慢病毒介导shRNA沉默YAP基因对人前列腺癌LNCaP细胞增殖、凋亡及其雄激素受体的影响

目的:探讨慢病毒介导sh RNA沉默Yes-相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)基因对人激素依赖性前列腺癌细胞株LNCa P细胞增殖、凋亡及其雄激素受体(androgen receptor,AR)的影响。方法:3条针对YAP基因的sh RNA慢病毒干扰载体感染LNCa P细胞,经嘌呤霉素筛选后建立稳定感染细胞系,real-time PCR、Western blot分别检测感染后各组细胞YAP、AR m RNA和蛋白水平;选取沉默效果最佳sh RNA慢病毒干扰载体组,以细胞增殖/毒性检测(cell counting kit-8,CCK-8)、平板克隆形成实验(colony formation)检测LNCa P细胞增殖能力;流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测LNCa P细胞凋亡改变。结果:重组慢病毒成功感染前列腺癌LNCa P细胞,经嘌呤霉素筛选后感染效率达95%以上,获得稳定沉默YAP基因LNCa P细胞系。与空白对照组和阴性对照组比较,感染sh RNA慢病毒干扰载体各组中YAP、AR m RNA及蛋白表达水平明显下调(P=0.000),细胞增殖受到明显抑制(P=0.000),细胞凋亡明显增加(P=0.000)。结论:慢病毒介导sh RNA沉默YAP基因能有效下调YAP在LNCa P细胞中表达,并抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡;YAP可能作为AR配体参与AR信号通路的调节。     

RNAi沉默Smad4基因表达对人前列腺癌细胞增殖的影响

目的 观察RNA干扰技术沉默Smad4基因表达对人前列腺癌细胞增殖能力的影响,探讨Smad4在前列腺癌恶性进展中的作用.方法 用半定量RT-PCR和Western blot方法检测LNCaP、PC-3、DU145以及ARCaP亚细胞系IF11、IA8等多种不同前列腺癌细胞Smad4 mRNA及蛋白表达的情况,筛选出Smad4基因阳性表达的细胞;针对Smad4基因不同部位设计并化学合成3对不同的靶向小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),脂质体介导瞬时转染阳性表达Smad4的细胞,转染后48 h分别用RT-PCR和Western blot检测Smad4 mRNA及蛋白表达水平的变化,用MTT法检测沉默Smad4表达对细胞增殖的影响.结果 检测的5种前列腺癌细胞中仅LNCaP、PC-3、DU145 3种细胞表达Smad4 mRNA及蛋白;选择PC-3细胞做siRNA转染,与阴性对照序列组(siRNA-NC)相比,转染48 h后,转染SiRNA1、SiRNA2、SiRNA3的3组PC-3细胞的Smad4 mRNA表达水平均显著下降,但仅有siRNA3组Smad4蛋白表达水平显著降低.转染SiRNA3沉默Smad4基因表达后PC-3细胞的体外增殖能力显著增强(P＜0.05).结论 不同前列腺癌细胞Smad4基因的表达存在差异,靶向siRNA下调Smad4的表达可增强前列腺癌细胞的增殖能力.     

HDAC1基因小干扰RNA对人宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞放射敏感性影响

目的探讨小干扰RNA(siRNA)抑制组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)表达对人宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞放射治疗敏感性的作用及可能机制。方法体外合成针对HDAC1基因的siRNA,脂质体法转染人宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞,应用蛋白印迹法检测细胞HDAC1蛋白和乙酰化组蛋白H4的表达,应用实时定量聚合酶链反应方法检测HDAC1基因、核因子-κB(NF-κB)基因和p53蛋白调控的凋亡调控因子(PUMA)基因mRNA表达。应用6 MV直线加速器,以0、2、4、6、8 Gy不同剂量X线照射细胞,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率及克隆形成实验检测细胞放射敏感性。结果人宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞经转染HDAC1基因siRNA后,正常对照组、阴性对照组和siRNA干扰组HDAC1基因mRNA表达分别为10.21±0.42、9.48±0.41和4.92±0.41;蛋白表达分别为0.81±0.14、0.79±0.16和0.42±0.18,与正常对照组和阴性对照组比较,siRNA干扰组细胞HDAC1基因mRNA和蛋白表达均降低,差异有统计学意义(P<0.05);正常对照组、阴性对照组和siRNA干扰组乙酰化组蛋白H4表达分别为0.76±0.21、0.75±0.20和0.30±0.19,与正常对照组和阴性对照组比较,siRNA干扰组乙酰化组蛋白H4表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组、阴性对照组和siRNA干扰组细胞NF-κB基因mRNA表达分别为6.24±0.52、6.31±0.61和4.22±0.56,PUMA基因mRNA表达分别为3.84±0.26、3.69±0.29和5.42±0.31,与正常对照组和阴性对照组比较,siRNA干扰组细胞NF-κB基因mRNA降低,PUMA基因mRNA表达增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。经X线照射后,正常对照组、阴性对照组和siRNA干扰组凋亡率分别为(16.25±2.64)%、(15.41±2.97)%和(29.62±3.11)%,存活分数(SF2)值分别为0.576±0.149、0.564±0.142和0.226±0.151,与正常对照组和阴性对照组比较,siRNA干扰组细胞凋亡率增加,SF2值降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 HDAC1基因siRNA能够增强人宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞对放射线损伤的敏感性。抑制人宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞HDAC1基因表达,增加乙酰化组蛋白H4表达,下调NF-κB基因表达和上调PUMA基因表达可能是其作用机制。     

人PGI基因siRNA慢病毒质粒的构建及对白血病细胞增殖的影响

目的 构建共表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因和人磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase,PGI)基因的慢病毒载体,初步探讨干扰人PGI基因对白血病细胞增殖的影响.方法 RT-PCR、Western blot检测人单核细胞、K562、KG1-α、HL-60细胞中PGI mRNA和蛋白表达水平,筛选高表达PGI的白血病细胞系;构建人PGI基因siRNA的慢病毒载体及阴性对照,经293T细胞包装后,获得可表达人PGI基因siRNA的慢病毒载体及阴性对照;分别使用重组病毒(干扰组)、原始病毒(阴性对照组)和等量PBS(空白对照组)转染白血病KG1-α细胞,筛选稳定转染细胞株.RT-PCR和Western blot检测干扰组、阴性对照组及空白对照组KG1-α细胞PGI基因表达水平;CCK-8检测各组细胞增殖情况并作生长曲线.结果 PGI基因在白血病KG1-a细胞中高表达;成功构建了稳定低表达PGI的白血病细胞株(KG1-α-siPGI);低表达PGI基因的KG1-α细胞增殖能力较空白对照组明显降低,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 成功构建了低表达PGI基因的白血病KG1-α细胞株,干扰PGI基因的表达能够抑制KG1-α细胞的生长.     

针对HBVx基因的siRNA重组腺病毒的制备及其对HBVx基因表达的抑制作用

目的:构建针对乙型肝炎病毒x基因(HBx基因)的小干扰RNA (siRNA)重组腺病毒表达载体,并在能表达HBx基因的人肝癌细胞株HepG2中观察其对HBx基因表达的抑制作用.方法:重组腺病毒穿梭载体pShuttle-HBx与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组得到重组腺病毒载体,后者转染HEK293细胞,包装并扩增出病毒颗粒.用获得的病毒感染能表达HBx基因人肝癌细胞株HepG2,收集细胞总RNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western Blot方法检测细胞中HBx基因表达的变化.结果:经限制性内切酶酶切鉴定,证实针对HBx基因的siRNA重组腺病毒载体构建成功.RT-PCR和Western Blot方法证实,在HepG2细胞中,HBx基因在mRNA和蛋白水平均有降低.结论:腺病毒介导的针对HBx基因的siRNA在体外能够高效、特异地抑制HBx基因的表达.     

重组腺相关病毒介导的RNAi抑制血管生长素表达对肺鳞癌细胞成瘤能力的影响

目的:通过腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)介导的 RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制肺鳞癌细胞SK-MES-1的血管生长素(angiogenin,ANG)表达,观察其对癌细胞生长及成瘤能力的影响.方法:构建H1启动子驱动的表达针对ANG的小干扰RNA(siRNA)重组腺相关病毒AAV-shANG,转染SK-MES-1细胞;同时以正常SK-MES-1细胞以及转染AAV-Null的SK-MES-1细胞作为对照.培养72 h后,蛋白质印迹法检测3组细胞ANG 蛋白表达变化,并检测细胞周期.将以上3组细胞移植胸腺缺陷小鼠观察其生长和成瘤能力的变化,并进行微血管密度计数.结果:成功构建重组腺相关病毒AAV-shANG,转染SK-MES-1细胞后ANG蛋白表达水平为两对照组细胞的20%,细胞增殖指数未见差异.AAV-shANG转染细胞在胸腺缺陷小鼠中的成瘤体积、瘤质量和微血管密度均较两对照组细胞显著下降(P＜0.05).结论:腺相关病毒介导的shANG表达能有效抑制SK-MES-1细胞中ANG蛋白表达,抑制其成瘤能力,对肺鳞癌的治疗具有重要的意义.     

重组腺辅助病毒载体的制备、纯化及其介导的基因转移

目的 :探讨一种制备、纯化重组腺辅助病毒 (r AAV)载体的有效方法。方法 :以质粒 PDG和含有人 apo AIc DNA的AAV载体共转染 2 93T细胞 ,继以 Iodixanol密度梯度离心结合肝素亲和层析法分离、纯化 ,斑点杂交鉴定 r AAV病毒颗粒数 ;并以含人 apo AIc DNA的 r AAV感染 C2 C12细胞。结果 :r AAV颗粒数为 7× 10 1 0 / ml;r AAV成功介导了人 apo AIc DNA在 C2 C12细胞中的表达并持续了 30天 ,在分化为肌管细胞后仍有此表达能力。结论 :本实验采取的制备、纯化 r AAV的方法简便、高效 ,r AAV成功介导 apo AI基因在肌源性细胞 C2 C12中的表达。     

过表达氯离子通道蛋白3对异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌肥厚的预防作用与机制

目的 探讨氯离子通道蛋白3(ClC-3)基因过表达对异丙肾上腺素(ISO)诱导的小鼠心肌肥厚的预防作用及机制.方法 运用腺相关病毒9(AAV9)感染方法构建ClC-3过表达小鼠模型和原代心肌细胞模型,采用蛋白质印迹法与qRT-PCR检测小鼠心脏组织和原代心肌细胞中ClC-3的表达以确定模型是否建立成功.32只雄性C57BL/6小鼠随机分为4组,每组8只.对照组连续7 d腹腔注射生理盐水,ISO组连续7 d腹腔注射ISO 7.5 mg?kg-1?d-1,AAV9-bv+ISO组用空白载体AAV9病毒颗粒感染小鼠4周后连续7 d腹腔注射ISO 7.5 mg?kg-1?d-1,AAV9-ClC-3+ISO组用携带ClC-3基因的AAV9病毒颗粒感染小鼠4周后连续7 d腹腔注射ISO 7.5 mg?kg-1?d-1.采用心脏超声检查小鼠心功能变化,计算心脏体重指数,采用qRT-PCR检测心肌组织中心房钠尿肽(ANP)、脑钠肽(BNP)的mRNA表达水平,H-E染色观察左心室形态学变化,苦味酸-天狼星红(PSR)染色观察心脏组织胶原纤维变化.取乳鼠摘出心脏,体外培养原代心肌细胞并分为4组,对照组未予任何干预,ISO组用0.1μmol/L ISO干预48 h,AAV9-ClC-3组用携带ClC-3基因的AAV9病毒颗粒感染细胞48 h,AAV9-ClC-3+ISO组用携带ClC-3基因的AAV9病毒颗粒和0.1μmol/L ISO共同干预48 h.采用芯片膜片钳技术检测小鼠原代心肌细胞的容积激活性氯电流(ICl,vol).结果 蛋白质印迹法和qRT-PCR检测结果均表明ClC-3过表达小鼠和原代心肌细胞模型成功建立.AAV9介导的ClC-3过表达能缓解ISO诱导的小鼠心脏体重指数、收缩末期室间隔厚度、收缩期左室后壁厚度和舒张期左室后壁厚度的增加,改善心脏组织形态学异常和心脏纤维化,减少心脏组织中ANP、BNP mRNA表达的增加,并能体外抑制ISO导致的心肌细胞ICl,vol降低.结论 ClC-3过表达可预防ISO诱导的小鼠心肌肥厚,其机制可能与心肌细胞ICl,vol激活有关.     

抑制NBS1表达对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响

目的 探讨siRNA抑制NBS1基因表达对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响。方法通过构建NBS1干扰质粒和阴性空载质粒,并通过腺病毒载体感染MDA-MB-231细胞,Western印迹法明确NBS1基因受干扰情况;CCK-8法检测转染质粒后对MDA-MB-231细胞体外增殖能力的影响;流式细胞法检测感染后实验组和阴性对照组MDA-MB-231细胞的凋亡情况。结果 Western印迹法检测结果表明实验组NBS1蛋白表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05);CCK-8实验结果显示,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组细胞增殖能力受到抑制(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示,实验组较阴性对照组凋亡率上升(P<0.05)。结论抑制NBS1基因的表达可以抑制三阴性乳腺癌细胞增殖,并促进癌细胞的凋亡。     

ORC1基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞表型的影响

目的 以RNA干扰抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)ORC1基因,探讨ORCl基因表达抑制后对VSMCs表型的影响.方法 实验设置正常对照组、阴性siRNA组及阳性siRNA组.应用Western blot检测ORC1基因表达的变化;免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜观察细胞形态结构;应用流式细胞仪检测细胞表型标志蛋白表达.结果 ①siRNA转染后,阳性siRNA组ORCI基因表达水显著降低,而正常对照组及阴性siRNA组间ORC1基因表达水平无显著差异.②siRNA转染后,阳性转染组细胞呈现收缩型形态特征,空白对照组及阴性对照组细胞呈现合成型形态特征.③siRNA转染使ORCI表达减弱后,VSMCs收缩型标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SM actin)和平滑肌肌动蛋白重链2(SM-2)表达水平明显升高.合成型标志物骨桥蛋白(osteopontin)表达水平明显降低,空白对照组及阴性对照组间3种标志物表达水平无显著差异.结论 RNA干扰介导的ORC1基凶沉寂可促使VSMCs由合成型向收缩型转化.     

人精子顶体膜相关蛋白32真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的:研究人精子顶体膜相关蛋白32(hSAMP32)mRNA在体外细胞NIH3T3中的表达。方法:利用RTPCR及亚克隆技术构建pcDNA3.1( )hSAMP32质粒,实验组以脂质体介导基因转染法将pcDNA3.1( )hSAMP32真核表达载体导入NIH3T3细胞中,同时设置空白和阴性对照组(转染空载体pcDNA3.1( ))。原位杂交检测hSAMP32mRNA在3组细胞中的表达。结果:①RTPCR扩增产物与预期的目的基因hSAMP32长度一致。亚克隆酶切鉴定可见目的片段。②实验组阳性细胞胞浆中可见hSAMP32mRNA的表达,镜下可见蓝紫色阳性颗粒,空白和阴性对照组未见蓝紫色阳性颗粒。结论:脂质体介导基因转染法能够将pcDNA3.1hSAMP32真核表达载体高效导入NIH3T3细胞中,实现了hSAMP32基因的体外表达。     

TIEG特异的siRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建TIEG基因siRNA慢病毒载体.方法 针对已经筛选确定的TIEG基因siRNA有效靶序列.合成靶序列的Oligo DNA退火形成双链DNA与经BamH Ⅰ和EcoRl酶切后的PshRNA-copGFP-lendvector慢病毒载体[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生psiRNA-TIEG慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆.测序鉴定,用psiRNA-TIEG和病毒包装系统共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度;用包装病毒颗粒注射大鼠,通过RealTime-PCK检测大鼠肾组织TIEG mRNA的表达水平.结果 PCR和测序证实,成功构建TIEG siRNA慢病毒栽体psiRNA-TIEG,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为1×10<'5>ifu/μL;实验组大鼠TIEGmRNA的表达水平明显低于对照组(50.7%).结论 成功构建大鼠TIEG基因siRNA慢病毒栽体psiRNA-TIEG.     

干扰EV71病毒2Apro基因的siRNA具有潜在的抗病毒作用

目的: 探讨以肠病毒71(entrovirus 71, EV71) 2A蛋白酶(2Apro)基因为靶序列合成的siRNA是否具有潜在的抗病毒作用。方法: 用Lipofectamine 2000脂质体分别将40、60、80 nmol/L FITC标记的BLOCK iT Fluorescent Oligo转染RD细胞,通过流式细胞仪和倒置荧光显微镜检测siRNA的转染效率。将化学合成的3个siRNA 2Apro (siRNA 69、294、319)和阴性对照的乱序si RNA(siRNA SCS)转染RD细胞,siRNA 2Apro为实验组,siRNA SCS为阴性对照组,另设模拟转染组,仅用脂质体处理;用EV71分别感染各组RD细胞,观察细胞形态学改变,荧光定量PCR和蛋白质印迹检测病毒RNA和VP1蛋白。结果： 当siRNA浓度为60 nmol/L时转染效率最高,达87%。细胞形态学结果显示,与对照组比较,实验组细胞只发生了轻微的病变。荧光定量PCR和蛋白质印迹结果显示,siRNA 2Apro组的病毒RNA和VP1蛋白明显低于对照组(P<0.01)。结论： 以EV71 2Apro基因为靶序列化学合成的siRNA能有效地抑制病毒的复制。     

慢病毒介导的siRNA靶向干扰EIF4G1鼻咽癌稳定细胞株的建立

目的 检测人真核翻译起始因子4G1(EIF4G1)基因在8株鼻咽癌细胞中的差异表达,寻找最高表达的细胞株.构建EIF4G1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,建立稳定干扰EIF4G1表达的鼻咽癌细胞株,测定干扰效率.方法 应用荧光定量PCR检测EIF4G1 mRNA在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1表达水平.构建重组靶向EIF4G1 shRNA慢病毒表达质粒pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA.用293FT细胞包装后产生的成熟慢病毒颗粒感染5-8F细胞.经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的5-8F鼻咽癌细胞株.最后荧光定量PCR检测干扰效率.结果 在8个鼻咽癌细胞株中,EIF4G1显示在5-8F细胞株中表达最高.PCR和测序验证pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染5-8F细胞后,与阴性对照组和未十扰组相比可明显抑制EIF4G1 mRNA水平EIF4G1表达.结论 成功构建TpLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA慢病毒重组质粒,建立了稳定靶向干扰EIF4G1表达的siRNA5-8F鼻咽癌细胞株.     

8型腺相关病毒介导短发夹状RNA在小鼠肝脏的表达及其功能

目的 以内源性基因超氧化物歧化酶1(SOD1)为靶基因,观察经单次尾静脉注射后8型腺相关病毒(AAV8)介导的短发夹状RNA(shRNA)在小鼠肝脏内的表达、对靶基因的沉默效应以及重组AAV8-SOD1 shRNA的副反应.方法 利用AAV8载体系统的双启动子构建能同时表达绿色荧光蛋白(GFP)和SOD1 shRNA的重组AAV8-SOD1 shRNA.采用Northern blot和Western blot分别检测SOD1 shRNA在小鼠肝脏内表达水平、靶基因SOD1在mRNA和蛋白水平表达变化、肝细胞微小RNA122(miRNA-122)表达水平;标准酶法测定小鼠肝功能;酶联免疫实验测定干扰素-α(IFN-α)水平;经HE染色对肝组织进行病理学观察.结果 经尾静脉注射重组AAV8-SOD1 shRNA后,小鼠肝组织中可检测到SOD1 shRNA和SOD小干扰RNA(SOD siRNA)反义链的表达;靶基因SOD1在mRNA和蛋白水平表达均明显受抑;血清转氨酶轻度升高,但IFN-α水平无上调;肝组织无明显病理学改变;肝细胞miRNA-122水平无明显下降.结论 经尾静脉单次注射重组AAV8-SOD1 shRNA后,SOD1 shRNA后可在小鼠肝脏中高效表达并沉默靶基因表达.重组AAV8-SOD1 shRNA对小鼠机体无明显副反应.     

慢病毒介导的 RNA 干扰沉默 MLF1IP 基在胆管癌 RBE 细胞中的表达

目的：应用慢病毒介导的 RNA 干扰技术沉默胆管癌 RBE 细胞中人髓细胞白血病因子1相互作用蛋白（MLF1IP）基因的表达，探讨其对胆管癌细胞体外增殖的影响。方法：设计合成针对 MLF1IP 靶基因序列的 siRNA序列，进行重组慢病毒包装。与不含有 MLF1IP 基因 siRNA 序列的慢病毒分别转染胆管癌 RBE 细胞株。Real-time PCR 检测 MLF1IP 基因的 mRNA 表达，MTT 法检测细胞的增殖能力。结果：成功构建了 MLF1IP-shRNA 慢病毒质粒并进行慢病毒包装，Real-time PCR 显示实验组 MLF1IP 基因的 mRNA 相对表达量为0.15±0.02明显高于对照组为1.01±0.12。MTT 法检测实验组细胞的 OD 值对比对照组显著降低。结论：慢病毒介导的 RNA 干扰技术能有效沉默 RBE 细胞中 MLF1IP 基因的表达，并能明显抑制胆管癌细胞 RBE 的体外增殖能力。     

靶向于雄激素受体的siRNA筛选及效能评价

目的 设计并合成新的靶向于雄激素受体(AR)的siRNA序列,转染前列腺癌细胞筛选最佳干扰序列.方法 设计并合成靶向于雄激素受体的siRNA,以不同浓度转染雄激素非依赖性前列腺癌细胞C4-2,确定最佳转染浓度.以最佳转染浓度转染细胞,分为siRNA Ⅰ组、siRNAⅡ组、siRNAⅢ组、阴性对照组、空白对照组和无关对照...     

病毒载体介导β折叠阻断肽的表达及其对β淀粉样蛋白神经毒性的抑制作用

目的:通过病毒载体转染体外培养的海马神经元,观察后者表达分泌性的β折叠阻断肽(β-sheet breaker peptide,BSB)的生物活性。方法:采用分子克隆技术构建编码神经营养素4(neurotrophin-4,NT4)信号肽-BSB融合基因的重组腺伴随病毒(recombinant adeno-associated vrius,r AAV)载体,AAV在包装细胞系293细胞中进行包装,蔗糖梯度离心法纯化病毒颗粒,斑点杂交法测定重组病毒滴度。MTT检测及电镜观察BSB的生物学效应。结果:成功构建p SSHG/NT4-BSB质粒载体,纯化后获得滴度为3.6×1012~1.8×1013/m L的病毒颗粒。通过病毒感染培养的神经元分泌表达的BSB有效地抑制了β-淀粉样蛋白(Aβ)的纤维化聚集,明显降低了Aβ在体外的神经元毒性。结论:采用AAV载体介导的BSB短肽的分泌表达在体外培养的海马神经元中显示了良好的生物活性。     

不同血清型腺相关病毒载体转染小鼠视网膜后的表达效率

目的:研究不同血清型腺相关病毒 (adeno-associated virus,AAV) 载体介导的外源基因在视网膜中的表达效率, 同时比较AAV载体和两种眼科常用启动子组合后转染小鼠视网膜的表达效率高低,为视网膜色素变性基因治疗选择合适的AAV载体与启动子提供依据。方法:AAV病毒根据衣壳蛋白不同可分为不同血清型,本课题选取视网膜疾病基因治疗中常用的AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9四种血清型AAV载体,并以绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein, GFP) 作为报告基因,用GFP的表达强度判断AAV载体介导的外源基因在视网膜中的表达效率。AAV载体纯化后滴度为1.00×10 ¹³ mg/L,注射1 μL至C57BL/6J小鼠视网膜下腔, 于2周取眼球做成冰冻切片,在共聚焦显微镜下观察 GFP在小鼠视网膜各层的表达情况。选取在感光细胞内特异性表达最强的AAV2/8于第4周取眼球冰冻切片继续观察是否能持续稳定表达。随后选取眼科基因治疗最常用的广谱启动子CMV和由CMV增强子与鸡β-肌动蛋白启动子组成的CAG启动子,并构建AAV2/8-GFP-CMV和AAV2/8-GFP-CAG两种不同启动子的病毒载体注射至视网膜下腔,于2周取眼球做成冰冻切片,在共聚焦显微镜下观察不同启动子的AAV2/8在小鼠视网膜各层的表达情况。结果: 注射AAV-GFP后未见典型的术后细菌感染及明显免疫反应。AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9四种血清型AAV载体视网膜下腔注射2周后,AAV2/8和AAV2/9在小鼠视网膜的GFP绿色荧光明显,说明这两种AAV载体转染小鼠视网膜后的表达效率高,而在这两种血清型中,AAV2/8的GFP绿色荧光主要集中在感光细胞内,AAV2/9 在视网膜全层均有表达,说明AAV2/8对视网膜感光细胞特异性更强。对AAV2/8的进一步实验表明在视网膜下腔注射4周后小鼠视网膜的GFP绿色荧光明显,说明AAV2/8载体介导的外源基因能在体内稳定表达。使用CMV启动子时GFP在感光细胞与视网膜色素上皮细胞均有表达,而使用CAG启动子时GFP主要在感光细胞表达。结论:视网膜下腔注射AAV病毒载体可在视网膜细胞内稳定表达报告基因;AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9四种血清型AAV载体中,AAV2/8和AAV2/9在视网膜表达能力最强,AAV2/8对视网膜感光细胞特异性最好;CMV和CAG两种启动子,CAG启动子对感光细胞特异性更高。     

不同血清型腺相关病毒载体转染小鼠视网膜后的表达效率

目的:研究不同血清型腺相关病毒 (adeno-associated virus,AAV) 载体介导的外源基因在视网膜中的表达效率, 同时比较AAV载体和两种眼科常用启动子组合后转染小鼠视网膜的表达效率高低,为视网膜色素变性基因治疗选择合适的AAV载体与启动子提供依据。方法:AAV病毒根据衣壳蛋白不同可分为不同血清型,本课题选取视网膜疾病基因治疗中常用的AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9四种血清型AAV载体,并以绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein, GFP) 作为报告基因,用GFP的表达强度判断AAV载体介导的外源基因在视网膜中的表达效率。AAV载体纯化后滴度为1.00×10 ¹³ mg/L,注射1 μL至C57BL/6J小鼠视网膜下腔, 于2周取眼球做成冰冻切片,在共聚焦显微镜下观察 GFP在小鼠视网膜各层的表达情况。选取在感光细胞内特异性表达最强的AAV2/8于第4周取眼球冰冻切片继续观察是否能持续稳定表达。随后选取眼科基因治疗最常用的广谱启动子CMV和由CMV增强子与鸡β-肌动蛋白启动子组成的CAG启动子,并构建AAV2/8-GFP-CMV和AAV2/8-GFP-CAG两种不同启动子的病毒载体注射至视网膜下腔,于2周取眼球做成冰冻切片,在共聚焦显微镜下观察不同启动子的AAV2/8在小鼠视网膜各层的表达情况。结果: 注射AAV-GFP后未见典型的术后细菌感染及明显免疫反应。AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9四种血清型AAV载体视网膜下腔注射2周后,AAV2/8和AAV2/9在小鼠视网膜的GFP绿色荧光明显,说明这两种AAV载体转染小鼠视网膜后的表达效率高,而在这两种血清型中,AAV2/8的GFP绿色荧光主要集中在感光细胞内,AAV2/9 在视网膜全层均有表达,说明AAV2/8对视网膜感光细胞特异性更强。对AAV2/8的进一步实验表明在视网膜下腔注射4周后小鼠视网膜的GFP绿色荧光明显,说明AAV2/8载体介导的外源基因能在体内稳定表达。使用CMV启动子时GFP在感光细胞与视网膜色素上皮细胞均有表达,而使用CAG启动子时GFP主要在感光细胞表达。结论:视网膜下腔注射AAV病毒载体可在视网膜细胞内稳定表达报告基因;AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9四种血清型AAV载体中,AAV2/8和AAV2/9在视网膜表达能力最强,AAV2/8对视网膜感光细胞特异性最好;CMV和CAG两种启动子,CAG启动子对感光细胞特异性更高。