乙型肝炎病毒X基因在HepG2肝癌细胞的转染及对Fas/FasL表达的影响

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因在HepG2肝癌细胞中的转染及对Fas/FasL表达的影响.方法用分子克隆方法构建HBV X真核表达载体pcDNA3-X,用脂质体转染方法瞬时转染HepG2细胞,以转染空载体pcDNA3的HepG2细胞及未转染质粒的HepG2为对照,抽提RNA,进行RT-PCR,检测HBV X基因的表达.以β-actin为内参,用半定量RT-PCR法检测三组细胞凋亡相关基因Fas/FasL mRNA相对表达量的变化.结果重组真核表达载体经RT-PCR及DNA测序均检测出HBV X特异性片段,pcDNA3-X转染HepG2细胞后,RT-PCR扩增出HBV X片段,空质粒组及正常对照组均未扩增出相应片段.转染HBx的细胞Fas与FasL mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高,差别有统计学意义(P＜0.05).结论成功构建HBV X真核表达载体pcDNA3-X,转染入HepG2肝癌细胞,并在该细胞中表达.HBx在肝癌细胞中的表达能上调Fas和FasL基因的表达.     

以MDR1基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立

通过构建以MDR1启动子为启动序列的荧光素酶报告基因载体,建立基于双荧光素酶报告基因系统的多药耐药抑制剂筛选模型。从HCT-8细胞中提取DNA并克隆含有MDR1基因启动子的序列。将该序列重组到荧光素酶报告基因载体pGL-3-Basic的启动区域中,从而构建报告基因载体pGL-MDR1。将pGL-MDR1和pRL-TK载体共转染到HCT-8和HCT-8/VCR细胞中,建立用于筛选多药耐药抑制剂的方法。通过调节不同载体的比例来优化转染效率。通过MDR1基因激活剂（热诱导）和抑制剂（EGCG）来验证该方法。通过直接测序法验证了pGL-MDR1含有MDR1基因启动子序列且没有出现碱基突变。在n（pGL-MDR1）∶n（pRL-TK）=5∶5时,转染效率最高并具有最高的荧光素酶活性。通过MDR1基因激活处理后表现为时间依赖性地激活MDR1基因的表达,而MDR1基因抑制剂的作用则相反。     

健康人APOBEC3G基因的克隆及真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G（apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalyticpolypeptide 3G,APOBEC3G）基因cDNA,构建APOBEC3G基因的真核表达载体,并在体外进行表达和鉴定。方法采用RT-PCR技术从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因,将该基因插入pcDNA3.1真核表达载体,构建pcDNA3.1-A3G真核表达质粒,并利用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-A3G转染HepG2和HL7702细胞,经免疫细胞化学、Western blot等方法检测APOBEC3G真核表达情况。结果双酶切鉴定和测序结果表明,APOBEC3G真核表达载体构建成功。免疫细胞化学和Western blot结果均显示,转染pcDNA3.1-A3G的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白均高表达,转染空质粒pcDNA3.1和未转染的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白低表达或不表达。结论成功构建了人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G,为进一步研究APOBEC3G抗HBV作用奠定实验基础。     

两个不同筛选特性的表达HBV X基因肝癌细胞模型的建立

目的：构建两个不同筛选特性的表达HBV X基因肝癌细胞模型。方法：应用脂质体介导转染克隆有HBV X全基因真核表达载体pCEP4-X和pcDNA3.1(+)-X入肝癌细胞HepG2,hygromycin和neomycin筛选单细胞克隆,传代培养一定时期后应用PCR,RT-PCR和Western blot方法鉴定HBV X基因的表达。结果：转染后成功筛选出耐hygromycin或neomycin的单细胞克隆,并能传代培养一定时期。PCR,RT-PCR和Western blot结果显示HBV X基因获得表达。结论:成功构建不同筛选特性的两个HBV X基因表达肝癌细胞模型。     

稳定表达HIV-1 GagPol基因真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建能稳定表达HIV-1 GagPol基因的真核表达载体.方法:用PCB方法扩增HIV-1 GagPol基因,克隆入pMD18-T,然后亚克隆人真核表达质粒pcDNA3.2(一)中,将构建的重组质粒pcDNA3.1(-)/GagPol分别瞬时和稳定转染HEK293细胞,经G418筛选,建立稳定转染GagPol基因的细胞系,并应用Western Blot方法鉴定表达产物.结果:酶切鉴定和Western Blot检测证实重组质粒pcDNA3.1(-)/GagPol构建正确,并能稳定表达HIV-1GagPol蛋白.结论:成功构建携带HIV-1 GagPol基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/GagPol,并在HEK293细胞中获得稳定表达.     

插入CpG序列和IL—2基因的HBV重组真核表达载体的构建

目的：构建插入CpG序列和IL-2基因的HBV重组真核表达载体。方法：采用PCR产物直接克隆方法,构建了编码HBsAg基因的真核细胞表达载体pcDNA3.1^ -HBsAg;并以此为基础通过重组DNA技术分别构建了在不同位置含不同数目的CpG序列的重组质粒pcDNA3.1^ -S/CpG1、pcDNA3.1^ -S/CpG2、pcDNA3.1^ -S/CpG1 CpG2及IL-2和HBsAg融合基因的表达载体pcDNA3.1^ -S/IL-2。通过脂质体基因转移技术导入Cos-7细胞中检测其瞬间表达。结果：通过酶切、PCR及测序证实已分别正确完整地插入IL-2基因和CpG序列,体外转染Cos-7细胞后可见基因的表达和分泌,结论：本实验成功构建了我们所设计的5种重组质粒,拟为今后探索优化基因疫苗的设计及HBV治疗性疫苗的研究奠定基础。     

HBV前C／C基因EB病毒载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的 研究HBV前C/C区基因变异的生物学意义。方法 构建HBV前C/C区基因EB病毒表达载体,采用脂质体介导方法将重组质粒转染到HepG2细胞,并表达HBeAg。结果 重组质粒经PCR和酶切鉴定均阳性,转染的细胞目的DNA和表达蛋白检测均阳性。结论 采用EB病毒载体构建HBV前C/C基因的表达载体。能在HepG2细胞中稳定表达目的蛋白,由于EB病毒载体以附着体的形式复制,不整合于缩主染色体基因中,拷贝数稳定,适合于体外研究HBVC/C基因变异的生物学意义。     

HBV x基因真核表达载体的构建及对肝癌细胞恶性表型的影响

目的 构建乙型肝炎病毒x基因真核表达载体并在肝癌细胞中表达,以研究其对肝癌细胞恶性表型的影响。方法 应用PCR、基因克隆等方法构建乙型肝炎病毒x基因真核表达载体pcDNA3.1-HBX,用基因转染的方法将pcDNA3.1-HBX转染入肝癌细胞HCC－9204,筛选稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌细胞。MTT比色实验、平板集落形成实验检测肝癌细胞恶性表型。结果 成功构建了乙型肝炎病毒x基因真核表达载体pcDNA3.1-HBX并获得了稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌细胞系HCC－9204细胞克隆,且MTT比色实验、平板克隆形成实验显示稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌细胞恶性度增高。结论 乙型肝炎病毒X蛋白具有生长因子样作用,可刺激肝癌细胞生长,在肝癌细胞中稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白可增加肝癌细胞恶性表型。     

APOBEC3G真核表达载体的构建及其对HBV复制表达的影响

目的:构建APOBEC3G真核表达载体,在体外初步探讨APOBEC3G对HBV复制表达的影响。方法:应用RT-PCR法从人PBMC细胞中扩增APOBEC3G基因,分子克隆法构建表达APOBEC3G蛋白的真核表达载体pcDNA3.1-APOBEC3G,并脂质体法转染HepG22.2.15细胞。Western-blot鉴定细胞中APOBEC3G蛋白的表达。ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg水平,实时定量PCR检测HBVDNA和HBV mRNA水平。结果:经酶切鉴定及测序证实APOBEC3G真核表达载体被成功构建,APOBEC3G蛋白可在HepG22.2.15细胞中表达。转染APOBEC3G重组质粒的HepG22.2.15细胞的HBsAg、HBeAg、HBVDNA及HBV mRNA水平均明显低于未转染重组质粒的HepG22.2.15细胞。结论:APOBEC3G明显抑制了HepG22.2.15细胞中HBV的复制与表达,成功构建APOBEC3G真核表达载体,为深入研究APOBEC3G抗HBV的作用机制奠定实验基础。     

建立稳定表达乙型肝炎病毒X基因肝细胞株的实验研究

目的：建立稳定表达乙型肝炎病毒 X 基因肝细胞株。方法对含酶切位点 EcoRⅠ、HindⅢ的 X 基因序列进行 PCR 扩增,构建 HBVx 基因质粒（pcDNA3.1（+）-HBVx）,利用转基因技术将 X 基因转入正常肝细胞构建稳定表达 X 基因的细胞株。结果 X 基因亚克隆入 pcDNA3.1（+）,有完整的X 基因片段,转入正常肝细胞获得稳定表达 X 基因的细胞株,转染 C57BL/6正常肝细胞有 HBVx mRNA 表达,且C57BL/6/HBVx 有 HBV 蛋白表达。结论成功构建稳定表达乙型肝炎病毒 X 基因肝细胞株。     

慢性B淋巴细胞白血病B细胞B7.2分子表达缺陷的研究

目的研究比较慢性B淋巴细胞白血病(BCLL)与正常人外周血中B细胞的B7.1、B7.2分子的表达水平,探讨其表达与慢性B淋巴细胞白血病发病机制的关系.方法将23例BCLL患者分为0～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期两组,并设正常对照组.乙聚蔗糖-泛影钠淋巴细胞分离液分离出BCLL患者及正常人的外周血单个核细胞,体外培养24h后,流式细胞仪检测B细胞B7.1、B7.2表达的百分率;BCLL组与对照组及0～Ⅱ期组与Ⅲ～Ⅳ期组间分别进行t检验.结果与正常对照组相比,Bell患者外周血B细胞胞.2分子的表达率(20%±13%)明显低于正常人(58%±12%,P＜0.O5),B7.1单独表达率及B7.1、B7.2同时表达率在正常人与BCLL两组比较差异无显著意义(P＞0.05);BCLL组中0～Ⅱ期组与Ⅲ～Ⅳ期组B7.2的表达率分别为25%±17%及17%±8%(P＞0.05).结论外周血B细胞B7.2分子的表达存在缺陷,这可能是此病的发病机制之一及机体不能免疫清除白血病细胞的重要原因.     

Multiplication of hepatitis B virus in fulminant hepatitis B

The presence in serum of hepatitis B e antigen (HBeAg) and hepatitis B virus DNA, which are each regarded as reflecting multiplication of hepatitis B virus, were looked for one to five days after the onset of hepatic encephalopathy in 64 patients with fulminant hepatitis B. HBeAg and hepatitis B virus DNA were found in the serum of only 24 (37%) and six (9%) patients, respectively. Hepatitis B virus DNA was absent from the serum in all 13 patients positive for anti-HBs. These findings indicate that replication of hepatitis B virus stopped after the onset of hepatic encephalopathy in most of the patients and support the view that an enhanced immune response stops the replication. Agents that inhibit viral multiplication would probably not have any effect at this stage of the disease.     

急性B淋巴细胞白血病B细胞B7分子表达缺陷

目的　探讨B7分子表达与急性B淋巴细胞白血病 (BALL)发病机制的的关系。方法　Ficoll Hypaque密度梯度离心法分离出患者及正常人的外周血单个核细胞 ,体外培养 2 4h后 ,流式细胞仪检测B细胞细胞膜表达B7.1、B7.2表达的百分率 ;BALL组与正常对照组作组间比较。结果　与正常对照组相比 ,BALL组B7.1、B7.2表达及B7.1、B7.2双表达的百分率明显低于正常人 (P <0 .0 5 )。结论　BALL外周血B细胞B7分子的表达存在缺陷 ,可能是BALL的发病机制之一及白血病细胞逃避机体“免疫监视”的重要原因。     

乙型肝炎病毒大蛋白（LHBs）检测的临床价值

目的探讨乙型肝炎病毒大蛋白（LHBs）诊断乙型肝炎的意义。方法采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测乙型肝炎病毒大蛋白（LHBs）、乙肝病毒前S1（PreS1）,采用荧光定量PCR方法检测HBV DNA。结果 HBeAg阳性样本中乙型肝炎病毒大蛋白与HBV DNA的检出无显著性差异（χ2=2.46,P〉0.05）;乙肝病毒前S1与HBV DNA的检出有显著性差异（χ2=17.34,P〈0.01）;乙型肝炎病毒大蛋白吸光度值（OD值）与HBV DNA拷贝数相关系数r=0.912,P〈0.05。在HBeAg阴性样本中LHBs的吸光度均值和阳性率均呈线性增加,Pre S1的吸光度均值以及阳性率与HBV DNA拷贝数均不相关。结论乙型肝炎病毒大蛋白（LHBs）与HBV DNA有良好正相关,与乙肝前S1（Pre S1）相比,LHBs可更好反映临床乙肝病毒复制水平。     

γ-干扰素调控慢性B淋巴细胞白血病B细胞B7.2分子表达

目的 :研究观察γ 干扰素调控慢性B淋巴细胞白血病 (BCLL)B细胞B7.2分子的表达 ,并观察B7.2水平的变化对免疫反应的影响。方法 :用 5 0 0IU·ml- 1 浓度的γ 干扰素体外孵育BCLL患者外周血B细胞 48h ,流式细胞仪检测孵育前后B7.2表达的百分率 ,电镜观察其形态变化 ;采用单向混合淋巴细胞反应 (MLR)技术观察B7.2水平的变化对淋巴细胞增殖的影响。结果 :BCLL患者外周血B细胞经 5 0 0IU·ml- 1 浓度的γ 干扰素体外孵育 48h后 ,B7.2的表达从 17%上升至 2 1% ;电镜观察 ,细胞未出现明显的树突状细胞的特征性改变 ;MLR观察 ,B7.2上调之后 ,实验组每分钟计数值增高 ,比较差异有显著性 (P <0 .0 5 )。结论 :γ 干扰素可轻度上调BCLLB细胞B7.2分子的表达水平 ,从而可能提高机体对BCLL细胞的免疫清除     

乙肝免疫球蛋白联合乙肝疫苗预防乙型肝炎母婴传播的疗效评价

目的：探讨乙肝免疫球蛋白联合乙肝疫苗预防乙肝病毒母婴传播的临床疗效。方法：将120例母亲乙肝表面抗原阳性的新生儿随机分为治疗组70例和对照组50例,对照组新生儿于出生后24 h内注射乙肝疫苗,治疗组新生儿母亲于孕28、32、36周分别注射乙肝免疫球蛋白,新生儿于出生后24 h内和出生后1个月分别注射乙肝免疫球蛋白。结果：治疗组和对照组新生儿脐血HBsAg阳性率分别为7.14%和22.0%,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）;治疗组新生儿出生后1、6、12个月的HBsAg阳性率均明显低于对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：乙肝免疫球蛋白联合乙肝疫苗可有效地阻断乙肝病毒母婴传播,对乙肝母婴传播的预防具有重要意义。     

乙肝疫苗联合乙肝免疫球蛋白阻断乙肝母婴传播的效果评价

目的：评价乙肝疫苗联合乙肝免疫球蛋白（ HBIG）阻断乙肝母婴传播的综合治疗疗效。方法对186例孕检的孕妇HBsAg阳性者随机分为治疗组（93例）和对照组（93例）,治疗组分别于孕24周、28周、32周、36周肌肉注射HBIG共4次,每次200IU,同时在不同部位注射乙肝疫苗20μg,共4次;对照组在同时间、同剂量单用HBIG。采用酶联免疫吸附测定法,检测用药前、后孕妇血清及新生儿脐血清的乙肝两对半,采用核酸荧光定量法检测HBV-DNA含量。结果治疗组用药后HBV-DNA含量比对照组明显下降。治疗组新生儿脐血清HBsAb检测率69．89％（65／93）明显高于对照组45．16％（42／93）。治疗组和对照组宫内感染率分别为5．38％,12．90％,两组比较差异有显著性（P＜0．05）。结论孕期用乙肝疫苗联合HBIG阻断乙肝母婴传播的治疗效果优于单一注射HBIG的治疗,对减少乙肝母婴垂直传播宫内感染的发生有临床指导意义。     

cyclin B1 的启动子在乏氧条件下活性的变化

目的探讨细胞周期素B1(cyclin B1)的启动子在乏氧条件下活性的变化。方法采用PCR法获得对Hela细胞cy-clin B1的启动子,通过基因重组插入pGL3 promoter vector从而获得表达。荧光素酶的活性检测,了解通过双萤光素酶活性检测分析cyclin B1的启动子在乏氧条件下活性的变化。结果双萤光素酶活性检测cyclin B1的启动子活性在乏氧条件下,表达明显下降。结论在乏氧条件下,Hela细胞的cyclin B1的启动子活性下降,可能是乏氧条件下肿瘤细胞的自我保护机制。