携带抑癌基因的重组腺相关病毒载体的构建及病毒包装滴定方法探讨

目的　构建携带多肿瘤抑制基因p16 (mts 1)及抑癌基因p2 1WAF1的腺相关病毒 (AAV)载体 ,通过病毒包装、纯化及滴定 ,获得高纯度高感染性的病毒液 ,为进行肝癌基因治疗的实验研究奠定基础。方法　以p16cDNA及p2 1cDNA全长为目的基因 ,构建AAV载体prAAV AFP p16 ,prAAV AFP p2 1,prAAV CMV p16及prAAV CMV p2 1。其中前两种载体能在人肝癌细胞中特异表达目的基因。应用脂质体将重组载体与辅助质粒PspRC72、腺病毒粘粒共转染包装细胞 ,2d后感染野生型腺病毒 ,至细胞裂解病变明显时收获。纯化后用聚合酶链反应法扩增倍比稀释后病毒液内的甲胎球蛋白或巨细胞病毒启动子DNA ,进行病毒DNA颗粒滴度测定。然后用重组腺相关病毒与腺病毒 (MOI均为 10 )共感染C12细胞 ,至细胞裂解病变明显时再收获。结果　重组载体经酶切鉴定测序证实。 2 93细胞、C12细胞包装病毒效果良好 ,病毒颗粒滴度介于 10 13 ～ 10 14 个 /ml之间。携带GFP的感染性AAV滴度为 5× 10 10 个 /ml。电镜下病毒呈小圆形空斑状 ,直径 2 5～ 30nm。MOI值 10 0时 ,rAAV AFP GFP病毒感染肝癌细胞的阳性率达 70 % ,为携带目的基因的AAV病毒用于肝癌细胞的促凋亡研究提供了定量指标。结论　成功构建了AAV载体 ,探讨了病毒包装方法 ,即第一次转染成功后 ,     

大鼠瘦素基因重组腺相关病毒的构建及在原代神经元细胞中的表达

目的 构建携带大鼠瘦素(Leptin)基因的重组腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),并鉴定其在原代鼠神经元细胞中介导的瘦素过表达,为肥胖症基因治疗研究奠定实验基础。 方法 提取大鼠脂肪组织总RNA,利用RT-PCR技术,获取目的基因瘦素 cDNA,通过重组DNA技术,得到瘦素 cDNA与pGEM-T载体的重组质粒,阳性重组子用PCR及测序分析鉴定。用SpeⅠ和EcoRⅤ双酶切将pGEM-Leptin中的瘦素基因片段切出,再克隆到AAV2表达质粒pTR-UF22中,构建瘦素重组AAV2载体pAAV2-CBA-Leptin。以pDG作为辅助质粒用HEK293细胞包装AAV2-CBA-Leptin,并用一步重力流柱法纯化病毒,由荧光定量PCR测定病毒基因组DNA的拷贝数即为病毒滴度。然后将AAV2-CBA-Leptin 及对照病毒AAV2-CBA-EGFP感染大鼠原代神经元细胞,分别用免疫染色和Western blotting鉴定外源基因在神经元的表达。 结果 测序证实瘦素基因与GenBank 提供的原始序列完全一致。 重组载体经酶切鉴定与预期结果完全一致,HEK293细胞包装病毒效果良好,得到滴度为1.5x1012 vg/ml纯化的重组瘦素病毒AAV2-CBA--Leptin。Western blotting检测显示AAV2-CBA-Leptin能介导瘦素在大鼠神经元细胞中过表达,并随着病毒量的增加而增强。AAV2-CBA-EGFP 感染鼠神经元细胞5天后95%左右的细胞有明显的绿色荧光,免疫染色和DAPI核酸染色显示荧光细胞均为神经元而神经胶质细胞无荧光。 结论 成功构建并包装了瘦素重组AAV2病毒并可介导瘦素在神经元细胞中高效、特异表达,从而为研究瘦素在中枢神经系统控制体重和糖尿病等方面的功能及基因治疗研究打下基础。     

病毒载体介导β折叠阻断肽的表达及其对β淀粉样蛋白神经毒性的抑制作用

目的:通过病毒载体转染体外培养的海马神经元,观察后者表达分泌性的β折叠阻断肽(β-sheet breaker peptide,BSB)的生物活性。方法:采用分子克隆技术构建编码神经营养素4(neurotrophin-4,NT4)信号肽-BSB融合基因的重组腺伴随病毒(recombinant adeno-associated vrius,r AAV)载体,AAV在包装细胞系293细胞中进行包装,蔗糖梯度离心法纯化病毒颗粒,斑点杂交法测定重组病毒滴度。MTT检测及电镜观察BSB的生物学效应。结果:成功构建p SSHG/NT4-BSB质粒载体,纯化后获得滴度为3.6×1012~1.8×1013/m L的病毒颗粒。通过病毒感染培养的神经元分泌表达的BSB有效地抑制了β-淀粉样蛋白(Aβ)的纤维化聚集,明显降低了Aβ在体外的神经元毒性。结论:采用AAV载体介导的BSB短肽的分泌表达在体外培养的海马神经元中显示了良好的生物活性。     

STUB1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人STUB1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体并进行鉴定.方法:针对筛选确定的人STUB1 基因RNAi有效靶点序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Age I 和EcoR I 酶切后的pMagic 4.0载体连接,产生短发卡RNA 慢病毒载体.PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,并包装成慢病毒颗粒.结果:PCR鉴定与DNA测序证实,合成的含STUB1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确.STUB1 shRNA慢病毒载体在293T细胞中成功包装成慢病毒颗粒.结论:成功构建人STUB1基因RNAi慢病毒载体以及包装成功慢病毒颗粒,为研究STUB1在胶质瘤发生发展过程中相关信号通路的作用,提供了稳定感染细胞的载体.     

无辅助病毒HSV-1载体介导LacZ基因在培养皮层神经元中的表达

目的:探讨无辅助单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type-1,HSV-1)载体的包装及其介导LacZ基因在体外培养神经元表达的作用, 解决该载体系统在包装及体外培养神经元应用中的有关问题.方法:将一组含HSV-1基因组的粘粒以限制性内切酶Pac Ⅰ酶切、纯化后,与含LacZ和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)及神经微丝(neurofilament,NF)嵌合启动子的HSV-1质粒DNA在脂质体作用下,共转染2-2细胞;在34 ℃条件下培养72 h,收获病毒颗粒.将含病毒颗粒的上清液,加入BHK细胞培养液中,继续培养24 h后,加X-gal染液作用4 h,观察表达LacZ基因的蓝染细胞.取培养第3天的胚胎大鼠大脑皮层神经元,加入含病毒颗粒的培养液,过夜后更换新鲜培养液,分组继续培养1,7和14 d,进行X-gal染色,光镜下观察.结果:包装形成的病毒颗粒感染BHK细胞,24 h后可见表达LacZ基因的蓝染细胞;感染培养第3天的皮层神经元,继续培养1,7和14 d后均可见蓝染神经元.结论:无辅助病毒包装系统能够使含TH-NF嵌合启动子的HSV-1载体形成有效的病毒颗粒,并且在体外培养神经元中持续稳定地表达外源基因,为在神经系统进行基因转移和基因功能研究提供了有效的工具.     

HBV C区基因真核表达载体的构建及转染

目的构建含乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)增强子Ⅱ(enhancerⅡ,EnhⅡ)、核心启动子区(basal core promoter,BCP)和C区基因的真核表达载体,以研究EnhⅡ、BCP和C区基因的生物功能。方法提取HBV DNA,PCR法扩增EnhⅡ-BCP-C区基因片段;HindⅢ和XbaⅠ双酶切PCR产物,胶回收纯化的DNA片段,连接入载体pBudCE4.1,酶切及DNA测序鉴定重组载体。采用脂质体介导的方法将重组载体DNA转染HepG2细胞和HeLa细胞,酶联免疫吸附试验检测重组载体转染的HepG2细胞、HeLa细胞上清液及细胞裂解物中乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)的表达水平。结果双酶切及DNA测序鉴定,含840 bp HBV EnhⅡ-BCP-C区基因片段的重组载体构建成功。EnhⅡ+BCP+C/pBudCE4.1重组载体转染HepG2细胞24、48 h后的上清液和转染48 h后裂解物中HBeAg表达水平均明显高于pBudCE4.1空载体转染HepG2细胞(均P<0.05),EnhⅡ+BCP+C/pBudCE4.1重组载体转染HeLa细胞24、48 h后的上清液和转染48 h后的裂解物中HBeAg表达水平与pBudCE4.1空载体转染HeLa细胞比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论成功构建HBV EnhⅡ-BCP启动-C基因肝细胞特异表达的真核载体,有利于进一步研究EnhⅡ、BCP和C区基因某些突变位点的生物学意义。     

不同血清型腺相关病毒载体转染小鼠视网膜后的表达效率

目的:研究不同血清型腺相关病毒 (adeno-associated virus,AAV) 载体介导的外源基因在视网膜中的表达效率, 同时比较AAV载体和两种眼科常用启动子组合后转染小鼠视网膜的表达效率高低,为视网膜色素变性基因治疗选择合适的AAV载体与启动子提供依据。方法:AAV病毒根据衣壳蛋白不同可分为不同血清型,本课题选取视网膜疾病基因治疗中常用的AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9四种血清型AAV载体,并以绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein, GFP) 作为报告基因,用GFP的表达强度判断AAV载体介导的外源基因在视网膜中的表达效率。AAV载体纯化后滴度为1.00×10 ¹³ mg/L,注射1 μL至C57BL/6J小鼠视网膜下腔, 于2周取眼球做成冰冻切片,在共聚焦显微镜下观察 GFP在小鼠视网膜各层的表达情况。选取在感光细胞内特异性表达最强的AAV2/8于第4周取眼球冰冻切片继续观察是否能持续稳定表达。随后选取眼科基因治疗最常用的广谱启动子CMV和由CMV增强子与鸡β-肌动蛋白启动子组成的CAG启动子,并构建AAV2/8-GFP-CMV和AAV2/8-GFP-CAG两种不同启动子的病毒载体注射至视网膜下腔,于2周取眼球做成冰冻切片,在共聚焦显微镜下观察不同启动子的AAV2/8在小鼠视网膜各层的表达情况。结果: 注射AAV-GFP后未见典型的术后细菌感染及明显免疫反应。AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9四种血清型AAV载体视网膜下腔注射2周后,AAV2/8和AAV2/9在小鼠视网膜的GFP绿色荧光明显,说明这两种AAV载体转染小鼠视网膜后的表达效率高,而在这两种血清型中,AAV2/8的GFP绿色荧光主要集中在感光细胞内,AAV2/9 在视网膜全层均有表达,说明AAV2/8对视网膜感光细胞特异性更强。对AAV2/8的进一步实验表明在视网膜下腔注射4周后小鼠视网膜的GFP绿色荧光明显,说明AAV2/8载体介导的外源基因能在体内稳定表达。使用CMV启动子时GFP在感光细胞与视网膜色素上皮细胞均有表达,而使用CAG启动子时GFP主要在感光细胞表达。结论:视网膜下腔注射AAV病毒载体可在视网膜细胞内稳定表达报告基因;AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9四种血清型AAV载体中,AAV2/8和AAV2/9在视网膜表达能力最强,AAV2/8对视网膜感光细胞特异性最好;CMV和CAG两种启动子,CAG启动子对感光细胞特异性更高。     

ANG-1基因重组腺相关病毒获取及转染猪骨髓干细胞的研究

目的:构建携带血管形成素-1(ANG-1)基因腺相关病毒(AAV)载体,通过病毒包装和纯化及滴定,获得高纯度高感染性的病毒液,并转染到乳猪骨髓干细胞中,获得有效表达,为进行血管再生的基因治疗研究奠定基础.方法:利用PCR技术,获取目的基因ANG-1,通过重组DNA技术得到ANG-1与pUC119的重组质粒,采用SalⅠ和BglⅡ双酶将pUC119中的目的基因ANG-1基因片断切出,再克隆到质粒pSNAV2.0中.用Lipofectamine将pSNAV ANG-1质粒转染293细胞后,用G418选择培养获得293/AAV2ANG-1细胞株,产生了有传染性的病毒颗粒,纯化并进行病毒DNA颗粒滴度测定.分别将绿色荧光蛋白(GFP)基因重组腺相关病毒(rAAV2GFP)及rAAV2ANG-1感染猪骨髓干细胞,并对转染效率及转染后表达情况进行初步研究.结果:测序证实ANG-1与GenBank提供的原始序列完全一致.重组载体经酶切鉴定与PCR筛选证实重组质粒和预期结果完全一致,在新的重组质粒中,ANG-1有一套CMV启动子和PolyA终止子系统.293细胞包装病毒效果良好,携带ANG-1的感染性AAV滴度为9×1011v.g/ml,用Western杂交法检测显示猪骨髓干细胞中表达ANG-1.1×106v.g/ml rAAV2GFP感染CD34阳性细胞48h后55%左右的细胞有明显的荧光.结论:ANG-1基因AAV构建成功,并能在骨髓干细胞中有效表达,为严重缺血性疾病基因治疗的研究奠定了基础.     

不同血清型腺相关病毒载体转染小鼠视网膜后的表达效率

目的:研究不同血清型腺相关病毒 (adeno-associated virus,AAV) 载体介导的外源基因在视网膜中的表达效率, 同时比较AAV载体和两种眼科常用启动子组合后转染小鼠视网膜的表达效率高低,为视网膜色素变性基因治疗选择合适的AAV载体与启动子提供依据。方法:AAV病毒根据衣壳蛋白不同可分为不同血清型,本课题选取视网膜疾病基因治疗中常用的AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9四种血清型AAV载体,并以绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein, GFP) 作为报告基因,用GFP的表达强度判断AAV载体介导的外源基因在视网膜中的表达效率。AAV载体纯化后滴度为1.00×10 ¹³ mg/L,注射1 μL至C57BL/6J小鼠视网膜下腔, 于2周取眼球做成冰冻切片,在共聚焦显微镜下观察 GFP在小鼠视网膜各层的表达情况。选取在感光细胞内特异性表达最强的AAV2/8于第4周取眼球冰冻切片继续观察是否能持续稳定表达。随后选取眼科基因治疗最常用的广谱启动子CMV和由CMV增强子与鸡β-肌动蛋白启动子组成的CAG启动子,并构建AAV2/8-GFP-CMV和AAV2/8-GFP-CAG两种不同启动子的病毒载体注射至视网膜下腔,于2周取眼球做成冰冻切片,在共聚焦显微镜下观察不同启动子的AAV2/8在小鼠视网膜各层的表达情况。结果: 注射AAV-GFP后未见典型的术后细菌感染及明显免疫反应。AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9四种血清型AAV载体视网膜下腔注射2周后,AAV2/8和AAV2/9在小鼠视网膜的GFP绿色荧光明显,说明这两种AAV载体转染小鼠视网膜后的表达效率高,而在这两种血清型中,AAV2/8的GFP绿色荧光主要集中在感光细胞内,AAV2/9 在视网膜全层均有表达,说明AAV2/8对视网膜感光细胞特异性更强。对AAV2/8的进一步实验表明在视网膜下腔注射4周后小鼠视网膜的GFP绿色荧光明显,说明AAV2/8载体介导的外源基因能在体内稳定表达。使用CMV启动子时GFP在感光细胞与视网膜色素上皮细胞均有表达,而使用CAG启动子时GFP主要在感光细胞表达。结论:视网膜下腔注射AAV病毒载体可在视网膜细胞内稳定表达报告基因;AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9四种血清型AAV载体中,AAV2/8和AAV2/9在视网膜表达能力最强,AAV2/8对视网膜感光细胞特异性最好;CMV和CAG两种启动子,CAG启动子对感光细胞特异性更高。     

hTWEAK基因重组慢病毒载体构建、病毒包装及蛋白表达分析

目的:构建携带人肿瘤坏死因子样微弱凋亡诱导剂(hTWEAK)基因的慢病毒表达载体,体外包装成病毒颗粒,并分析其感染人肝癌细胞HepG2后TWEAK的表达情况。方法:以pORF5-TWEAK为模板,采用普通PCR扩增TWEAK基因,通过酶切、连接等步骤构建Plentilox3.7-TWEAK重组质粒,利用酶切和测序的方法对重组质粒进行鉴定。在293T细胞中包装含TWEAK基因的慢病毒颗粒并感染HepG2细胞,采用荧光定量PCR和Western-blot检测TWEAK表达水平,并通过间接免疫荧光(IMF)检测其细胞表达定位。结果:酶切与测序结果证明重组质粒构建成功,并能在293T细胞中与病毒包装质粒成功包装病毒颗粒。病毒转染的HepG2细胞中,TWEAK基因mRNA表达量约为对照组的500倍,TWEAK蛋白表达量明显高于对照组,且主要定位于胞浆。结论:本研究成功构建了含人TWEAK基因的慢病毒表达载体,其可在人肝癌细胞系HepG2中稳定表达,为后续的功能学研究打下了基础。     

rAAV2-slug-siRNA对原位胰腺癌移植瘤转移和血管生成影响的实验研究

目的:研究slug基因的RNA干扰重组腺病毒载体(rAAV2-slug-siRNA)对原位胰腺癌移植瘤的转移和血管生成的影响。方法:建立胰腺癌细胞株AsPC-1裸鼠原位胰腺癌移植瘤模型,随机分成3组,每组8只,分为空白对照组(腹腔注射生理盐水)、阴性对照组(腹腔注射rAAV2-GFP)、实验组(腹腔注射rAAV2-slug-siRNA)。10周后利用CO2麻醉法处死裸鼠,观察原位胰腺癌移植瘤的重量,抑瘤率,肝、胃肠、腹腔转移,腹水等情况,及肿瘤细胞微血管密度(MVD)。RT-PCR检测移植瘤的slug mR-NA表达,Western blot检测slug蛋白的表达。结果:胰腺癌细胞株AsPC-1裸鼠原位胰腺癌移植瘤模型建立成功,成瘤率100%。实验组原位胰腺癌移植瘤瘤重明显低于阴性对照组(P<0.05),抑瘤率为70.83%。阴性对照组诱发的裸鼠胰腺癌质地硬,肿块向四周浸润并形成癌性粘连,与阴性对照组相比,实验组腹膜、肝、毗邻脏器转移率和形成腹水率均明显下降(P<0.05)。实验组MVD明显少于阴性对照组(P<0.05),slug mRNA相对表达量(RT-PCR)和slug蛋白相对表达量(Western blot)明显低于阴性对照组(P<0.05)。结论:rAAV2-slug-siRNA可能通过抑制肿瘤血管生成而抑制原位胰腺癌移植瘤转移。     

rAAV1-EGFP和rAAV2-EGFP转染犬骨髓间充质 干细胞的比较

 【目的】 研究不同血清型腺相关病毒(rAAV)载体介导的增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)对体外培养犬骨髓间充质干细胞(MSC)的转染效率及其毒性作用&#65377;【方法】 应用密度梯度离心法及贴壁筛选法分离培养犬MSC,倒置显微镜及Giemsa染色观察细胞形态,透射电镜观察其超微结构,流式细胞仪鉴定其表面标记物&#65377;取第3代MSC,以MOI为104 ~ 105 v.g./cell 的rAAV1-EGFP 和rAAV2-EGFP进行转染,3 d&#65380;7 d&#65380;21 d后荧光显微镜观察检测转染效率;MTT法检测rAAV1-EGFP 和rAAV2-EGFP对MSC的毒性作用&#65377; 【结果】 原代及传代培养的MSC呈梭形外观,具有较强的增殖能力&#65377;MSC超微结构显示其胞体较小,细胞核/浆比例大,胞浆少,染色质较疏松&#65377;细胞表面抗原CD29&#65380;CD44表达阳性,CD34表达阴性&#65377;随MOI的增加及时间的延长,rAAV1-EGFP&#65380;rAAV2-EGFP对犬MSC的转染效率逐渐增加,rAAV2-EGFP转染效率明显高于rAAV1-EGFP(P < 0.01)&#65377;转染MSC细胞后,细胞生长正常,MTT法显示各转染组与未转染组的OD值无统计学差异(P > 0.05)&#65377; 【结论】 相对犬MSC,rAAV2是一种比rAAV1更优越的转基因载体,而且对细胞生长无明显抑制,做为组织工程种子细胞的载体是安全可行的&#65377;     

重组AAV1/hFIX病毒制备及其体外转导培养细胞的实验研究

目的 制备携带人凝血因子IX基因的重组AAV1病毒(rAAV1/hFIX),体外转导C2C12细胞并检测hFIX的表达.方法 通过"一株栽体细胞/一株辅助病毒"的双因素包装策略制备出rAAV1/hFIX,体外转导C2C12细胞后,检测细胞上清中FIX的表达量.结果 制备出了高纯度的rAAV1/hFIX病毒,转导C2C12细胞24 h后在上清中即可检测到hFIX,连续检测了120 h都有表达,24 h最高表达量高达到(68.0±3.2)ng/24h.结论 制备的rAAV1/hFIX病毒在体外培养细胞中能高水平表达hF1X,为应用基因治疗裁体治疗血友病B的体内实验奠定了基础.     

重组AAV1-Luc病毒制备及体外转导培养细胞的特性

目的制备携带萤火虫荧光素酶基因的重组AAV1病毒（rAAV1-Luc）,研究该病毒体外转导培养细胞的特性。方法通过“1株载体细胞/1株辅助病毒”的双因素包装策略制备出rAAV1-Luc,研究该重组病毒体外转导哺乳动物细胞的量效关系,肝素对转导的拮抗作用、rAAV1的竞争抑制作用及丁酸钠对表达水平的增强作用。结果在一定范围内,随着rAAV1-Luc感染细胞的感染复数（MOI,即每个细胞感染的病毒基因组数）值增高,荧光素酶的表达水平也增高;但更高的MOI（〉10^7）反而使荧光素酶的表达水平下降。肝素不能特异性阻断rAAV1介导的荧光素酶表达。携带不同基因的2种rAAV1病毒相互具有明显的竞争抑制作用。丁酸钠可显著增强rAAV1介导的荧光素酶表达水平。结论该研究揭示了rAAV1载体一定的细胞转导特性,对应用rAAV1载体介导基因转移研究具有指导意义。     

rAAV/BA46转染树突状细胞诱导特异细胞免疫

目的 探讨以腺相关病毒为载体,乳腺癌抗原BA46基因转染树突状细胞(DC)诱导特异细胞免疫的可行性.方法 取健康人外周血,采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(DC前体细胞),将细胞分为基冈转染组及对照组,基因转染组以重组腺相关病毒rAAV/BA46/Neo转染,对照组以293细胞裂解物冲击.两组细胞均采用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导DC前体细胞成熟.第7天,收集DC,取该DC与T细胞按比例混合,诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL),用3H-TdR掺入法检测DC刺激自体淋巴细胞增殖能力;以流式细胞仪分析CTL细胞中IFN-γ、IL-4、CD4、CD8、CD25、CD69的表达情况,同时取BA46阳性的乳腺癌细胞株Hs578T为靶细胞,采用51Cr释放法检测杀伤效率.结果 BA46基凶转染组DC具备较强的刺激淋巴细胞增殖的能力,所诱导的CTL高表达CD8、CD69和IFN-γ,对BA46阳性的靶细胞有较强的杀伤作用,该杀伤具有BA46抗原特异性和MHC限制性.结论 乳腺癌BA46基因转染DC成功诱导特异的细胞免疫.为基因修饰细胞治疗乳腺癌打下实验室基础.     

Ad/rAAV杂合体病毒介导抗HBV shRNA表达框定点整合研究

目的 探讨解决RNS干扰(RNA interference,RNAi)抗HBV作用时间短暂的问题.方法 构建腺病毒/重组腺相关病毒(Adenovirus/recombinant adenovirus associated virus,Ad/rAAV)杂合体病毒,恢复rAAV的定点整合,并借助定点整合的rAAV持续表达shRNA(short hepair RNA),实现RNAi抗HBV的持久性.结果 Ad/rAAV杂合体病毒感染靶细胞后,Rep基因可以在HBV感染细胞中表达,hU6shRNA表达框可以定点整合于细胞基因组AAVS1(adeno-associated virus integration site,腺相关病毒整合位点)中.结论 利用Ad、AAV和HBV各种元件构建Ad/rAAV杂合体病毒,作为抗HBV的shRNA表达框的栽体,为解决RNAi抗HBV作用时间短暂的问题作了一些技术上的探索.     

RGD-rAAV2提高卵巢癌细胞体外基因转导效率的研究

目的 进一步证实精氨酸-甘氨酸天冬氨酸-重组腺相关病毒2（RGD-rAAV2）基因表达系统靶向卵巢肿瘤的能力。方法 用流式细胞仪（FACS）检测6种卵巢癌细胞株的硫酸肝素蛋白多糖（HSPG）、整合素（integrin）α，β3和integrin αvβ5的表达；以及野生型腺相关病毒2（wt-AAV2）对上述卵巢癌细胞感染并介导基因转导的能力；通过配体竞争结合实验进一步验证突变体RGD-rAAV2基因转导的特异性。结果 wt-AAV2感染不同卵巢癌细胞的能力各有不同；卵巢癌细胞表达HSPG水平差异很大，而80％卵巢癌细胞表达integrin αvβ3或（和）integrin αvβ5；RGD-rAAV2病毒载体可以有效地感染对wt—rAAV2耐受的卵巢癌细胞SKOV-3ip并介导基因的表达，该效果是非HSPG依赖性的。结论 RGD-rAAV2病毒载体具有较高的卵巢肿瘤靶向性，为卵巢癌基因靶向治疗提供了一种新的策略。     

rAAV介导血管生长素基因转染改善心肌梗死大鼠左室重构

目的 观察腺相关病毒介导的血管生长素(ANG)基因转染对心肌梗死(MI)大鼠左室心肌组织ANG蛋白表达、毛细血管密度和左室重构的影响.方法 成年雄性Wistar大鼠,随机分为假手术组(sham-operation)、心肌梗死心肌内注射rAAV-lacZ组(MI-rAAV-lacZ)和心肌梗死心肌内注射rAAV-ANG组(MI-rAAV-ANG).直视下结扎冠状动脉左前降支建立MI模型,冠脉结扎后立即取rAAV-lacZ或rAAV-ANG梗死区周围四个点注射.四周后处死大鼠,左室称重,计算左室重量与体重比值.Western blot方法检测心肌组织ANG蛋白表达水平;免疫组化方法检测vWF表达以评价心肌组织毛细血管密度;组织学切片上测量非梗死区心肌细胞的横径和心肌间质纤维沉积指数.结果 与sham-operation组和MI-rAAV-lacZ组相比,MI-rAAV-ANG组大鼠左室心肌组织ANG水平显著升高;左室非梗死区毛细血管密度在MI-rAAV-lacZ组大鼠显著下降,而MI-rAAV-ANG组则与sham-operation组无显著差异;MI-rAAV-lacZ组大鼠表现出显著的左室非梗死区重构,包括左室重量增加、非梗死区心肌细胞横径增加、心肌间质纤维沉积增多,这些指标在MI-rAAV-ANG组与sham-operation组之间无显著差异.结论 用心肌内注射方式转染rAAV-ANG可显著上调MI大鼠左室心肌ANG蛋白表达,诱导新血管生成,改善MI后左室重构.     

小鼠microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体的构建及鉴定

目的 构建microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体.方法 设计针对microRNA-150前体的过表达基因片段及针对microRNA-150成熟体的反义片段,应用基因重组技术将目的 基因片段克隆到pWPI慢病毒载体中,并进行DNA测序鉴定重组克隆.结果 菌落PCR筛选鉴定出构建正确的慢病毒载体,DNA测序证实插入的基因序列正确.结论 成功构建microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体,为研究microRNA-150在肝再生中的作用及其机制提供了稳定的细胞转染载体.     

重组病毒rAAV2-PD-L1的构建及其转染小鼠血管内皮细胞的生物学效应

目的:构建腺相关病毒rAAV2介导的PD-L1表达系统,检测感染rAAV2-PD-L1的血管内皮细胞共刺激T细胞分泌细胞因子的作用.方法:以鼠肝脏组织来源的总RNA为模板,应用RT-PCR扩增PD-L1 cDNA,克隆入穿梭质粒pSNAV1,脂质体法转染包装细胞BHK21,筛选获得重组病毒rAAV2-PD-L1.以rAAV2-PD-L1感染小鼠血管内皮细胞株2F-2B后,与活化的小鼠T 细胞共培养,ELISA法检测培养上清IFNγ浓度.结果:测序结果表明,克隆的小鼠PD-L1 cDNA和重组质粒pSNAV-PD-L1序列正确.重组病毒rAAV2-PD-L1经PCR扩增出目的基因片段,在SDS-PAGE电泳上显示AAV2三条特征带,纯度大于98%.病毒物理滴度为4×1012 virus genome/ml;蛋白浓度为0.355 mg/ml.感染rAAV2-PD-L1的血管内皮细胞高表达PD-L1.活化T细胞与其共培养后,培养上清IFNγ浓度显著降低.结论:构建的重组病毒rAAV2-PD-L1可感染血管内皮细胞,并且共刺激可抑制活化T细胞分泌IFNγ.