人碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及表达

目的: 构建研究人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体,并在体外进行表达和检测.方法: 从骨髓基质干细胞中分离总RNA,进行RT-PCR 获得人bFGF cDNA.测序证实其结果正确后,构建真核表达载体.并经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定.利用Blast程序,搜索NCBI GenBank中与重组质粒(pVAX1-bFGF)中编码bFGF基因同源的序列.通过脂质体将重组质粒转染入骨髓基质干细胞,使用间接免疫荧光法进行表达产物检测.结果: 经EcoRⅠ/Pst BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证实,人bFGF基因成功地克隆到真核表达载体pVAX1中;pVAX1- bFGF中编码bFGF的序列与GenBank中所报道的bFGF编码序列完全一致;间接免疫荧光结果显示转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光.结论: 成功地构建了人bFGF真核表达载体,其可以在体外进行表达.     

新基因PRR11的克隆、真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆新基因PRR11的开放阅读框区,构建其真核表达载体,并进行表达检测及鉴定。方法：以HeLa细胞cDNA为模板,半定量RT-PCR扩增PRR11基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,酶切、测序鉴定确认获得PRR11基因的重组真核表达载体pcDNA3.1-PRR11。然后将pcDNA3.1-PRR11重组载体转染入HeLa细胞中,收集细胞,制备总RNA和细胞裂解液,采用半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹法检测目的基因表达情况。结果：成功扩增了PRR11基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,测序结果表明序列完全正确,pcDNA3.1-PRR11真核重组表达载体构建成功。半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹法证实了转染入HeLa细胞中的目的基因表达成功。结论：成功构建了PRR11基因的真核表达载体,并可在HeLa细胞中成功表达,为进一步研究PRR11基因的功能奠定了基础。     

幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白A真核表达载体的构建与表达

目的构建幽门螺旋杆菌（Helieobaeterpylori,Hp）细胞毒素相关蛋白A（cytotoxin—associatedprotein,CagA）基因表达载体并表达其编码蛋白。方法从胃黏膜活检标本中分离Hp,提取核酸,采用RT—PCR技术扩增CagA基因,将其克隆至pEGFP真核表达载体中,构建HpCagA基因真核表达载体并转染293-T细胞表达其编码蛋白。结果通过PCR、双酶切、测序鉴定证实CagA基因的真核表达载体构建成功,免疫印迹法证实CagA蛋白的表达。结论成功构建了HpCagA基因真核表达载体并表达其编码蛋白,为后期功能研究提供了材料和基础。     

神经营养素3基因克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大鼠神经营养素-3(NT-3)基因的表达序列,构建大鼠NT-3基因真核表达载体.方法 应用RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增NT-3基因cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中构建重组质粒pcDNA3-N3,用限制酶酶切鉴定和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 RT-PCR产物为822 bp的特异片段,重组质粒酶切后产生822 bp和5.2 kb片段,DNA测序证实822 bp片段的碱基序列与大鼠NT-3 cDNA序列完全一致.结论 成功克隆大鼠NT-3基因表达序列并构建了NT-3基因真核表达载体pcDNA3-N3.     

SDF-1α基因真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建SDF-1α真核表达载体，为研究SDF-1α基因功能提供工具。方法：从大鼠平滑肌细胞中提取总RNA，采用RT-PCR技术扩增SDF-1α的基因编码区序列，将序列定向克隆至真核表达载体pcDNA3．1上，并用PCR、酶切法和DNA测序鉴定。结果：PCR和限制性内切酶分析鉴定，表明获得重组质粒pcDNA3．1／SDF-1α。通过对SDF-1α基因编码区cDNA序列测序证实其与GenBank中的已知序列一致。结论：成功构建了SDF-1α真核表达载体，为SDF-1α基因功能研究奠定基础。     

TIMP-1绿色荧光蛋白真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建并鉴定TIMP-1绿色荧光蛋白真核表达载体.方法:提取胃癌组织总RNA,用TIMP-1基因引物进行RT-PCR,将扩增产物克隆至pGEM-T载体,PCR鉴定及测序证实后,BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pGEM-T-TIMP-1重组体,回收TIMP-1,再将其亚克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C3中,并对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析.结果:构建的pEGFP-C3-TIMP-1表达载体分别作PCR及双酶切鉴定,证实其中有目的片段完整插入,插入片段测序结果与TIMP-1序列设计完全一致,将其转染人胃癌BGC-823细胞后,TIMP-1的表达定位在细胞胞浆内.结论:成功构建了TIMP-1绿色荧光蛋白真核表达载体,为TIMP-1的肿瘤靶向治疗研究奠定了基础.     

大鼠Neurogenesin-1基因真核表达载体的构建及在cos-7细胞中的表达

目的 克隆大鼠海马中Neurogenesin-1(Ng1)基因片段,构建pSecTag2/Hygro B-Ng1真核表达载体,并检测其在cos-7细胞中的表达,为进一步研究该基因对脊髓神经干细胞分化的影响提供实验依据.方法 在无RNA酶污染的条件下提取出大鼠海马总RNA.利用逆转录聚合酶链反应扩增出Ng1基因片段.将该基因片段连接到真核表达载体pSecTag2/Hygro B,聚合酶链反应初步筛选,双酶切鉴定后送测序.将构建成功的重组真核表达载体转染入cos-7细胞,Western blot鉴定重组Ng1蛋白的表达. 结果 逆转录聚合酶链反应成功获得大鼠Ng1 cDNA.随机挑选10个重组真核表达载体的克隆,聚合酶链反应筛选出阳性克隆2个,经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组质粒构建成功.脂质体介导转染cos-7细胞48 h后,Western blot鉴定重组Ng1蛋白在cos-7细胞中的表达,在46 ku处出现阳性条带. 结论 大鼠海马Ng1基因的真核表达载体pSecTag2/Hygro B-Ng1构建成功,转染cos-7细胞后能够表达重组Ng1蛋白.     

pcDNA3.1-mAFP真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的构建真核表达载体pcDNA3．1-mAFP，观察其在293肿瘤细胞中的表达情况。方法从Hepal-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA，设计特异性引物，通过RT-PCR法扩增小鼠甲胎蛋白（mAFP）基因编码区全长序列，测序确认后，插入到pcDNA3．1真核表达载体中，双酶切鉴定。用Lipofectamine脂质体将构建的重组载体转染293肿瘤细胞，检测AFP蛋白在293细胞中的表达情况。结果成功克隆了mAFP基因编码区全长序列，构建出重组真核表达载体pcDNA3．1-mAFP，脂质体转染后可检测到mAFP基因在293细胞中的表达。结论该研究成功构建了重组pcDNA3．1-mAFP真核表达载体，为进一步开展原发性肝癌的靶向性基因治疗奠定了基础。     

uPA基因真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建人尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)基因真核表达载体,并转染人肝癌细胞,为进一步体外研究uPA在肝癌发生发展中的作用奠定基础.方法:从肝癌组织中提取RNA,通过RT-PCR的方式,获得基因uPA的全长cDNA,并克隆于含有HA2-标签(tag)的真核表达载体pCMV上,酶切鉴定,质粒测序鉴定,用pCMV-uPA-HA2进行细胞瞬时转染及WesternBlotting鉴定.结果:经过测序证实得到获得包含uPA基因的pCMV-HA2真核表达载体,瞬时转染细胞有蛋白表达.结论:克隆了人肝癌的uPA基因,成功构建真核表达载体.     

未知基因CGI-100的克隆及其真核表达载体的构建

目的:为探讨研究未知基因CGI-100的功能,克隆人CGI-100基因并构建其真核表达载体.方法:通过RT-PCR从人白血病K562细胞中克隆CGI-100基因全长编码区,将该cDNA片段亚克隆至载体pMD18-T SimpleT中,经测序鉴定后,用BamH Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切将目的cDNA片段定向克隆至相同处理的pIRES2-EGFP真核表达质粒中,然后经酶切、PCR鉴定和DNA序列测定三重鉴定方法对重组质粒进行鉴定.结果:经酶切、PCR及测序鉴定证实,CGI-100基因全长编码区cDNA被准确正向插入至pIRES2-EGFP质粒的酶切位点BamH Ⅰ和Pst Ⅰ之间,未发现碱基突变或移位.结论:成功地构建并鉴定了含CGI-100基因全长编码区的真核表达质粒,为以后研究该基因的功能奠定了基础.     

增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记的原核表达栽体,并观察EGFP基因在大肠杆菌中的表达情况.方法 据已知的EGFP基因序列,设计引物,并引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点.采用PCR技术从含有EGFP的质粒pEGFP-C1中克隆EGFP编码序列;将其亚克隆入表达载体pTWIN1,得到以EGFP为标记的原核表达载体pTWIN-EGFP.转化大肠杆菌ER2566菌株,IPTG诱导EGFP基因表达.结果 经过IPTG诱导后,细菌培养物在长波紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光.结论 成功构建了原核表达载体pTWIN-EGFP,为应用EGFP作为报告基因和筛选标记奠定了实验基础.     

人Leptin的高效表达、纯化及生物学活性研究

将人Leptin表达质粒pBV200-OB转化宿主菌E.coli JM109,热诱导获得目的蛋白的表达.经SDS-PAGE鉴定分析,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40%以上,且以包涵体的形式表达.通过包涵体分离,Sephacryl S200HR凝胶和DEAE52离子交换层析及Hypersil C18柱反相色谱纯化,获得纯度在95%以上,内毒素含量小于10EU/Mg的高纯度的重组人Leptin.Western-blot鉴定表明,纯化表达产物能和抗Leptin抗体特异结合;蛋白质N端15个氨基酸序列分析结果和预期的序列一致.纯化产物经复性处理,其分子中Cys96和Cys146形成二硫键.体内活性检测显示,纯化和复性的rh-Leptin明显抑制BALB/c小鼠的进食和体重增长,提示其具有明显的生物学活性.     

hTEFT重组绿色荧光表达载体的构建与表达

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒。方法用RT-PCR方法从肝癌组织中提取总RNA扩增出hTERT基因片段,将其连接pGEM-TEasy质粒上,将重组质粒pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3真核绿色荧光蛋白表达载体同时用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后进行连接,再将重组的pEGFP-C3-hTERT基因片段转染NIH3T3细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞系,荧光倒置显微镜观察并检测转染细胞的hTERTmRNA表达水平。结果DNA序列分析证实了重组载体pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3-hTERT内插入片段的碱基组成与公开发表的hTERT序列一致。转染pEGFP-C3-hTERT的NIH3T3细胞可见绿色荧光,并检出高水平表达的hTERT。结论成功构建高效表达hTERT的真核表达载体,为以hTERT为靶点的肿瘤治疗打下实验基础。     

凋亡抑制蛋白Livin真核表达载体的构建及表达

目的:构建凋亡抑制蛋白Livin真核表达载体pIRES2-AcGFP-Livin。方法:设计合成扩增Livinα和Livinβ基因全长cDNA序列的特异性PCR引物,以食管鳞状细胞癌EC9706细胞总RNA为模板,进行RT-PCR,将获得的cDNA序列克隆入T载体,再用BglⅡ和EcoRⅠ双酶切,亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP,将重组质粒用脂质体包裹转染NIH3T3细胞,G418筛选得到稳定表达的细胞克隆,Western-blot检测转染细胞Livinα和Livinβ蛋白的表达情况。结果:构建了真核表达载体pIRES2-AcGFP-Livinα和pIRES2-AcGFP-Livinβ,测序分析证实插入序列正确;转染的NIH3T3细胞,可稳定表达Livinα或Livinβ蛋白。结论:成功构建Livinα和Livinβ真核表达载体。     

gp350胞外段基因表达载体的构建与表达

目的 构建gp350与C3d融合基因表达载体,并在体外进行表达和鉴定.方法 以pGEX-gp350为模板,经PCR获得长846bp的gp350胞外段(25-870),将该扩增片段插入pSG.SS.C3d3.YL载体,构建pSG.SS.gp350.C3d3.YL表达质粒.经限制性内切酶鉴定和DNA序列测定证实后,将该质粒转染Hela细胞,检测其体外表达.结果 免疫细胞化学分析结果表明转染细胞有目的 分子的表达. 结论 构建的重组载体可在真核细胞内正确表达,这为基于gp350的鼻咽癌预防性疫苗下一步的动物实验奠定了基础.     

TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coli BL21中高效表达并纯化.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白.结果及结论:成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础.     

maspin/pEFIRES-N表达载体的构建及应用

目的构建maspin/pEFIRES-N表达载体,为深入研究maspin基因抑制肝癌生长、转移、浸润作用和机制奠定基础.方法 PCR扩增maspin基因全长,将表达载体pEFIRES-N用EcoRⅠ XbaⅠ进行双酶切后,T4DNA连接酶连接成重组质粒,稳定转染到肝癌高转移细胞株mHCC-97中进行表达,检测稳定转染前后maspin表达的变化.结果重组质粒在大肠杆菌株JM109内扩增.提纯、纯化后用EcoRⅠ、XbaⅠ酶切鉴定及测序鉴定证明maspin基因已完整、正确的插入到pEFIRES-N表达载体,并在肝癌MHCC-97细胞中上调了maspin基因mRNA和蛋白水平表达,抑制了肝癌MHCC-97细胞增殖及浸润.结论成功构建了maspin/pEFIRES-N表达载体,能在真核细胞中表达.     

小鼠GITR真核表达载体的构建及表达

目的:构建小鼠GITR(mGITR)的真核表达载体,转染COS-7 细胞表达小鼠GITR 蛋白.方法:用TRIzol 试剂抽提小鼠脾细胞总RNA,经RT-PCR 扩增出GITR 全长基因,构建真核重组载体pIRES2-EGFP-mGITR,经鉴定后采用脂质体介导DNA 法转染COS-7 细胞.结果:从小鼠脾细胞中成功扩...     

人DC-SIGN真核表达载体的构建及表达

目的构建含有FLAG标签的人DC—SIGN真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法通过PCR方法获得含有FLAG标签的人DC—SIGN分子基因,将其插入到真核表达载体pIRES—neo中。构建的重组质粒pIRES—neO—FLAG—DC—SIGN转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及WesternBlot检测其表达情况。结果含FLAG标签的人DC—SIGN基因测序正确,PCR和酶切鉴定证明FLAG—DC—SIGN基因已成功连入真核表达载体pIRES—neo中;检测结果显示重组质粒pIRES—neo—FLAG—DC—SIGN在293T细胞中得到表达。结论成功构建了重组质粒pIRES—neo—FLAG—DC—SIGN,且在293T细胞中能有效表达,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础。