内皮高表达脂多糖相关因子1抑制巨噬细胞炎症反应

目的 本实验旨在观察内皮高表达脂多糖相关因子1(endothelial overexpressed lipopolysaccharide-associated factor1,EOLA1)对巨噬细胞炎症反应的影响及可能机制。方法 培养小鼠巨噬细胞,脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激激活炎症信号通路,检测肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素6(IL-6)和EOLA1转录水平变化,采用化学阻断剂在不同位点阻断炎症反应信号通路,再检测TNF-α、IL-6和EOLA1转录变化。巨噬细胞过表达mEOLA1,RT-qPCR检测细胞M1、M2极化类型标志基因mRNA水平,以流式细胞术检测巨噬细胞表型改变,Western blot检测M1型巨噬细胞标记物iNOS表达。结果 LPS刺激后巨噬细胞释放炎症因子TNF-α、IL-6增加,而EOLA1表达下调;不同位点阻断炎症反应信号通路后炎症介质的表达明显受抑制,而EOLA1的表达上升;在巨噬细胞中高表达EOLA1,再行LPS刺激,检测到TNF-α、IL-6增加并不明显,流式细胞检测显示高表达EOLA1的巨噬细胞在LPS刺激后仍保持非...     

壳多糖组织工程皮肤治疗糖尿病足性溃疡

目的比较壳多糖组织工程皮肤、亲水性敷料（多爱肤）和传统纱布对糖尿病足性溃疡治疗疗效。方法将53例糖尿病足皮肤溃疡患者随机分为多爱肤组、壳多糖组及常规治疗组,以溃疡愈合率及平均愈合时间为观察指标。结果多爱肤组愈合率与常规治疗组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）;壳多糖组愈合率与多爱肤组相比,差异有统计学意义（P〈0.05）;常规治疗组与多爱肤组及壳多糖组比较,平均愈合时间差异有统计学意义（P〈0.05）,多爱肤组与壳多糖组比较,平均愈合时间无统计学差异（P〉0.05）。结论多爱肤组可提高溃疡愈合率,缩短平均愈合时间;壳多糖组织工程皮肤与多爱肤相比较能显著提高溃疡愈合率。     

人内皮活化相关新基因eola1的原核表达及鉴定

目的获得内皮高表达脂多糖相关因子1(eola1)表达蛋白并对其进行分析鉴定.方法采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法从人ECV-304细胞中扩增出eola1基因开放阅读框,构建重组质粒,测序鉴定后转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,裂解细菌抽提蛋白,目的蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western免疫印迹鉴定.结果测序鉴定eola1开放阅读框成功插入PET-46-EK/LIC质粒;重组质粒在大肠杆菌中成功表达人eola1蛋白,主要以包涵体形式存在,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其分子质量约20×103,Western blot验证出目的蛋白特异表达.结论应用原核表达系统能够成功获得目的蛋白,为下一步制备eola1单克隆抗体及基因功能研究打下基础.     

钒酸钠治疗增加实验性糖尿病大鼠骨骼肌GLUT4表达的研究

目的探讨钒酸钠类胰岛素作用及骨骼肌GLUT4(葡萄糖转运蛋白4)在其作用中机制.方法 Wistar大鼠40只,体质量180～250 g,随机分为2组,一组应用链脲佐菌素(55 mg/kg)腹腔内注射,5 d后血糖大于13.5 mmol/L定为糖尿病大鼠,另一组为正常对照鼠,然后将正常对照组与糖尿病组大鼠各随机分为2组.加钒组隔日管饲0.4%钒酸钠水稀释液,对照组饮用0.9%生理盐水,观察基本指标变化,持续2周后在麻醉情况下迅速分离提取骨骼肌及血液标本,应用Western blot 和RT-PCR技术测定GLUT4的蛋白和基因表达.结果钒酸钠治疗糖尿病大鼠PG、TG、INS降低,糖尿病大鼠GLUT4蛋白和GLUT4mRNA表达与正常对照组比较降低明显,钒酸钠治疗糖尿病大鼠GLUT4蛋白和GLUT4mRNA表达增加接近正常对照组水平.结论钒酸钠治疗糖尿病大鼠在不增加胰岛素释放的情况下具有明显改善糖脂代谢的效果,使降低GLUT4水平恢复接近正常,说明钒酸钠增加糖尿病大鼠骨骼肌GLUT4表达使周围组织葡萄糖摄取利用紊乱增加可能是降低血糖机制之一.     

沙格列汀对糖尿病小鼠动脉粥样硬化和脂肪性肝炎的影响

目的：探讨二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4,DPP4）抑制剂沙格列汀对2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）小鼠合并动脉粥样硬化和脂肪性肝病的影响及其机制。方法：ApoE-/-小鼠高脂喂养、高脂喂养+小剂量链脲佐菌素分别构建非糖尿病、T2DM合并动脉粥样硬化和脂肪性肝病小鼠模型,分为非糖尿病治疗组（HS,n=8）、对照组（HF,n=8）,糖尿病治疗组（DS,n=8）、对照组（DM,n=8）。HS、DS组予以沙格列汀15 mg/（kg·d）灌胃治疗,对照组等量生理盐水灌胃,12周后观察主动脉斑块、肝脏脂肪沉积、炎症浸润、纤维化程度以及炎症小体NLRP3活化和炎症介质IL-1β表达变化。结果：DS组较DM组血浆血糖、游离脂肪酸、甘油三酯和ALT、AST水平明显降低（P＜0.01）,肝重比明显减小（P＜0.01）,肝脏脂肪沉积、巨噬细胞浸润及纤维化程度显著减轻（P＜0.01）,肝组织内NLRP3炎症小体及IL-1β表达明显减少（P＜0.01）,HS组较HF组上述部分指标也出现明显降低,但HS、DS组较对照组动脉粥样硬化斑块均无明显变化。结论：沙格列汀通过降低血浆血糖和FFA水平,抑制肝脏巨噬细胞聚集、减少NLRP3炎症小体活化等作用抑制糖尿病性脂肪肝的发生和发展,但对动脉粥样硬化没有治疗作用。     

钒酸钠对STZ-糖尿病大鼠心肌细胞膜GLUT4易位的影响

目的探讨钒酸钠类胰岛素作用及对实验性糖尿病大鼠心肌组织葡萄糖转运蛋白4 (glucose transpoter type 4, GLUT4)与胰岛素刺激GLUT4易位的影响.方法 40只Wistar大鼠随机分为2组,1组应用链脲佐菌素(55 mg/kg)腹腔内注射,5 d后血糖大于13.5 mmol/L定为实验性糖尿病大鼠(STZ-D大鼠),然后将STZ-D大鼠组及正常组再分为2组,加钒组隔日管饲0.4% 钒酸钠稀释液,持续4周后在麻醉情况下每组各一半大鼠在尾静脉注射5U /kg诺和正规胰岛素治疗,5 min后心脏抽取血液标本并提取心脏,应用Western blot 技术测定GLUT4蛋白表达.结果钒酸钠治疗使STZ-D大鼠血糖、甘油三酯、胰岛素降低,STZ-D大鼠心肌细胞膜GLUT4蛋白含量与正常对照组比较明显降低(53%),而钒酸钠与胰岛素合用治疗STZ-D大鼠可使心肌细胞膜GLUT4增加2.7倍.结论钒酸钠治疗STZ-糖尿病大鼠在不增加胰岛素释放的情况下具有明显改善糖脂代谢的效果,糖尿病大鼠心肌细胞膜GLUT4含量减少可能是引起心肌葡萄糖转运障碍及心功能下降的因素,钒酸钠治疗使胰岛素调节GLUT4转运易位增加致心肌组织对葡萄糖摄取利用加强可能是某些降低血糖的机制以及改善心功能原因.     

抑制ECV304细胞内EOLA1基因表达后效应观察

目的观察抑制人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞内内皮高表达脂多糖相关因子1（endothe-lial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1）基因表达后细胞生长的变化。方法构建EGFP-EOLA1融合蛋白表达载体pEGFP-N2/EOLA1,转染ECV304细胞,G418压力筛选获得稳定表达株;设计靶点特异性的寡核苷酸,连接到经BamHⅠ和HindⅢ酶切线性化的pSlincer3.1/H1质粒上。转染重组质粒到稳定表达EGFP-EOLA1融合蛋白的ECV304细胞,检测靶基因的抑制情况,观察EOLA1表达被抑制后细胞生长的改变。结果抑制EOLA1表达后ECV304细胞生长明显减慢。结论EOLA1基因在细胞内参与了细胞生长的调控。     

EOLA1基因小干扰RNA载体构建及其干扰效应检测

目的 构建人类新基因内皮高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)特异性的小干扰RNA表达载体，并初步验证其对靶基因的抑制作用。方法 构建绿色荧光蛋白(GFP)-EOLA1融合蛋白表达载体pEGFP-N2／EOLA1，并转染人ECV304细胞株，G418压力筛选获得稳定表达株；针对靶基因EOLA1，设计靶点特异性的寡核苷酸，插入pSlincer3．1／H1质粒。转染重组质粒到稳定表达GFP-EOLA1融合蛋白的ECV304细胞，通过观察转染细胞绿色荧光的强弱和Westem blot实验检测靶基因的抑制情况。结果 获得了稳定表达GFP-EOLA1融合蛋白的细胞株，构建的小RNA干扰质粒siEOLA1能够抑制靶基因EOLA1的表达。结论 成功构建了针对EOLA1基因的siRNA质粒，为进一步研究该基因的功能奠定了基础。