人脐静脉血管内皮细胞培养、冻存、复苏与鉴定

目的:探讨人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)体外分离、培养、冻存、复苏与鉴定的可靠方法.方法:采用改良的胶原酶灌注消化法对HUVEC体外分离、培养,按慢冻速融原则对第3代细胞进行液氮冻存、复苏.采用免疫组化Ⅷ因子相关抗原染色和活体细胞荧光DiI-Ac-LDL鉴定.结果:分离的原代HUVEC总数平均为1×106个细胞,最多达3×106个细胞;两种鉴定结果HUVEC均为95%以上阳性;冻存后分3批复苏细胞活性均超过90%.结论:成功建立了人脐静脉血管内皮细胞体外培养、冻存、复苏与鉴定方法,获得了足够数目和纯度的血管内皮细胞,保持了细胞的同源同代性.     

人脐静脉血管内皮细胞培养、冻存、复苏与鉴定

目的：探讨人脐静脉血管内皮细胞（humanumbicicalveinendothelialcell,HUVEC）体外分离、培养、冻存、复苏与鉴定的可靠方法。方法：采用改良的胶原酶灌注消化法对HUVEC进行分离、培养与鉴定,并遵循”慢冻快复”的原则进行冻存与复苏,同时使用Ⅷ因子相关抗原染色法进行鉴定。结果：分离的HUVEC生长良好,细胞总数可达I-3×10^2。Ⅷ因子相关抗原染色鉴定结果为95％以上阳性,冻存后复苏的细胞活性超过90％。结论：HUVEC可以从脐带获得并通过原代培养成为细胞系,获得了人脐静脉血管内皮细胞体外培养、冻存、复苏与鉴定的可靠方法。     

白藜芦醇对CXCL12诱导的人脐静脉内皮细胞株细胞增殖及血管生成的影响

[目的]探讨白藜芦醇(Resv)对CXCL12诱导的人脐静脉细胞株(HUVEC)细胞增殖及血管生成的影响.[方法]取体外培养的HUVEC细胞,给予CXCL12和Resv干预后采用MTT法检测HUVEC细胞增殖情况,采用Matrigel胶体外管型形成实验检测HUVEC细胞管型形成情况,利用RT-PCR法检测HUVEC细胞血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达水平.[结果]CXCL12可显著促进HUVEC细胞体外增殖、体外管型形成及VEGF mRNA表达(P<0.01,P<0.001);而Resv显著抑制CXCL12诱导的HUVEC细胞体外增殖、体外管型形成及VEGF mRNA表达(P<0.01,P<0.001).[结论]Resv可抑制CXCL12诱导的HUVEC细胞体外增殖及血管生成,其机制可能与下调VEGF mRNA表达水平有关系.     

电离辐射对血管内皮细胞影响的实验研究

目的　观察电离辐射 (X线 )对血管内皮细胞培养上清液中内皮素 (ET)和一氧化氮 (NO)含量变化及细胞凋亡的影响。方法　采用新生儿脐带静脉血管内皮细胞 (HUVEC)体外原代培养方法 ,用放免法和化学法检测培养上清液中ET和NO含量 ,用透射电镜、流式细胞仪观察细胞形态特征和检测凋亡细胞。结果　血管内皮细胞在电离辐射 2 4h后 ,各辐射剂量组培养上清液中NO含量无变化 ;在 2Gy剂量组ET含量变化不明显 ,而 5、10、2 0Gy各剂量组ET含量明显下降 (P <0 .0 5 )。电离辐射 2 4、4 8h后HUVEC形态无明显改变 ,未检测出明显凋亡细胞。结论　原代培养生长的HUVEC在 2～ 2 0Gy照射时有一定的放射抗性 ,其确切机理有待进一步研究     

肿瘤源性血管内皮细胞的培养及其细胞生物学特性鉴定

目的 探讨肿瘤来源血管内皮细胞的诱导和体外培养方法,并对其进行细胞生物学特性鉴定.方法 胰蛋白酶灌流消化法收集人脐静脉内皮细胞(HUVEC),采用肿瘤细胞的培养上清液诱导HUVEC增殖,制备肿瘤衍生的血管内皮细胞( Td-EC).采用形态学观察和荧光染色Ⅷ因子相关抗原,鉴定血管内皮细胞,用RT-PCR检测肿瘤血管内皮细胞标志物(TEM)的表达,采用迁徙试验、透射电镜、流式细胞仪细胞周期分析等方法检测、比较HUVEC和Td-EC的生物学特性.结果原代培养的HUVEC约于24h完全贴壁,4～5d 后融合成单层铺路石样结构.Ⅷ因子荧光染色证实培养的细胞是HUVEC.经肿瘤细胞上清液诱导后,用RT-PCR检测到TEM1和TEM8 mRNA在Td-EC中的表达;Td-EC细胞迁徙能力较HUVEC显著增强;Td-EC细胞增生活跃,G0～S期细胞比例明显增高,具有肿瘤血管内皮细胞特性.结论胰蛋白酶灌流消化法可获得大量连续传代扩增的HUVEC,并可诱导生成肿瘤源性的血管内皮细胞.     

大鼠股动脉血管原代内皮细胞的分离与培养

目的 体外分离、培养并鉴定大鼠股动脉血管原代内皮细胞,为相对较小血管来源的原代内皮细胞功能研究提供细胞模型.方法 无菌取大鼠股动脉血管,胶原酶消化大鼠股动脉血管内皮细胞使其分离,流式细胞术检测内皮细胞纯度;流式分选出CD31阳性细胞,并用激光共聚焦鉴定内皮细胞;以CCK-8法、高内涵细胞成像法检测内皮细胞增殖能力,以Transwell法、Matrigel胶法检测其迁移和成管功能.结果 胶原酶消化分离所得股动脉血管原代内皮细胞在14～16 d细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上,细胞呈现典型铺路石状.流式检测其纯度为38.34％,分选后利用CD31进行荧光染色鉴定,细胞均为CD31阳性;PGE2可显著上调CD31阳性内皮细胞增殖、迁移、成管功能.结论 该研究采用简便的方法成功分离得到股动脉血管原代内皮细胞,为研究相对较小血管来源的原代内皮细胞功能提供体外细胞模型.     

人脐静脉内皮细胞的分离培养与鉴定*

目的：建立体外培养原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的方法,并对培养的细胞进行鉴定,为人工血管立体环化打下基础。方法：胶原酶灌注法分离HUVEC,用含胎牛血清的RPMI-1640营养液培养。光镜、电镜、免疫荧光方法进行形态学鉴定,放射免疫法测定其细胞活性与分泌激素功能。结果：分离的HUVEC体外培养一周左右可长成单层,光镜下为多角形,呈铺路石子状排列。透射电镜可见W-P小体。荧光染色Ⅷ因子相关抗原阳性,培养上清中含高浓度6-keto-PGF1a与ET。结论：所培养的细胞为HUVEC,并具有其细胞生物学功能。     

MDA-MB-231细胞源exosome对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)VEGF自分泌及体外成管作用的影响

 目的 研究人乳腺癌MDA MB 231细胞源exosome对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)自分泌及体外成管作用的影响,探讨肿瘤细胞源exosome在肿瘤微环境中对血管内皮细胞血管生成的调控作用。方法 低温超速离心及密度梯度离心法提取乳腺癌MDA MB 231细胞源exosome;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HUVEC与exosome共培养24 h后上清液中VEGF的变化水平;Western blot技术检测HUVEC与exosome共培养24 h后VEGF、VEGFR2及p VEGFR2的蛋白表达情况;RT PCR法检测HUVEC与exosome共培养24 h后VEGF的基因表达情况;观察HUVEC与exosome共培养24 h后的体外成管能力。 结果 HUVEC与exosome共培养24 h后上清液中VEGF为(110.851±18.404)pg/mL,与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05);Western blot结果显示,HUVEC与exosome共培养24 h后VEGF和p VEGFR2的蛋白表达水平均增加(P＜0.05);RT PCR结果显示,HUVEC与exosome共培养24 h后VEGF的基因表达水平增加(P＜0.05);体外成管实验显示,exosome显著提高了HUVEC的管腔形成能力(P<0.05)。结论 乳腺癌MDA MB 231细胞源exosome促进了血管内皮细胞VEGF的表达及分泌,激活了血管内皮细胞VEGF/VEGFR2自分泌环并提高了血管内皮细胞的体外成管能力,对促肿瘤血管生成有一定的调控作用。     

脐带血血清在脐静脉内皮细胞培养中的应用

目的通过观察以人脐带血血清为主体的培养体系对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外培养扩增的影响,探讨人脐带血血清替代动物血清用于培养HUVEC的可行性。方法将取来的脐带,分成25 cm的两段(A、B段),均采用胰酶消化法分离HUVEC,分别加入DMEM完全培养液A(含20%的脐带血血清)和B(含20%的胎牛血清、20 ng/mL的血管内皮生长因子),并通过传代进行纯化和扩增培养,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察并绘制细胞生长曲线,用免疫组织化学方法对所得细胞进行鉴定,用流式细胞术检测细胞周期。结果成功建立了以人脐带血血清为主体的培养体系的HUVEC培养扩增的方法,A、B两段脐带HUVEC吸光度无明显差异(P>0.05),免疫组化可见两段HUVEC胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原均呈阳性反应,流式细胞术检测结果显示,A段HUVEC S期的细胞约占35.5%,S+G2+M期的细胞约占48.2%活跃于增殖期,而处于G0/G1期的细胞约占58.3%左右,符合其生长特性。结论应用灭活脐带血血清培养体系可成功扩增HUVEC,培养的细胞具有HUVEC的基本特性,脐带血血清可在取脐带的同时获得,方法简便,无需购买,为体外研究血管内皮细胞提供了价廉、易行的实验手段。     

采用体外侵袭实验分离侵袭性人原代肾细胞癌细胞

目的:体外分离肾细胞癌原代侵袭性和非侵袭性细胞.方法:消化法或植块法对32例临床新鲜肾细胞癌进行原代培养.在预实验确定铺胶浓度、消化回收时间的基础上,采用涂有Matrigel的Transwell对3例原代培养的肾细胞癌细胞进行体外侵袭实验,分离回收侵袭性和非侵袭性细胞.结果:(1)原代培养成功率为90.6%(29/32).(2)以1.0 mg/ml、20 μl/孔对Transwell铺胶,固定细胞悬液密度(5×105/ml),第5天消化回收细胞较为理想.非侵袭性细胞散在生长,侵袭性细胞多呈克隆样生长.侵袭性细胞倍增时间为36.1 h,非侵袭性细胞为50.6 h.结论:Transwell可体外快速分离及回收、培养不同侵袭性的肾癌原代细胞群.用原代肿瘤细胞进行体外侵袭实验代表性好,但难以突破肿瘤细胞的有限生存期.     

猕猴冠状动脉原代内皮细胞分离和培养及其功能验证

目的 建立非人灵长类动物冠状动脉原代内皮细胞的分离和培养方法,为研究人冠状动脉内皮细胞提供细胞模型。方法 无菌分离猕猴冠状动脉,胶原酶短暂消化后采用组织黏附法分离猕猴冠状动脉原代内皮细胞,利用流式细胞术检测并分选CD31阳性细胞,确定内皮细胞纯度;经前列腺素E₂(PGE₂)刺激后,以CCK-8法和高内涵细胞成像法分别检测猕猴冠状动脉原代内皮细胞活力和增殖能力、以Transwell法和Matrigel胶法分别检测猕猴冠状动脉原代内皮细胞迁移能力和体外成管功能。结果 猕猴冠状动脉原代细胞在10～14 d细胞覆盖培养瓶面积的80%左右,细胞呈不规则多边形和铺路石状。流式检测其纯度为31.7%左右,分选后利用流式细胞术再次检测内皮细胞纯度,达95%以上;PGE₂能显著上调猕猴冠状动脉原代内皮细胞的增殖、迁移和成管能力。结论 该研究成功建立猕猴冠状动脉原代内皮细胞分离培养方法,通过功能研究表明猕猴冠状动脉原代内皮细胞可以作为模拟人冠状动脉内皮细胞的体外细胞模型。     

动脉粥样硬化模型小鼠血管平滑肌细胞原代培养及鉴定

目的:介绍动脉粥样硬化模型小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)原代培养及鉴定的方法。方法:分离载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉,组织贴块法获得原代平滑肌细胞,免疫荧光及免疫组化方法检测细胞的纯度和分化状态。结果:培养第3天时,可见自组织块周围长出少量梭形或长梭形细胞,至培养2周细胞融合成片,呈"峰、谷"状生长。肌动蛋白免疫组化及荧光染色显示,细胞传至第6代后纯度在98%以上,证实应用此方法分离原代VSMC可以满足平滑肌体外功能实验的需求。结论:应用组织贴块法培养小鼠VSMC,操作简单,结果稳定,纯度较高,具有推广应用价值。     

八宝丹对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响

目的观察八宝丹(BBD)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖和迁移能力的影响。方法体外培养HUVEC,使用不同浓度BBD进行干预,MTT法检测HUVEC增殖情况,倒置显微镜观察细胞形态、划痕损伤,Transwell实验观察细胞损伤修复及迁移能力。结果 BBD能显著降低HUVEC的活力,抑制HUVEC增殖,抑制HUVEC的损伤修复和迁移能力,并呈现剂量依赖性。结论 BBD具有抑制HUVEC增殖和迁移的作用。     

黄蜀葵花总黄酮对人脐静脉血管内皮细胞形成新生血管的影响

目的观察黄蜀葵花总黄酮（TFA）对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）形成新生血管的影响。方法以体外培养HUVEC为模型,MTT法检测不同浓度TFA对细胞增殖的影响;Transwell小室细胞进行迁移实验检测药物对细胞迁移能力的影响;管形形成实验观察药物对细胞分化的影响。结果5.0~20.0 mg/L TFA作用72 h,不仅对HUVEC增殖有明显促进作用;而且能促进HUVEC迁移;10.0~20.0 mg/L TFA能够促进HUVEC管样结构形成。结论一定浓度的TFA具有明显促进HUVEC形成新生血管的作用。     

黄蜀葵花总黄酮对人脐静脉血管内皮细胞形成新生血管的影响

目的观察黄蜀葵花总黄酮（TFA）对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）形成新生血管的影响。方法以体外培养HUVEC为模型,MTT法检测不同浓度TFA对细胞增殖的影响;Transwell小室细胞进行迁移实验检测药物对细胞迁移能力的影响;管形形成实验观察药物对细胞分化的影响。结果5.0~20.0 mg/L TFA作用72 h,不仅对HUVEC增殖有明显促进作用;而且能促进HUVEC迁移;10.0~20.0 mg/L TFA能够促进HUVEC管样结构形成。结论一定浓度的TFA具有明显促进HUVEC形成新生血管的作用。     

原代脐静脉内皮细胞与脐静脉内皮细胞株的生物学特性比较

目的:建立高效脐静脉内皮细胞(human umbilicalvein endothelial cell,HUVEC)体外培养方法,与HUVEC株生物学特性进行对比研究,为组织工程及相关医学基础研究提供更好的细胞来源.方法:在新鲜脐静脉内灌注2.5 g/L胰蛋白酶消化获得内皮细胞,内皮细胞培养基(endothelial cellmedium,ECM)进行培养;RPMI1640培养HUVEC株.比较两组细胞形态;免疫组化、RT-PCR检测vWF,CD144的表达;Western Blot检测两组冻存复苏后细胞vWF,CD144蛋白水平的表达.结果:原代HUVEC体外生长2～3 d可铺满单层,细胞呈梭形、饱满,漩涡状排列生长,传代后可见管腔样结构;HU-VEC株胞质多颗粒,细胞单薄.免疫组化原代HUVEC的vWF和CD144表达明显高于HUVEC株[vWF分别为(142.7±3.3),(113.6±0.7);CD144分别为(118.6±0.5),(74.2±0.4);P<0.01].在mRNA水平,原代HUVEC基因CD144(577 bp)的表达量为HUVEC株的(3.15±0.12)倍(P<0.05);vWF(434 bp)表达量为HUVEC株的(6.15±0.37)倍(P<0.05).蛋白水平冻存复苏的原代HUVEC的CD144(135ku)表达量为HUVEC株的(2.07±0.31)倍(P<0.05);vWF(210 ku)表达量为HUVEC株的(5.38±0.23)倍(P<0.05).结论:脐静脉灌注胰蛋白酶消化法配合ECM培养可迅速获取大量内皮细胞,其生物学特性明显优于HUVEC株,是组织工程及相关医学基础研究更好的细胞来源.     

乳鼠软骨细胞体外培养及生物学特性研究

目的:研究体外培养乳鼠胸骨剑突软骨细胞的原代培养方法,探讨该方法应用的可行性和应用价值.方法:采用胶原酶消化法分离培养乳鼠胸骨剑突软骨细胞,以含20%胎牛血清的高糖DMEM培养液进行培养,并进行细胞接种与传代,用倒置显微镜、电镜及组织学方法观察细胞形态、超微结构.细胞采用ABC法进行Ⅱ型胶原免疫组化染色以及细胞形态观察鉴定软骨细胞起源.结果:(1)原代培养软骨细胞48 h后,大量细胞贴壁生长,呈圆形、长梭形或有2～3个突起,胞质透亮、饱满,7 d后细胞铺满整个培养皿底面.(2)原代软骨细胞呈圆形或多角形,第4代有一半变成梭形,第5代绝大部分变为长梭形;原代软骨细胞胞浆内粗面内质网和线粒体丰富,第3代软骨细胞生长增殖能力强于原代,第5代增殖能力明显减弱.结论:体外培养的乳鼠剑突软骨细胞保持了其体内的基本特征,采用胶原酶消化法分离培养软骨细胞是一种可靠、简便、快速的细胞原代分离培养方法.第3代软骨细胞适合用于软骨组织工程及学术研究.     

酶消化法分离培养原代肺动脉平滑肌细胞及免疫组化鉴定

目的建立体外胶原酶消化法分离培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)及免疫鉴定的方法。方法采用I型胶原酶对PASMCs进行体外培养。在无菌环境下,分离提取雄性Sprague Dawley(SD)大鼠肺动脉主干,剥离外膜、剔除内皮细胞,经酶消化法,体外培养PASMCs。倒置相差显微镜观察PASMCs生长状态及特点;台盼兰测定细胞活力;免疫细胞染色法进行平滑肌α-肌动蛋白(α-SM actin)鉴定。结果酶消化法分离培养的PASMCs 3 d后,可见细胞贴壁呈梭形生长,6 d后生长迅速呈典型的峰-谷状生长,9 d后达90%融合。通过形态学观察及免疫荧光染色法鉴定表明:培养的细胞为PASMCs;细胞存活率为98.5%;原代培养8~10 d后即可传代,3-10代细胞生长迅速、细胞形态不易发生改变,可用于进行细胞实验。结论采用I型胶原酶消化法简单易行、可靠、PASMCs生长迅速、传代周期短的特点;尤为重要的是,培养的原代PASMCs可用于肺动脉高压和肺血管重构的研究工作。     

黄芪与当归对人脐静脉内皮细胞增殖及VEGF表达的影响

目的: 探讨黄芪与当归对内皮细胞(ECs)增殖周期及血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响。方法: 以体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为模型,HUVEC经分离、原代和传代培养与鉴定,选择第4 或第5代细胞进行实验;MTT法检测不同剂量黄芪与当归对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测黄芪与当归对HUVEC增殖周期的影响;半定量RT PCR检测黄芪与当归对HUVEC的VEGF mRNA表达的影响。结果:细胞周期检测显示黄芪及当归组S期细胞数显著增多(P<0.01)。黄芪+当归组G0 G1 期细胞数明显减少(P<0.05),S期和G2 M期细胞数明显增多(P<0.05)。RT PCR结果表明,黄芪与当归使HUVEC的VEGF mRNA表达明显增强,黄芪+当归(200μg/ml)组是对照组的1.82倍;当归(200μg/ml)组是对照组的1.88倍;黄芪(200μg/ml)组是对照组的1.51倍。结论:黄芪与当归及其复方具有促进内皮细胞增殖作用,黄芪+当归可明显促进HUVEC的DNA合成及有丝分裂。黄芪与当归可促进HUVEC的VEGF mRNA表达,提示黄芪与当归通过刺激VEGF表达而促血管新生。     

原代人脐静脉内皮细胞的分离培养及其对人巨细胞病毒的易感性研究

目的 通过检测原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对人巨细胞病毒(HCMV)的易感性,探讨胎儿宫内感染HCMV的可能途径.方法 无菌条件下取30例健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带,向脐静脉灌注0.1%胶原酶Ⅱ 37 ℃消化15 min,通过对细胞的形态学观察和免疫荧光染色方法对细胞进行纯度鉴定;用HCMV病毒株体外感染HUVEC,通过对HCMV基因及蛋白检测确定HUVEC对HCMV的易感性.结果 0.1%胶原酶Ⅱ、15 min的消化方法对HUVEC有较好的分离效果,免疫荧光染色结果表明HUVEC细胞内有Ⅷ因子相关抗原表达; HCMV体外感染HUVEC 72 h后形态学有明显改变,病毒基因及蛋白均有阳性表达.结论 原代HUEVC对HCMV易感,通过脐静脉的血液传播可能是胎儿宫内感染HCMV的重要途径之一.