三种抗纤维化细胞因子对HepG2细胞转化生长因子-β1基因启动子转录活性的影响

目的:观察抗肝纤维化细胞因子白介素10(IL-10)、肝细胞生长因子(HGF)和干扰素γ(IFN-γ)对含不同-509C＞T基因型的转化生长因子β1(TGF-β1)基因上游启动子转录活性的影响,探讨细胞因子可能的抗肝纤维化机制.方法:以TGF-β1基因上游5'侧翼区启动子(-1328 ～ 812)含有-509C＞T 位点的片段作为靶序列,将其与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因组成重组体phTGF2.14C、phTGF2.14T,脂质体法转染至人肝癌细胞系HepG2,应用IL-10(4 ng/ml)、HGF(10 ng/ml)和IFN-γ(20 ng/ml)作用于转染后HepG2细胞,ELISA法测定报告基因的表达.结果:转染phTGF2.14C的HepG2细胞报告基因活性明显高于转染phTGF2.14T者(P＜0.01).IFN-γ对转染phTGF2.14C、phTGF2.14T的HepG2细胞TGF-β1启动子转录活性均具有明显的抑制作用(P＜0.05),HGF对转染phTGF2.14C HepG2细胞的TGF-β1启动子转录活性具有促进作用(P＜0.05),IL-10对两种情况下HepG2细胞TGF-β1启动子转录活性调控作用均不显著.结论:C等位基因可明显增强TGF-β1基因启动子转录活性;IFN-γ可能通过抑制TGF-β1基因启动子转录活性抑制肝纤维化,而HGF、IL-10的抗纤维化作用可能与此途径无关.     

EOLA1基因5'侧翼区的克隆及调控功能初步研究

目的研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(endothelial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1)基因5'侧翼区的调控序列.方法通过基因组步移克隆EOLA1基因5'侧翼区不同长度的片段,插入β-半乳糖苷酶(β-gal)报告基因载体,分析各片段在ECV304细胞中的β-gal调节活性.结果含EOLA1基因5'侧翼区-1～-2 659 bp和-1～-1 951 bp序列的重组质粒在ECV304细胞中能明显表现β-gal上调活性,而-1～-361 bp序列的重组质粒活性无明显变化.结论 EOLA1基因5'侧翼区-361～-1 951 bp内存在基因转录启动子元件.     

EOLA1基因5′侧翼区的克隆及调控功能初步研究

目的研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(endothelial overexpressedlipopolysaccharide associatedfactor1,EOLA1)基因5′侧翼区的调控序列。方法通过基因组步移克隆EOLA1基因5′侧翼区不同长度的片段,插入β半乳糖苷酶(βgal)报告基因载体,分析各片段在ECV304细胞中的βgal调节活性。结果含EOLA1基因5′侧翼区-1～-2659bp和-1～-1951bp序列的重组质粒在ECV304细胞中能明显表现βgal上调活性,而-1～-361bp序列的重组质粒活性无明显变化。结论EOLA1基因5′侧翼区-361～-1951bp内存在基因转录启动子元件。     

CCR5基因5′侧翼区的克隆及调控功能初步研究

目的 :研究CCR5基因 5′侧翼区的调控序列。方法 :分段构建CCR5基因 5′侧翼区的pCAT报告基因载体 ;分析各片段在Hela细胞中的CAT调节活性。结果 :CCR5基因 5′侧翼区基因 - 1～ - 4 86bp序列的pCAT重组质粒在Hela细胞中能明显表现CAT上调活性 ,其活性比pCATenhancervector的活性高 3倍。结论 :CCR5基因 5′侧翼区基因 - 1～ - 4 86bp序列中存在基因转录上调元件     

大肠癌相关基因ST13转录启动区的增强子研究

目的:探讨大肠癌相关基因ST13上游5'近端调控区(-595～ 74)中增强子碱基序列.方法:设计系列缺失PCR引物,扩增ST13基因5'近端碱基序列片段,pGEMT-EASY克隆、测序,再亚克隆到pGL2系列瞬间报告载体上,等量转染SW620细胞,检测荧光酶活性.结果:系列扩增碱基序列片段669 bp、263 bp、163 bp对pGL2-Basic中的荧光素酶基因均具有较强的启动表达作用,片段101 bp、47 bp则几乎没有启动下游基因表达的作用.而101 bp片段与系列报告载体pGL2重组的分子,在其中含有启动子的报告基因表达载体中具有明显的增强作用(P＜0.01),但作用强度小于阳性对照pGL2-Control(P＜0.05).结论:位于ST13基因上游5'近端调控区的碱基序列101 bp片段(-595～-494),是一个基因转录调控增强子.     

β1整合素启动子荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

目的克隆β1整合素(CD29)启动子区基因全长序列,构建并鉴定β1整合素启动子全长序列荧光素酶报告基因载体pGL3-β1。方法以含β1整合素启动子基因全长序列的基因片段(2 735 bp)的重组pGEM-T easy载体为模板,用含有酶切位点的特异性引物扩增出整合素β1启动子基因全长序列1 756 bp,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-basic,构建含正确目的基因的表达载体pGL3-β1,并NheⅠ、XhoⅠ酶切、PCR及测序鉴定;并以该质粒转染人表皮细胞株HaCaT进行活性检测。结果酶切、PCR及序列测定表明,克隆获得的1 756 bp与GenBank DNA序列数据库对比分析序列一致,插入方向正确;且pGL3-β1启动子在人表皮细胞株HaCaT中有明显转录活性。结论成功构建了β1整合素启动子基因全长序列荧光素酶报告基因载体,为下一步研究人β1整合素启动子的活性分析、基因表达调控机制及其信号转导通路等研究奠定基础。     

Nox1基因启动子表达载体的构建

目的 克隆烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(Nox)上游启动子序列,为研究Nox1基因的转录调控奠定基础.方法 以人基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得1 415 bp(-1415～0)、1 276 bp(-1415～-140)、997 bp(-1415～-419)、839 bp(-1415～-577)、470 bp(-1415～-946)大小的Nox1启动子片段,将其定向克隆人pGL3-Basic荧光素酶表达载体,构建荧光素酶报告基因载体,进行真核细胞转染后鉴定目的片段启动子活性.结果 在A549细胞中,各Nox1启动子片段均有活性;-140～-419 bp和-577～-946 bp区域可能存在Nox1启动子核心区域.结论 成功克隆了在肺泡上皮样细胞中具有活性的Nox1启动子序列,为进一步研究Nox1基因的转录调控机制奠定了基础.     

CCR5基因5′侧翼区的克隆及调控功能初步研究

目的：研究CCR5基因5′侧翼区的调控序列。方法：分段构建CCR5基因5′侧翼区的pCAT报告基因载体；分析各片段在Hela细胞中的CAT调节活性。结果：CCR5基因5′侧翼区基因－1～-486bp序列的pCAT重组质粒在Hela细胞中能明显表现CAT上调活性，其活性比pCAT enhancer vector的活性高3倍。结论：CCR5基因5′侧翼区基因－1～-486bp序列中存在基因转录上调元件。     

Noxl基因启动子表达载体的构建

目的克隆烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（Nox）上游启动子序列,为研究Noxl基因的转录调控奠定基础。方法以人基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得1415bp（-1415-0）、1276bp（-1415～-140）、997bp（-1415～-419）、839bp（-1415～-577）、470bp（-1415～-946）大小的Noxl启动子片段,将其定向克隆入pGL3-Basic荧光素酶表达载体,构建荧光素酶报告基因载体,进行真核细胞转染后鉴定目的片段启动子活性。结果在A549细胞中,各Noxl启动子片段均有活性;-140～-419bp和-577～-946bp区域可能存在Noxl启动子核心区域。结论成功克隆了在肺泡上皮样细胞中具有活性的Noxl启动子序列,为进一步研究Noxl基因的转录调控机制奠定了基础。     

SRY基因启动子不同模块的克隆及功能分析

采用报告基因分析的方法 ,构建SRY基因 5′旁侧具有启动效应的 5 44bp以内不同长度片段与荧光素酶报告基因载体PGL2 Enhancer的重组子 ,并通过脂质体转染技术导入Hela细胞 ,检测各重组子报告基因的瞬间表达 ,由此分析启动子不同模块对基因转录效率的影响。结果显示 :位于起始密码子ATG上游nt.- 35 3～ - 174之间的 179bp片段内含有某种抑制子元件 ,nt.- 112～ - 6 3之间的 49bp片段内含有某种增强子元件 ,nt.- 174～ - 112之间的 6 3bp片段中含有基因转录所必须的启动子序列。进一步定位这些顺式作用元件 ,并研究与之相互作用的反式作用因子 ,对阐明SRY基因的表达调控机制具有重要意义     

卡介苗增强人β-防御素-1基因在肺腺上皮细胞表达的分子调节机制

目的 研究人β-防御素-1(hBD-1)基因启动子结构及卡介苗胞壁蛋白增强其mRNA在肺腺上皮细胞(SPC-A-1)中表达的转录调控机制。方法 hBD-1基因5′-端上游序列被连接入无启动子的pEGFP-1质粒和pCAT basic质粒，构建了系列5′-端缺失的pEGFPhBD-1及pCAT hBD-1报告质粒．pEGFP hBD-1质粒转染细胞后用荧光倒置显徽镜观察绿色荧光表达强度。pCAThBD-1报告质粒和pSV-β-Galactosidase control质粒(内对照)共转染SPC—A-1细胞后，给予卡介苗胞壁蛋白活性组分刺激，用ELISA检测CAT和β-Gal浓度．结果 hBD-1基因上游-314段有较强的启动子活性，-69段则启动活性减弱IBCG刺激后，即使上游序列缩短至-69位点时，报告基因CAT相对表达量仍明显增高。该区域有-同源性极高的C／EBPβ(CCAAT／Enhancer—binding proteinp)结合元件．结论 hBD-1基因上游-314bp段具有较完整的启动子活性，其中含有C／EBPβ结合位点的-69／ 54bp序列介导卡介苗对hBD-1基因转录的增强作用。     

转化生长因子β1对胰腺星状细胞中结缔组织生长因子基因的调控作用

目的 探讨转化生长因子β1(TGF-β1)对大鼠结缔组织生长因子(CTGF)基因启动子活性的调控作用。方法 将大鼠CTGF基因启动子片段与荧光素酶报告基因组成重组体pcTGF-luc。采用脂质体转染方法将该质粒转至原代分离并培养的2～5代大鼠胰腺星状细胞(PSCs)中,24h后分别在不同时间和不同浓度的体外CTGF-β1刺激下用Dual-luciferase报告系统检测相应荧光素酶的活性。结果 TGF-β1表现为以剂量和时间依赖的方式上调PSCs中CTGF基因启动子活性,TGF-β1在短时间内即可使CTGF基因启动子活性明显增高,并达到高峰,且能有效地保持至36h左右。结论 在PSCs中,TGF-β1主要在转录水平调节CTGF表达,较小浓度和较短时间即可使CTGF启动子活性增强。     

核心结合因子α1对牙本质涎磷蛋白基因启动子不同片段启动活性的影响

目的:观察核心结合因子α1(cbfα1)对牙本质涎磷蛋白(DSPP)基因启动子不同片段启动活性的影响. 方法:选择小鼠成牙本质细胞样细胞MDPC-23为实验细胞,利用含DSPP基因启动子不同片段的真核表达载体,采用报告基因方法观察cbfα1对DSPP基因启动子不同片段启动活性的影响. 结果:在MDPC-23细胞中,pcDNA3-cbfα1共转染组相对于pcDNA3共转染组,Pgl3-Enhancer-1 (-4 496～-3 499 bp)、Pgl3-Enhancer-2 (-3 519～-2 515 bp)、Pgl3-Enhancer-2-3、Pgl3-Enhancer-95 (-95～54 bp) 活性增强(P<0.05);Pgl3-Enhancer-1-3、Pgl3-Enhancer-2.6 K (-2 475～53 bp) 活性降低(P<0.05). 结论:cbfα1可以调控DSPP基因的表达,cbfα1对DSPP基因启动子不同片段的启动活性有不同的调节作用.     

人TIPE2基因启动子的鉴定及其表达调控区域的研究

目的克隆人TIPE2基因启动子区及一系列5’截短片段,并鉴定其DNA表达调控区域。方法采用PCR技术从人基因组DNA中克隆扩增TIPE2基因5’上游1 252 bp启动子序列并对该片段5’端的截短,分别瞬时转染人卵巢癌来源细胞系SKOV3,通过双萤光素酶活性的检测鉴定其启动子活性及表达调控区域。结果克隆扩增的8个TIPE2基因启动子截短片段经测序证明无误;TIPE2-pGL4-F1重组质粒双萤光素酶活性检测显示其具有明显的启动子活性,约为pGL4-Basic的7.9倍;5’系列截短片段重组质粒的启动子活性检测显示,与1 252 bp片段相比,TIPE2上游-965～-593 bp、-501～-390 bp缺失,启动子活性分别升高6.38、7.82倍;-593～-501 bp的缺失,使-501～+79 bp片段相对于-593～+79 bp片段的启动子活性降低2.04倍。结论人TIPE2基因上游1 252 bp区域有明显的启动子活性,该片段内存在2个潜在的负性调控区和1个潜在的正性调控区。     

小鼠STING基因启动子的克隆鉴定及功能初步分析

目的:克隆小鼠干扰素基因刺激因子(STING)基因启动子,并对其启动子活性和转录调控机制进行初步探讨?方法:利用PCR方法扩增小鼠STING基因5′上游1 005 bp(-927~+77)的片段,亚克隆至pGL3-basic质粒,然后通过步移缺失构建不同缺失片段的重组质粒?双荧光素酶报告活性分析检测重组质粒在NIH3T3中的活性,并利用生物信息学方法预测转录因子结合位点?结果:经酶切?测序鉴定,成功构建了小鼠STING启动子荧光素酶报告基因重组质粒?与pGL3-basic质粒相比,STING启动子重组质粒的相对荧光素酶活性增加(P < 0.05)?通过生物信息学软件预测小鼠STING启动子区域(-177~-48)可能含有GATA?IK2?MZF1?SP1/SP3?STAT等转录因子结合位点?结论:成功构建小鼠STING不同缺失片段的启动子荧光素酶报告基因重组质粒?通过活性比较,推测小鼠STING的核心启动子区位于-177~+77区域,其中可能含有多个潜在的转录因子结合序列?     

三七总皂甙增强人内皮源性一氧化氮合酶基因启动子活性

目的探讨三七总皂甙(tPNS)对人内皮源性一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的调控机制。方法以基因重组技术构建人eNOS基因启动子区(-1~ -1 600 bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS-Luc,采用脂质体介导的细胞基因共转染技术将peNOS-Luc、空载体pGL2-Basic和β-半乳糖苷酶表达质粒pCMV-β共转染NIH3T3细胞,用细菌脂多糖(LPS)、tPNS和转移生长因子β1(TGFβ1)等因子分别刺激转染后的NIH3T3细胞,检测并比较荧光素酶/β-半乳糖苷酶活性,以确定LPS、tPNS和TGFβ1对人eNOS基因启动子转录活性的影响。结果(1)酶切和测序结果均证实重组载体peNOS-Luc构建正确;(2)重组载体peNOS-Luc在NIH3T3细胞中有效表达;(3)在LPS刺激下,人eNOS启动子的转录活性降低,而在tPNS和TGFβ1刺激下,其启动子的转录活性增强,其中,TGFβ1较tPNS所致的转录活性更强。结论正确构建了人eNOS基因启动子区(-1~-1 600 bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS-Luc;tPNS在NIH3T3细胞中增强人eNOS基因启动子的转录活性。     

EOLAl基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.     

洛伐他汀对大鼠系膜细胞增殖及TGF-β1基因启动子活性的调控

目的:观察洛伐他汀对大鼠系膜细胞增殖及对人TGF-β1基因启动子活性的作用.方法:(1) 应用MTT法观察洛伐他汀(10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)对大鼠系膜细胞增殖的作用;(2)将不同长度的人TGF-β1基因启动子片段与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因组成重组体phTGF2.14和phTGF1.12,采用脂质体法转染至大鼠系膜细胞中,分别加入不同浓度的洛伐他汀(10-7、10-5mol/L)进行干预,用ELISA方法检测报告基因CAT的活性.结果:(1)不同浓度洛伐他汀对大鼠系膜细胞增殖均有明显的抑制作用,与对照组比较有明显差异(P<0.01).(2)洛伐他汀浓度为10-7mol/L时对重组体phTGF2.14及phTGF1.12的表达活性无影响,当增大洛伐他汀浓度为10-5mol/L时对重组体phTGF2.14及phTGF1.12的表达活性有抑制作用,与对照组比较有显著差异(P<0.01).结论:洛伐他汀能够抑制系膜细胞增殖,当浓度为10-5mol/L时对人TGF-β1基因启动子活性也具有抑制作用.     

hTERT启动子的克隆及其在端粒酶阳性肺癌细胞中的靶向转录活性研究

目的克隆人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子序列片段，并探讨hTERT启动子在肿瘤细胞中的靶向转录活性。方法用PCR方法克隆293细胞DNA hTERT 5＇端上游旁侧序列长约1．1kb的启动子片段，经测序无误后将其克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic的荧光素酶基因上游，构建pGL3-hTERTp重组质粒，瞬时转染肺癌细胞A549、SPC-A-1、LTEPα-2、NCI-H446、YTMLC-9、GLC-82、95D、A2以及正常成纤维细胞MRC-5，检测荧光素酶活性。并用RT-PCR和TRAP-ELISA方法分析各细胞hTERT mRNA的表达及其端粒酶活性。结果琼脂糖电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1．1kb，DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致，位于hTERT基因转录起始位点上游1126bp（-1126～-40），片段长度为1084bp；采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL3-hTERTp重组质粒，均显示构建成功；hTERT mRNA和端粒酶活性在肺癌细胞中呈不同水平的表达，而正常细胞则均为阴性；瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示，hTERT启动子片段在所有检测的肺癌细胞中均有高低不同的转录活性，在正常细胞MRC-5无转录活性。结论克隆的1084bp大小的hTERT启动子片段在hTERT mRNA和端粒酶阳性的肺癌细胞中有特异性的转录活性，hTERT启动子可能作为靶向性基因治疗的调控元件。     

EOLA1基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.