医学微生物学实验教学体系改革

针对不同教学对象的特性,建立新型医学微生物学实验教学体系,以利于实现培养新世纪创新性人才目标。在新型实验教学体系下,通过制定个性化教学大纲,体现学生的学制和专业特色;通过丰富教学层次,增加综合性和设计性实验比重,提高学生的创新思维和逻辑分析能力;通过转变传统“上对下”的教学方式,体现学生的自主地位、调动学生的学习主动性。     

rAdCDES的构建及对人肿瘤细胞抑制作用

目的:构建一种对肿瘤有直接和间接治疗作用的重组腺病毒rAdCDES。在体外进行抑瘤实验研究。方法:用PCR法扩增CD和glyES基因片段,插入腺病毒穿梭质粒。用细菌内同源重组法与腺病毒骨架质粒重组构建出重组腺病毒质粒,经脂质体介导转染293包装细胞扩增获取重组腺病毒rAdCDES。用MTT法检测其对人乳腺癌细胞株MCF-7、人肝癌细胞株SMMC-7721和人肺腺癌细胞株A549的生长抑制情况。结果:成功构建了rAdCDES,其病毒滴度为1×1010.3TCID50/ml;rAdCDES在体外对人的MCF-7、A549、SMMC-77213种肿瘤细胞有明显抑制作用,与对照rAdLacZ(19.2±7.8)%相比较有显著性差异(P<0.01)。结论:rAdCDES在体外对肿瘤细胞有明显的抑制作用,为其用于基因治疗奠定了基础。     

一种简易、廉价、高效构建重组腺病毒载体的方法

目的：建立构建重组腺病毒载体的简易、廉价、高效方法，为进一步应用含自杀基因的重组腺病毒治疗恶性肿瘤奠定基础。方法：Pme Ⅰ线性化腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV、切胶纯化，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1按一定比例混合后，以化学转化法导人大肠杆菌BJ 5 183，在菌内进行同源重组，构建重组腺病毒质粒rpAdEasyGFP。以脂质体法将重组质粒转染293细胞包装重组腺病毒rAdGFP。结果：细菌内同源重组率高达80％；在293细胞中成功产生重组腺病毒。结论：对目前应用广泛的AdEasy系统进行了有效改进，在获得较高阳性重组率的同时，降低了对实验室设备的要求。     

重组腺病毒rAdCDglyES的ES基因生物活性鉴定

目的:对构建的含融合自杀基因CDglyES的重组腺病毒中的ES基因是否具有独立的生物活性功能进行鉴定,为rAdCDglyES用于治疗恶性肿瘤奠定理论依据。方法:用重组腺病毒rAdCDglyES培养上清,在体外进行内皮细胞ECV-304生长抑制实验,同时做鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验,观察血管生成抑制。结果:重组腺病毒rAdCDg-lyES培养上清对内皮细胞ECV-304的生成有抑制作用(抑制率78.7%),而在鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验中加入培养物上清的实验组与对照组相比鸡胚尿囊膜血管密度稀疏,平均血管数差异明显(P<0.01)。结论:构建的重组腺病毒rAdCDglyES表达产物具有独立的ES功能即抑制内皮细胞增殖,抑制新生血管形成的生物功能。     

重叠延伸PCR方法的建立与应用

目的建立一种新型PCR技术（重叠延伸PCR）并用于腺病毒早期基因E1A与内核蛋白体进入位点IRES（internal ribosome entry site）的直接连接,为构建复制型腺病毒载体作准备.方法以PcAE1A质粒与PIRES-EGFP质粒为模板,通过引物设计,使E1A基因3＇端与IRES基因5＇端具有相互重叠的一段序列,用该组引物行PCR分别扩增E1A基因与IRES基因,再以这两种PCR产物的混合物作为模板,进行重叠延伸PCR扩增E1A-IRES基因片段.结果经酶切及测序鉴定重叠延伸PCR方法成功构建了E1A-IRES基因片段.结论重叠延伸PCR法能将任意两段DNA序列连接起来,其在分子生物学的领域中具有潜在应用价值.     

高效化学转化菌内同源重组法构建重组腺病毒

目的：对细菌内同源重组法构建重组腺病毒AdEasy系统加以改进，为制备具有更高抗肿瘤疗效的生物治疗制剂奠定基础。方法：将自杀基因CD和HSV—TK插入穿梭质粒pAdTrack—CMV中，Pme I酶切后，用酚：氯仿抽提、乙醇沉淀或切胶回收纯化；分别采用电穿孔转化法和化学转化法将线性穿梭质粒(pAdTrackCMV-CDglyTK)与腺病毒骨架质粒pAdEasy—1在细菌内实现同源重组；将重组腺病毒质粒rpAdEasyGFP-CDglyTK以脂质体介导至293细胞中进行包装、扩增。结果：采用切胶回收化学转化法获得阳性重组率最高(100％)。经PCR、酶切以及测序等方法鉴定，证实融合自杀基因已成功插入腺病毒中。结论：对细菌内同源重组法构建重组腺病毒的方法进行了改进，在降低实验成本的同时获得了较原法更高的阳性重组率，并成功构建了复制缺陷性重组腺病毒rAd-CDglyTK。     

腺病毒介导CDES融合基因对乳腺癌细胞的抑制作用

目的:构建一种重组腺病毒rAdCDES,在体内外进行抑瘤和放疗增敏作用实验研究.方法:用细菌内同源重组法与腺病毒骨架质粒重组构建出重组腺病毒质粒,经脂质体介导转染293包装细胞扩增获取重组腺病毒rAdCDES.用测定生长曲线和MTT法检测其对人乳腺癌细胞株MCF-7的生长抑制情况;建立津白号鼠乳腺癌模型,观察rAdCDES和放疗对瘤体大小及鼠存活期的影响.结果:成功构建了rAdCDES;rAdCDES对MCF-7细胞生长抑制率达(83.1±8.1)%,与对照rAdLacZ(19.2±7.8)%相比较有显著性差异(P＜0.01);体内rAdCDES对小鼠乳腺癌MA737细胞有明显生长抑制作用,延长了小鼠的存活期,且对放疗有肯定的增敏作用.结论:本文所构建的rAdCDES在体内外对乳腺癌细胞均有明显的抑制作用和对放疗的增敏作用.     

肝细胞癌基因治疗的体外实验研究

目的 :构建一种对肝细胞癌有直接、间接治疗作用的重组腺病毒。方法 :用PCR方法扩增CD基因和glyES基因片段 ,插入腺病毒穿梭质粒。用细菌内同源重组方法与腺病毒骨架质粒重组构建出重组腺病毒质粒。经脂质体介导转染293包装细胞扩增获取重组腺病毒rAd CDglyES。用MTT法检测其对肝癌细胞株 (SMMC -7721)的生长抑制率及其表达产物对经ECGF处理的脐静脉血管内皮细胞 (ECV -304)增殖的影响。结果 :纯化的重组腺病毒滴度为1×1013 3TCID50/L ,对SMMC 7721的生长抑制率达 (82 1±8 3) % ,与对照组 (24 6±14 1) %比较有显著性差异 (P<0 01)。浓缩的转染了该重组腺病毒的细胞培养上清液对ECV 304细胞增殖的抑制率为(78 7±1 8) % ,而同样浓缩的转染了对照重组腺病毒rAd CD的细胞培养上清液的抑制率仅为 (24 2±9 7) % ,两者亦有显著性差异 (P<0 01)。结论 :rAd CDglyES在体外对肝癌细胞具有直接和间接抑瘤作用     

重组腺病毒rAdCDglyES体内抑瘤作用的研究

目的：探讨重组腺病毒rAdCDglyES对肺癌的体内抑、杀瘤作用。方法：建立近交纯系C57BL小鼠Lewis肺癌模型：于小鼠荷瘤部位注射定量的重组腺病毒rAdCDglyES并给予5-氟胞嘧啶。通过观测小鼠瘤体大小、重量，中位生存期．及组织病理学改变判定疗效。结果：对荷瘤小鼠连续10d的治疗观测后发现，实验组与对照组之间平均瘤重有显著性差异（P〈0．05）；对荷瘤小鼠的中位生存期比较发现实验组较对照组天数有显著性差异（P〈0．05）；对实验组和对照组肿瘤进行HE染色后病理检测，镜下所见，含ES基因的实验组小鼠瘤组织血管数明显少于对照组，仅为对照组的53．85％（14／26）。结论：rAdCDglyES／5-FC对C57BL小鼠的Lewis肺癌有明显的抑杀瘤作用。     

人脐静脉内皮细胞的分离培养与鉴定*

目的：建立体外培养原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的方法,并对培养的细胞进行鉴定,为人工血管立体环化打下基础。方法：胶原酶灌注法分离HUVEC,用含胎牛血清的RPMI-1640营养液培养。光镜、电镜、免疫荧光方法进行形态学鉴定,放射免疫法测定其细胞活性与分泌激素功能。结果：分离的HUVEC体外培养一周左右可长成单层,光镜下为多角形,呈铺路石子状排列。透射电镜可见W-P小体。荧光染色Ⅷ因子相关抗原阳性,培养上清中含高浓度6-keto-PGF1a与ET。结论：所培养的细胞为HUVEC,并具有其细胞生物学功能。