丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活SV40病毒早期启动子／增强子的研究

目的：探讨丙型肝炎病毒核心蛋白的反式激活作用。方法：以重组质粒pcDNA3-core（含有HCV核心蛋白编码基因）转染HepG2细胞,从转录和翻译水平鉴定核心蛋白的瞬时表达;与报告质粒pSV-lacZ共转染HepG2细胞,检测β－半乳糖苷酶表达活性,酶的活性反映了表达的核心蛋白对SV40病毒早期启动子／增强子功能的影响。结果：质粒pcDNA3-core在HepG2 细胞瞬时表达核心蛋白,共转染实验中pcDNA3-core组β－半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的5．4倍。结论：HepG2细胞中表达的核心蛋白具有反式激活SV40早期启动子／增强子的特性,为进一步以差异显示逆转聚合酶链反应技术克隆相关基因提供实验基础。     

HCV非结构蛋白3反式激活基因6转染肝癌细胞的基因表达谱芯片分析

目的:为了研究NS3TP6可能的分子生物学功能,我们应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3 (NS3)反式激活基因NS3TP6的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响. 方法:以分子生物学技术构建NS3TP6的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS3TP6,以表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3TP6转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA. 应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析. 结果:HepG2细胞经转染NS3TP6后,有7条基因表达增强,38条基因表达降低. 结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了NS3TP6的反式调节基因,为进一步阐明NS3TP6的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.     

稳定表达丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶的HepG2细胞克隆的建立

目的：构建丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶（scNS4A／NS3）的真核表达载体；建立重组质粒稳定转染的HepG2细胞克隆．方法：根据文献报道设计扩增scNS4A／NS3编码基因的引物，从HCV阳性患者血清中提取病毒RNA，RT-PCR方法扩增出scNS4A／NS3基因片段，BamH Ⅰ／HindⅢ双酶切后连接到经同样酶切的真核表达载体pcDNA3，1（-），转化菌株JM109感受态细胞，获得重组质粒pcDNA3．1（-）～scNS4A／NS3，经酶切鉴定及序列测定．将阳性重组质粒用脂质体法转染HepG2细胞，经持续G418压力选择和克隆化获得稳定转染的细胞系，用RT-PCR，IFA，Western-blot证实该稳定细胞系可以表达单链丝氨酸蛋白．结果：成功构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-scNS4A／NS3；建立了稳定转染的HepG2细胞克隆，命名为scpHepG2．结论：获得稳定的scpHepG2细胞克隆可表达单链丝氨酸蛋白，为下一步建立以细胞为基础的评价抗HCV丝氨酸蛋白酶药物系统奠定基础．     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5B反式激活基因的克隆化研究

目的：应用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5B（HCV NS5B）转染细胞差异表达cDNA消减文库，克隆HCV NS5B蛋白反式激活相关基因。方法：以HCV NS5B表达质粒pcDNA3.1（-）-NS5B转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1（-）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，进行抑制性消减杂交（SSH）分析。随机挑取克隆进行测序及同源性分析。结果：文库扩增后得到35个阳性克隆，经菌落PCR分析显示其中26个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段。测序及同源性分析，显示16种已知基因编码蛋白和1种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5B反式激活靶基因。结论：成功构建了HCV NS5B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，为进一步阐明HCV NS5B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据。     

丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建及其在HL-7702细胞中的高效表达

目的：构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5A基因的真核表达载体，并在正常人肝细胞株(HL-7702细胞)中进行表达，为今后研究HCV NS5A蛋白功能奠定基础。方法：从含HCV NS345序列的重组质粒pCDNA3.1（+）/ NS345中扩增出HCV NS5A基因片段，构建pCI-neo/ NS5A重组表达质粒。用脂质体将其转染HL-7702细胞，通过Western blotting印迹法鉴定NS5A蛋白。结果：用PCR方法扩增的HCV NS5A基因全长1 344 bp,与PGEM-T重组，测序证实所克隆的NS5A基因片段大小正确；成功地构建pCI-neo/ NS5A重组表达质粒，瞬时转染HL-7702细胞表达NS5A蛋白，Western blotting印迹法显示其相对分子质量约为56 000。结论：HCV NS5A的真核表达载体pCI-neo/ NS5A在HL-7702细胞中能有效表达NS5A蛋白，NS5A蛋白可导致病毒复制、肝细胞癌发生，且NS5A区为IFN敏感性决定区。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白4A反式激活基因NS4ATP1的克隆化研究

目的：筛选并克隆丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白4A（NS4A）反式激活新型靶基因。方法：以HCVNS4A蛋白表达质粒pcDNA3．1（-）-NS4A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。分析筛选得到的克隆，其中之一与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性，通过序列同源性比对和电子拼接，根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列，确定新型基因序列。从转染peDNA3．1（-）-NS4A的HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术扩增获得该新基因的全长序列，并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果：该新基因的编码序列全长为963个核苷酸（nt），编码产物由321个氨基酸残基（aa）组成，并测序证实，命名为NS4ATP1，在GenBank中注册，注册号为AY740521。结论：分子生物学技术与生物信息学技术相结合，发现并鉴定、克隆了HCV非结构蛋白反式激活作用的新型靶基因NS4ATP1，为进一步研究HCV非结构蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP1的反式调节基因筛选

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP1反式激活的相关基因,从分子生物学的角度研究HCV致病机制。方法:以NS5ATP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照组,从中分别提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR)扩增,将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及生物信息学分析。结果:成功构建NS5ATP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后将阳性克隆经菌落PCR分析,得到90个200～1000bp的插入片断。挑选含插入片段的30个克隆进行测序,通过生物信息学分析得到3种已知序列的基因(Ras癌基因家族成员RAN、DNA依赖的RNA聚合酶Ⅱ多肽C、核糖体蛋白L2)和1个未知功能的序列(推测为新基因)。结论:筛选得到的cDNA基因全长序列包括一些与...     

丙型肝炎病毒F蛋白对p21基因的调节作用

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白对细胞p21基因转录、表达的影响。方法PCR扩增HCV 1b来源的F基因,克隆至pcDNA3.1真核表达载体。F基因质粒转染HepG2细胞,48h后抽提细胞总RNA和总蛋白,实时定量PCR及Western blot检测p21基因表达变化。结果HCV F蛋白在HepG2细胞内瞬时表达,相对于空载体对照(目标基因表达量为1),HCV F基因质粒转染细胞的p21转录水平为3.2,蛋白表达水平为1.4。结论HCVF蛋白增加p21转录和表达,其生物学效应值得进一步研究。     

B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白对MDR1基因反式激活能力的比较

目的 研究B、C基因型乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白对多药耐药基因1(MDR1)反式激活能力的差别.方法 PCR扩增B、C基因型HBV X基因并克隆于pcDNA3.1/HisC载体(重组载体分别为pcDNA3.1/HisC-XB及pcDNA3.1/HisC-XC).以FuGENE6将重组表达载体转染HepG2细胞,采用融合表达的X-press多肽表位抗体,通过Western blot检测目的 蛋白在不同时间段的表达.PCR扩增MDR1基因启动子并克隆于萤火虫荧光素酶报告载体pGL3-Basic(重组载体为pGL-MDR).pGL-MDR分别与pcDNA3.1/His-GXB或pcDNA3.1/HisC-XC共转染HepG2细胞,转染后48 h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性.实验数据以SPSS 11.5软件分析.结果 成功克隆X蛋白表达载体及MDR1报告载体.Western blot显示pcDNA3.1/HisC-XB或pcDNA3.1/HisC-XC在HepG2细胞中均能表达HBV X蛋白,以转染后48 h为最高.当pGL-MDR报告质粒与X基因重组载体或空载体质量比在1∶2～1∶4范围内,萤火虫荧光素酶在各转染细胞内的活性依次为pcDNA3.1/HisC-XB pGL-MDR组＞pcDNA3.1/HisC-XC pGL-MDR组＞pcDNA3.1/HisC pGL-MDR组(对照组),且存在剂量-效应关系.结论 B、C基因型HBV X蛋白对多药耐药基因均有反式激活能力,且B基因型强于C基因型.     

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6的反式调节基因研究

目的：筛选、克隆新基因HCBP6转染肝癌细胞后的反式调节基因，探索HCBP6基因表达对肝细胞基因表达谱的影响。方法：应用酵母双杂交技术和生物信息学(bioinfonnatics)技术，筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)的基因。构建HCBP6基因的真核表达载体pcDNA3．1(-)-HCBP6，应用抑制性消减杂交技术对重组表达质粒pcDNA3．1(-)-HCBP6转染的HepG2细胞和空载体转染的相同细胞差异表达的mRNA进行研究，将富集的二次PCR产物与T／A载体连接，并转化大肠杆菌进行文库扩增，随机挑取克隆聚合酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析。结果：消减文库扩增后得到30个阳性克隆，菌落PCR分析显示，其中24个克隆含有200—1000bp插入片段。对插入片段测序，并通过生物信息学分析，结果共获得11种蛋白编码基因。结论：应用SSH技术成功筛选了HCBP6对肝癌细胞的反式调节基因，本实验结果对初步探索新基因的功能提供重要的信息，为进一步阐明HCV核心蛋白与HCBP6相互作用后的肝细胞生物大分子变化提供了理论依据。     

丙型肝炎病毒核心区蛋白在HepG2细胞中的表达

目的 :构建能稳定表达丙型肝炎病毒核心区蛋白的哺乳动物细胞系 ,以便对丙型肝炎病毒核心区蛋白的抗原性及其他功能作进一步研究。方法 :通过PCR扩增丙型肝炎病毒核心基因 ,将其亚克隆入真核表达质粒pcDNA3.1( )中 ,用脂质体包裹后转染肝癌细胞系HepG2 ,通过G4 18筛选获得稳定转染细胞系 ,并通过间接免疫荧光法检测HepG2中丙型肝炎病毒核心区蛋白的表达。结果 :克隆的基因全长 5 94bp ,并经测序和重组质粒双酶切证实为所需目的基因 ;经间接免疫荧光验证实转染了目的基因的HepG2细胞中有丙型肝炎核心区蛋白的表达。结论 :丙型肝炎病毒核心区蛋白能在HepG2细胞中稳定表达。     

乙型肝炎病毒前S2蛋白下调胰岛素受体启动子的研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)前S2蛋白对胰岛素受体(INSR)启动子转录的下调作用.方法 HBV前S2蛋白真核表达质粒pcDNA3.1(-)-preS2及INSR启动子真核报告质粒pCAT3-INSRp使用常规分子生物学方法进行构建,并经酶切、测序证实.接下来,将构建好的pcDNA3.1(-)-preS2质粒以1.0、1.5、2.0μg转染HepG_2细胞,提取总RNA后进行相对实时荧光定量PCR检测以明确前S2蛋白mRNA的表达量.然后,分别将pCAT3-INSRp质粒以0.2μg递增量(0～2.0μg)转染HepG_2、Huh7细胞系,CAT-ELISA法检测转染细胞的氯霉素乙酰转移酶(CAT)表达量以制作pCAT3-INSRp的量-效曲线.最后,根据量一效曲线选择合适的pCAT3-INSRp转染剂量(1.0μg)与不同剂量的pcDNA3.1(-)-preS2(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μg)共转染HepG_2及Huh7细胞,同时使用抗前S2蛋白单克隆抗体以阻断前S2蛋白的作用,使用CAT-ELISA方法检测转染细胞的CAT表达量,以观察前S2蛋白对于INSR启动子的调节作用.结果 转染了pcDNA3.1(-)-preS2的细胞可以正确表达HBV前S2蛋白的mRNA.pCAT3-INSRp质粒转染细胞后CAT的表达随着转染剂量的增加而增加,量-效曲线为S形.转染不同剂量pcDNA3.1(-)-preS2后,HepG_2细胞内CAT基因的表达水平分别为对照的69.8%、60.1%、19.7%、10.3%、5.6%(转染后36 h)和68.6%、56.0%、10.3%、8.6%、3.2%(转染后72 h).同时,在转染2.0μg pcDNA3.1(-)-preS2的细胞培养上清中加入前S2单抗后,其CAT的表达量恢复为对照的55.4%(36 h)和69.7%(72 h).Huh7细胞的结果同HepG_2细胞结果相似.结论 克隆的INSR启动子有顺式激活下游基因的活性;HBV的前S2蛋白对INSR启动子转录具有下调作用,可以在分子水平解释肝源性糖尿病发病机制的一部分.     

丙型肝炎病毒NS3基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS3的真核表达载体,并分析其在HeLa细胞中的表达。方法:以HCV全长cDNA质粒为模板进行PCR扩增,获得全长NS3基因,将其插入克隆载体pMD18-T中,鉴定后与真核表达载体pcDNA3.1(+)重组,用脂质体介导法转染HeLa细胞,间接免疫荧光法及Western blot鉴定转染后HCVNS3蛋白的表达。结果:PCR扩增的NS3序列正确,构建的真核表达载体成功转染HeLa细胞,表达的NS3蛋白相对分子量为70kD。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/NS3,并在HeLa细胞中获得表达。     

持续表达的丙型肝炎病毒NS4B激活HepG2细胞内质网应激反应的研究

目的研究持续表达的丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)对HepG2细胞内质网应激反应的影响。方法 NS4B重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)NS4B通过脂质体转染HepG2细胞,G418筛选、基因组PCR和Western blot鉴定稳定转染细胞;RT-PCR检测稳定转染细胞内人X盒结合蛋白1(XBP1)mRNA剪接,荧光素酶试验检测稳定转染细胞内GRP78启动子、XBP1启动子和核因子κB(NF-κB)活性。结果基因组PCR和Western blot鉴定证实NS4B基因整合到转染HepG2细胞的染色体上,并有效表达;在NS4B稳定转染的HepG2细胞中,检测到XBP1mRNA剪接、XBP1和Grp78启动子激活、Ca2+稳态变化及NF-κB激活。结论 NS4B在HepG2的稳定表达诱导了内质网应激反应,揭示NS4B可能通过诱导肝细胞内质网应激反应在HCV感染及其致病性中发挥作用。     

人端粒酶逆转录酶基因启动子区的克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因启动子区的真核表达载体。方法：用核酸内切酶NotⅠ和KpnⅠ酶切报告基因GFP,插入pcDNA3．1( )载体,得到pcDNA3．1( )-GFP(PG)载体;用PCR方法扩增hTERT基因ATG上游的启动子序列,测序后用核酸内切酶BglⅡ和KpnⅠ酶切插入PG载体,得到pcDNA3．1( )-GFP—hTERT(PGT)载体。将PGT载体转染人食管癌EC9706细胞系,经G418筛选,荧光显微镜下观察。结果：克隆得到的启动子序列与文献相符,重组载体经酶切鉴定方向正确,含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。经转染人食管癌EC9706细胞系,在荧光显微镜下观察到绿色的阳性克隆。结论：克隆的人端粒酶逆转录酶基因启动子序列在真核细胞中具有启动子活性。     

RPS27a蛋白重组质粒的构建及其在肝癌细胞株的定位

目的:构建pcDNA3.1-RPS27a重组质粒载体并观察其在HepG2和SMMC7721细胞株中的定位和表达情况.方法:使用基因合成法合成RPS27a基因,将扩增后的目的基因连接至pcDNA3.1载体.转化DH5α大肠埃希菌后,进行质粒抽提然后电泳及测序鉴定.将鉴定后的pCDNA3.1-RPS27a质粒分别转染HepG2和SMMC7721细胞株,通过激光共聚焦显微镜观察其在真核细胞中的表达和定位情况.结果:pCDNA3.1-RPS27a 重组质粒构建成功.通过激光共聚焦显微镜观察发现RPS27a主要表达于HepG2和SMMC7721细胞的胞质中.结论:pCDNA3.1-RPS27a载体构建成功,证实了RPS27a主要表达于HepG2和SMMC7721细胞的细胞质中.     

基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒DNA多聚酶P结构域反式调节基因

目的：应用基因芯片技术，对乙型肝炎病毒DNA(HBVDNA)聚合酶P结构域蛋白／逆转录酶(PR)的基因表达谱进行分析，探索PR对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能。方法：设计并合成PR基因序列特异性的引物，应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增PR蛋白编码基因片段，以常规的分子生物学技术将获得的PR编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定，构建真核表达载体pcDNA3．1(-)-PR。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取mRNA，逆转录为cDNA，与转染空白表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析。结果：基因芯片技术所检测的1152个基因表达谱的筛选中，79条基因表达水平上调，90条基因表达水平下调。结论：应用基因表达谱芯片成功筛选了HBVDNA聚合酶PR转染细胞后差异表达基因，为进一步阐明PR蛋白可能的分子生物学机制提供依据。     

丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建

目的：构建HCV NS5A/pCI-neo真核表达载体,转染Huh-7细胞系,为体外高效表达NS5A蛋白奠定基础。方法：用PCR方法从带有丙型肝炎病毒NS5A基因的pC DNA 3.1（+）/HCV NS345质粒中扩增出HCV NS5A基因,然后TA克隆于pGEM-T载体中,转化大肠杆菌JM109。阳性克隆经测序鉴定,再经双酶切消化后插入真核表达载体pCI-neo上,经酶切鉴定与测序证实。结果：用PCR方法扩增出HCV NS5A基因全序列,因其 cDNA的G+C含量高直接测序未成功,后经TA克隆,筛选得到的阳性克隆经测序鉴定,与设计的HCV NS5A基因序列完全一致。经酶切连接并成功插入pCI-neo上。结论：成功构建了高效表达丙型肝炎病毒NS5A基因的pCI-neo真核表达载体。