EOLA1基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.     

EOLAl基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.     

人类β—珠蛋白基因5’—1559bp上游转录调控区的重组及表达

目的 探寻人类β－珠蛋白基因5′－帽位上游新转录调控元件。方法：利用重组DNA技术,构建及克隆3人含有人类β－基因不同5‘－帽位上游片段的荧光素酶报告基因重组载体（pGL2-promoter/SB-β^RHB734、pGL2-promoter/SB-β^R AB573、pGL2-promoter/SB-β^RHfB263）,分别将其导入Hela细胞中,采用β-半乳糖苷酶报告β-半乳糖苷酶报告基因为转移效率内对照,空白的荧光素酶基因载体为基础对照,进行荧光素酶活性比较。结果 3个基因片段载体构建符合设计,其相对抑制活性分别为59．74％、80．97％、79．42％。结论 初步提示人类β－基因5‘帽位上游－2132～－1822bp片段及－1822～15559bp片段内可能存在起负调控作用的顺式作用元件（抑制子）,而－2277bp～-2132bp片段间未检出报制子或增强子活性存在。 此初步结果尚需进一步研究证实和阐明其结构与功能的关系。     

转化生长因子β1启动子质粒重组体的构建及活性研究

目的:探讨调控TGFβ1基因高水平转录的启动片段.方法:以人基因组DNA为模板,PCR扩增获得TGF-β1基因转录起始位点上游5'端-1328～ 812 bp的片段中不同长度的片段,以此作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的质粒pCAT3-enhancer重组成5个重组体,并将其转染至大鼠肝里状细胞株中,测定细胞的CAT的表达水平并比较各重组体的启动子活性.结果:-308～ 812 bp序列具有较强的启动活性,-611～ 812 bp次之,其他几个重组体的启动活性从高到低的排序依次为1328～ 812 bp、-867～ 812 bp、 227～ 812 bp.结论:TGF-β1基因启动子片段中,-308～ 812 bp、-611～ 812 bp、1328～ 812 bp重组体具有较强的启动活性,是进一步研究人TGF-β1基因转录调控的重要靶序列.     

EOLA1基因5'侧翼区的克隆及调控功能初步研究

目的研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(endothelial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1)基因5'侧翼区的调控序列.方法通过基因组步移克隆EOLA1基因5'侧翼区不同长度的片段,插入β-半乳糖苷酶(β-gal)报告基因载体,分析各片段在ECV304细胞中的β-gal调节活性.结果含EOLA1基因5'侧翼区-1～-2 659 bp和-1～-1 951 bp序列的重组质粒在ECV304细胞中能明显表现β-gal上调活性,而-1～-361 bp序列的重组质粒活性无明显变化.结论 EOLA1基因5'侧翼区-361～-1 951 bp内存在基因转录启动子元件.     

EOLA1基因5′侧翼区的克隆及调控功能初步研究

目的研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(endothelial overexpressedlipopolysaccharide associatedfactor1,EOLA1)基因5′侧翼区的调控序列。方法通过基因组步移克隆EOLA1基因5′侧翼区不同长度的片段,插入β半乳糖苷酶(βgal)报告基因载体,分析各片段在ECV304细胞中的βgal调节活性。结果含EOLA1基因5′侧翼区-1～-2659bp和-1～-1951bp序列的重组质粒在ECV304细胞中能明显表现βgal上调活性,而-1～-361bp序列的重组质粒活性无明显变化。结论EOLA1基因5′侧翼区-361～-1951bp内存在基因转录启动子元件。     

老年性痴呆相关基因nicastrin启动子区单核苷酸多态性分析

【目的】分析老年性痴呆(Alzheimer病)相关基因nicastrin启动子区单核苷酸多态性(SNP),探讨其基因表达可能的分子调控机制。【方法】扩增nicastrin基因ATG上游约1.0kp启动子区DNA片段,与萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic进行重组质粒的克隆与鉴定,确立启动子区候选功能SNP及其相应位点结合的转录调节因子。应用Lipofectamine 2000对包含功能SNP的重组质粒进行CRL-2137细胞瞬时转染,双荧光素酶相对活性分析及电泳迁移率变动分析。【结果】Nicastrin基因启动子区960 bp DNA片段内存在功能SNP_rs10752637-922 G→T,与其相应位点结合的转录因子为hepatic leukemia factor(HLF),SNP_rs10752637-922 T的序列结构对启动萤火虫荧光素酶报告基因的表达功能较SNP_rs10752637 -922 G的序列结构强(P<0.05,n=3)。【结论】Nicastrin基因核心启动子应该在960 bp DNA片段内,SNP_rs10752637-922 G→T可能是启动子区有功能位点突变,包含rs10752637-922 G/T的核苷酸序列结构可能通过与HLF在内的转录调节因子的作用来实现对nicastrin基因表达差异的调控。     

老年性痴呆相关基因nicastrin启动子区单核苷酸多态性分析

【目的】分析老年性痴呆（Alzheimer病）相关基因nicastrin启动子区单核苷酸多态性（SNP）,探讨其基因表达可能的分子调控机制。【方法】扩增nicastrin基因ATG上游约1.0kp启动子区DNA片段,与萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic进行重组质粒的克隆与鉴定,确立启动子区候选功能SNP及其相应位点结合的转录调节因子。应用Lipofectamine 2000对包含功能SNP的重组质粒进行CRL-2137细胞瞬时转染,双荧光素酶相对活性分析及电泳迁移率变动分析。【结果】Nicastrin基因启动子区960 bp DNA片段内存在功能SNP_rs10752637-922 G→T,与其相应位点结合的转录因子为hepatic leukemia factor（HLF）,SNP_rs10752637-922 T的序列结构对启动萤火虫荧光素酶报告基因的表达功能较SNP_rs10752637 -922 G的序列结构强（P〈0.05,n=3）。【结论】Nicastrin基因核心启动子应该在960 bp DNA片段内,SNP_rs10752637-922 G→T可能是启动子区有功能位点突变,包含rs10752637-922 G/T的核苷酸序列结构可能通过与HLF在内的转录调节因子的作用来实现对nicastrin基因表达差异的调控。     

人类β—珠蛋白基因5‘—1559bp上游转录调控区的重组及表达

目的：探讨人类β－珠蛋白基因5‘－帽位上游新转录调控元件;方法：利用重组DNA技术,构建及克隆3个含有人类β－基因不同5‘帽位上游片段的荧光素酶报告基因重组载体（pGL2-promoter/SB-β^RHB734,pGL2-promoter/SB-β^RAB573,pGI2-promoter/SB-β^RHfB263),分别将其导入Hela细胞中,采用β－半乳糖苷酶报告基因为转移效率内对照,空白的荧光素酶基因载体为基础对照,进行荧光素酶活性比较。结果：3个基因片段载体构建符合设计,其相对抑制活性分别为59．74％、80．97％、79．42％;结论：初步提示人类β－基因5‘帽位上游－2132－－1822bp片段及－1822－15559bp片段内可能存在有起负调控作用的顺式作用元件（抑制子）,而－2277bp--2132bp片段间未检出抑制子或增强子活性存在,在初步结果尚需进一步研究证实和阐明其结构与功能的关系。     

人MUC5AC基因启动子荧光素酶报告 基因载体的构建及其转录活性分析

目的：克隆人黏蛋白/黏液素5AC(MUC5AC)基因启动子并构建该启动子的荧光素酶报告系统,探讨该启动子的活性及转录靶向性。方法：运用Vector NT1软件包对MUC5AC基因5′端1 348 bp进行启动子特征分析;以人A549细胞基因组DNA为模板分离出人MUC5AC基因5′端非翻译区大小为1 348 bp的片段并进行测序鉴定,再以扩增产物为模板对启动子进行5′端删除分析,分别扩增737 bp(-689/+48),372 bp(-324/+48),112 bp(-64/+48)的片段,与荧光素酶报告基因载体重组构建,通过双荧光素酶活性进行转录活性分析。应用定点突变技术,在重组质粒的基础上建立MUC5AC启动子区SP-l结合位点和核因子（NF）-κB结合位点单独突变体,并测定中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)诱导的转染细胞荧光素酶的相对活性。结果：序列分析发现人MUC5AC基因5′端1 348 bp的区域内存在多个顺式作用元件,成功构建了4个不同长度的MUC5AC启动子报告基因载体。双荧光素酶活性分析372 bp片段为有活性的最小片段。NE可诱导含有MUC5AC启动子区NF-кB结合位点单独突变体（pGL3E-MUC5AC-NF-кB-MU）荧光素酶相对光强度增加,而NE不能诱导SP-l结合位点单独突变体（pGL3E-MUC5AC-SP-1-MU）荧光素酶表达增加。结论：上述载体的成功构建及序列分析为进一步研究MUC5AC基因的启动子活性及基因表达调控奠定了基础。MUC5AC 5′上游序列中-324/-64位点存在参与NE诱导MUC5AC基因表达的重要调控元件,位于此区域的顺式作用元件SP-1位点在NE诱导MUC5AC基因表达机制中起重要作用。     

SRY基因启动子不同模块的克隆及功能分析

采用报告基因分析的方法，构建ＳＲＹ基因５’旁侧具有启动效应的５４４ｂｐ以内不同长度片段与荧光素酶报告基因载体ＰＧＬ２－Ｅｎｈａｎｃｅｒ的重组子，并通过脂质体转染技术导入Ｈｅｌａ细胞，检测各重组子报告基因的瞬间表达，由此分析启动子不同模块对基因转录效率的影响。     

POMC基因5‘上游近端片段的转录调控作用初探

目的　建立阿片黑皮质素原 (POMC)基因 5′上游近端转录调控体系并初步探讨其作用特点。方法　采用 DNA重组技术构建一系列受大鼠 POMC基因 5′上游近端不同长度片段介导的荧光素酶报告基因质粒 ,以lipofectam ine 包裹质粒转染垂体 ACTH瘤细胞系 (At T2 0 ) ,然后测定荧光素酶活性。结果　成功地构建了含POMC基因 - 34 / 6 3bp、- 16 5 / 6 3bp、- 32 3/ 6 3bp和 - 480 / 6 3bp片段的 4种报告基因质粒 ,其荧光素酶相对表达活性分别为 1、2 .1± 0 .3、3.3± 0 .3和 3.7± 0 .5 ,阳性对照为 4.8± 0 .8。结论　 POMC基因的核心启动子比较弱 ,提示 POMC基因可能存在多个转录起始位点 :At T2 0细胞中 POMC基因持续表达的近端组织特异性调控元件主要集中于 - 34 / - 16 5 bp范围内。上述结果为进一步研究各种调节因子对该基因的表达调控打下基础     

人HAS3基因核心启动子区域的初步鉴定与分析

目的对人HAS3基因的核心启动子区域进行初步鉴定和分析,为深入研究HAS3基因的转录调控奠定基础。方法以前期构建的人HAS3基因启动子荧光素酶报告基因重组体P(-761/-305)为模板,采用PCR介导的基因定点突变技术构建4个不同的系列删除体,并对HAS3启动子区域中的Sp1结合位点和核心启动子元件进行定点突变,构建相应的定点突变重组体;采用荧光素酶双报告基因分析技术检测各重组体的启动子活性。结果构建了P(-761/-569)、P(-563/-305)、P(-490/-305)和P(-433/-305)4个系列删除体和5个定点突变体;启动子活性分析结果表明,P(-761/-569)无启动子活性,P(-563/-305)、P(-490/-305)和P(-433/-305)均具有较强的启动子活性,Sp1结合位点和核心启动子元件的定点突变可导致HAS3启动子活性的降低。结论 HAS3基因的核心启动子区域主要位于其转录起始位点上游附近-433～-305 bp内,Sp1可能在HAS3的转录调控中起重要作用。     

Noxl基因启动子表达载体的构建

目的克隆烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（Nox）上游启动子序列,为研究Noxl基因的转录调控奠定基础。方法以人基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得1415bp（-1415-0）、1276bp（-1415～-140）、997bp（-1415～-419）、839bp（-1415～-577）、470bp（-1415～-946）大小的Noxl启动子片段,将其定向克隆入pGL3-Basic荧光素酶表达载体,构建荧光素酶报告基因载体,进行真核细胞转染后鉴定目的片段启动子活性。结果在A549细胞中,各Noxl启动子片段均有活性;-140～-419bp和-577～-946bp区域可能存在Noxl启动子核心区域。结论成功克隆了在肺泡上皮样细胞中具有活性的Noxl启动子序列,为进一步研究Noxl基因的转录调控机制奠定了基础。     

性发育异常患者SRY基因分析

应用ＳＲＹ基因编码区１对特异寡核苷酸引物进行基因组ＤＮＡ扩增,结合单链构象多态性分析,银染显色,探讨性别决定基因（ｓｅｘ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｏｎ Ｙ, ＳＲＹ）对性发育异常患者临床诊断的意义。结果：５例患者中,２例４６,ＸＸ男性显示与男性相同的特异扩增带;３例４６,ＸＹ女性中２例无男性特异扩增带,１例显示ＳＲＹ基因片段扩增,经单链构象多态性分析,显示与正常男性扩增片段相同的单链泳动带型。支持ＳＲＹ基因是男性性别决定的关键基因的假说,提示ＳＲＹ基因的调节基因等可能参与协同作用。     

人EFTUD2启动子的鉴定及初步分析

目的：鉴定并分析EFTUD2（elongation factor Tu GTP?binding domain?containing 2）基因的启动子区域。方法：应用生物信息学技术对EFTUD2基因结构及潜在启动子区域进行分析,预测4个EFTUD2启动子序列。使用全基因合成技术以及高保真PCR扩增得到目的启动子序列,通过BglⅡ和NheⅠ双酶切,将目的条带克隆到双荧光素酶报告基因载体psiCHECK?2中,得到4个长度不同并覆盖EFTUD2基因转录起始位点附近约2 kb的EFTUD2基因启动子双荧光素酶报告基因重组体。荧光素酶分析检测启动子活性。结果：经酶切、测序鉴定,成功构建了人EFTUD2启动子荧光素酶报告基因重组质粒。通过荧光素酶活性检测,重组体EFTUD2?0.5的相对荧光素酶活性增加（P < 0.05）,提示EFTUD2基因核心启动子序列位于转录起始位点附近约500 bp的区域内。结论：EFTUD2基因转录起始位点上游500 bp具有启动子活性,初步判定其核心启动子位于该区域。     

阿尔兹海默病相关基因nicastrin启动子的克隆和鉴定

目的：克隆和鉴定与阿尔兹海默病发生有关的γ-分泌酶的组成蛋白之一nicastrin（NCT）基因的启动子。用于开展其转录调控机制的研究。方法：用PCR方法从人基因组DNA中分离NCT基因编码区上游大小约为1.8kb的片段并以此为基础对启动子进行两端删除分析，分别扩增大小不等的片段，与pGL3-Enhancer荧光素酶报告基因载体质量组，通过瞬时转染Hela细胞，细胞裂解液进行双荧光素酶活性分析，分离NCT基因的启动子区。结果：NCT基因启动子的420bp片段在Hela细胞中具有最强的启动活性，另237bp片段为有活性的最小片段。结论：NCT启动子很可能位于翻译起始位点上游-432／-133处，其基础启动子位于-359／-90。     

人参皂苷Rb1对NEP基因启动子活性的影响

目的 构建NEP启动子缺失体-荧光素酶报告基因质粒,探查神经内肽酶(NEP)基因启动子中与人参皂苷Rb1影响NEP启动子活性有关的位点。方法 用NEP基因5′上游启动区2.4kb片段和荧光素酶报告基因载体pGL3-basic构建NEP启动子-荧光素酶报告基因质粒pGL3-nep2.4;用Erase-a-Base System对pGL3-nep2.4质粒2.4kb DNA插入片段5′端进行缺失,构建NEP启动子缺失体-荧光素酶报告基因质粒;用Rb1处理NEP启动子缺失体转染的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,检测双荧光素酶活性,观察Rb1对NEP启动子活性的影响。结果 成功构建了含NEP启动子DNA序列的重组质粒pGL3-nep2.4。荧光素酶活性检测显示,转染pGL3-nep2.4质粒的SH-SY5Y细胞荧光素酶活性是转染pGL3-basic的13.1倍(P<0.01)。Rb1处理可使转染pGL3-nep2.4质粒的SH-SY5Y细胞荧光素酶活性增加,其是对照组的2.9倍(P<0.01);细胞荧光素酶活性检测亦显示,NEP基因上游启动区-894~-857bp(Region Ⅰ)及-100~-82bp(Region Ⅳ)片段缺失后,启动子活性分别是缺失前的29%(P<0.01)和25%(P<0.01),-559~-534bp(Region Ⅱ)及-223~-179bp(Region Ⅲ)片段缺失后,启动子活性分别是缺失前的5.12倍(P<0.01)及1.81倍(P<0.01)。Rb1处理后,RegionⅠ、Ⅱ和Ⅲ缺失体质粒转染细胞荧光素酶活性均与对照组无统计学差异(P>0.05),Region Ⅳ缺失质粒pGL3-226转染细胞荧光素酶活性也与对照组无明显差异(P>0.05),而含Region Ⅳ质粒pGL3-244转染细胞荧光素酶活性则是对照组的1.61倍(P<0.01)。结论 NEP基因5′上游2.4kb DNA片段有较强的启动子活性,Rb1能明显增加其活性。NEP基因2.4kb DNA片段有2个正调控区(RegionⅠ和Region Ⅳ)和2个负调控区(RegionⅡ和Region Ⅲ),Rb1通过Region Ⅳ发挥正调控作用。