凝胶过滤层析法纯化生物素化的复合物单体,再与Strep-tavidin-FITC按4∶1比例混合形成四聚体;取Balb/c小鼠(H-2Kd)巨噬细胞加载胰岛GAD抗原肽,作为刺激细胞,取C3H小鼠脾细胞(H-2KK)作为效应细胞,在体外进行混合淋巴细胞培养,以获得针对H-2Kd限制性胰岛GAD抗原肽的特异性同种CTL。结果该四聚体能够与长期混合淋巴细胞培养出的同种特异性T细胞结合。结论成功构建胰岛GAD抗原肽/H-2Kd四聚体,并可用于针对H-2Kd限制性胰岛GAD抗原肽特异性同种CTL的检测。     

可溶性HLA-B54/IgG1Fc二聚体融合蛋白的构建表达及功能鉴定

目的 构建HLA-B54/IgG1真核表达载体,稳定转染至721.221细胞中,获得HLA-B54/IgG1Fc二聚体融合蛋白.方法 通过RT-RCR我们获得了HLA-B54的胞外段与人IgG1的CH1-CH2-CH3的cDNA,将HLA-B54与IgG1重链的恒定区插入到质粒pcDNA3.1（＋）中形成pcDNA3.1（＋）-HLA-B54/IgG1Fc重组基因.为了获得稳定转染,用电穿孔法将质粒pcDNA3.1（＋）-HLA-B54/IgG1Fc转染到721.221细胞中,大量收集通过G418筛选的721.221阳性克隆株的无血清的上清,通过PEG20000浓缩得到可溶性HLA-B54/IgG1Fc二聚体融合蛋白,双抗体夹心ELISA和Western-blot（利用MHCⅠ类特异性抗体、人IgG的Fc段特异性抗体）来鉴定融合蛋白.结果 限制性内切酶酶切鉴定及序列测定等证实了成功构建了pcDNA3.1＋[HLA-B54/IgG1Fc]重组质粒.ELISA和Western-blot结果表明：HLA-B54/IgG1Fc融合基因能够在721.221细胞中表达.融合蛋白由预期的HLA-B54的胞外段与IgG1的Fc段两个部分组成.结论 二聚体融合蛋白HLA-B54/IgG1的构建有助于理解HLA-B54限制性的T细胞反应.     

原核表达、体外折叠的HLA-G5促进人外周血单核细胞产生TNF

通过原核表达获得HLA-G5重链和轻链(β2m),经初步纯化后,利用稀释法与人工合成的九肽(KGPPAALTL)一起进行体外复性折叠,形成HLA-G5-抗原肽复合物,经非变性PAGE/Western blot和夹心ELISA法鉴定,证实复性后成功获得天然构象的HLA-G5。利用PBMC受LPS刺激后产生TNF的特点,观察原核表达、体外折叠的HLA-G5对人PBMC分泌TNF的影响。TNF分泌量采用TNF敏感的L929细胞进行生物法测定,结果显示原核表达、体外折叠的HLA-G5促进人PBMC分泌TNF-α。     

医院门诊收入的变动因素及费用构成分析

本文对武汉市儿童医院近 6年来门诊量及门诊收入进行了分析 ,以探讨医院门诊如何适应社会医疗改革 ,促进医院合理创收 ,加强对影响门诊收入可控因素的管理 ,力创医院良性循环发展的氛围。资料与方法资料来源 :收集武汉市儿童医院 1995～ 2 0 0 0年门诊人次及门诊业务收入量 ,包括药品费和诊疗费。方法 :先从总体上分析其变化趋势 ,再以年为单位且以各年分别为终点及起点划分为不同时段 ,最后 ,根据统计学变动因素分析原理〔1〕,采用指数体系因素分析法〔2〕,计算不同时段各项目的指数及对收入的影响额 ,并应用百分比构成进一步分析其费用构…     

预先形成的重链二硫键有助于HLA-A2-抗原肽复合物体外折叠

目的: 提高可溶性HLA -A2 肽复合物体外折叠效率。方法: 在变性非还原条件下提取原核表达的HLA重链(HC)。通过离子交换及硫酸铵沉淀初步纯化后, 在β2微球蛋白(β2m)及特异性抗原肽 (Try369-377 )存在的情况下, 于pH6. 6的折叠缓冲体系中稀释复性。利用Westernblot及ELISA检测折叠产物。结果: 折叠复合物中主要含有HLA-A2 抗原肽复合物和β2m, 较少含有HC聚合体; 折叠效率较传统方法提高 2. 5倍。结论: 通过与传统方法作比较, 证实此法折叠效率比传统方法高, 为进一步HLA 肽四聚体及人工抗原提呈细胞的制备可提供足够可溶性的HLA -A2 肽单体。