大鼠股动脉血管原代内皮细胞的分离与培养

目的 体外分离、培养并鉴定大鼠股动脉血管原代内皮细胞,为相对较小血管来源的原代内皮细胞功能研究提供细胞模型.方法 无菌取大鼠股动脉血管,胶原酶消化大鼠股动脉血管内皮细胞使其分离,流式细胞术检测内皮细胞纯度;流式分选出CD31阳性细胞,并用激光共聚焦鉴定内皮细胞;以CCK-8法、高内涵细胞成像法检测内皮细胞增殖能力,以Transwell法、Matrigel胶法检测其迁移和成管功能.结果 胶原酶消化分离所得股动脉血管原代内皮细胞在14～16 d细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上,细胞呈现典型铺路石状.流式检测其纯度为38.34％,分选后利用CD31进行荧光染色鉴定,细胞均为CD31阳性;PGE2可显著上调CD31阳性内皮细胞增殖、迁移、成管功能.结论 该研究采用简便的方法成功分离得到股动脉血管原代内皮细胞,为研究相对较小血管来源的原代内皮细胞功能提供体外细胞模型.     

人血管内皮细胞体外培养模型的建立

目的探讨人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)体外原代培养及功能检测的可靠方法。方法采用改良的胶原酶灌注消化法分离HUVEC,用免疫荧光法鉴定细胞纯度;用血清+DMSO冻存HUVEC,用Edu法检测细胞增殖能力,Matrigel体外成管实验检测血管内皮细胞功能。结果培养得到高纯度(99%)、高数量(1×106~3×106)、高质量(增殖与成管能力均良好)的原代细胞。结论建立了分离、培养、保存HUVEC及对其功能检测的可靠方法,为血管新生研究提供了理想的细胞模型和实验思路。     

双阴性选择法纯化培养人骨髓多能成体祖细胞

目的 建立体外分选纯化及培养人骨髓来源多能成体祖细胞(MAPCs)的方法.方法 取健康成人志愿者适量骨髓采用梯度密度离心法分离获取单个核细胞,贴壁培养后,将获取的骨髓贴壁细胞通过CD45、血糖蛋白A(GlyA)免疫微磁珠(miniMACS)负分选,流式细胞术鉴定分选后细胞纯度;对传代到不同阶段的细胞进行CD45、GlyA流式细胞分析,初步了解MAPCs在培养、增殖过程中的免疫学稳定性.结果 通过miniMACS分选,平均每1×10⁶/ml骨髓贴壁细胞可分选出约(5～10)×10⁴/ml的MAPCs,分选前后细胞活力分别为(96.7±1.7)%和(96.0±2.4)%,无明显差异;自制的培养基培养分选后的MAPCs生长良好,最长传代到第16代;流式细胞仪分析获取的CD45、G1yA-细胞纯度大于98%;流式细胞仪分析传代第4、8、12代MAPCs,CD45^-、G1yA^-细胞纯度大于98%.结论 CD45、GlyA miniMACS负分选可从骨髓中分离高纯度的MAPCs;MAPCs在本室自制的人MAPCs培养基中体外有较强的增殖能力,且能保持较长时间的稳定状态.     

免疫磁珠分选法原代培养小鼠肺微血管内皮细胞

目的：探讨一种高效、稳定的小鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）原代培养方法。方法：选取45只1周龄Balb/c小鼠,随机分成3组,分别用酶消化法、组织贴块法、免疫磁珠分选法3种方法分离培养小鼠PMVECs,观察细胞形态学以及VIII因子相关抗原免疫荧光染色鉴定内皮细胞,计算各组原代培养成功率及从原代培养开始到首次传代所需时间,测定细胞纯度,MTT法绘制生长曲线。结果：3组原代培养的细胞在倒置显微镜下均能见到短梭形、多边形的微血管内皮细胞,血管内皮细胞特异性标志物VIII因子相关抗原表达阳性。免疫磁珠分选法组原代培养成功率及细胞活性显著高于其他2组,差异有统计学意义（P＜0.01）,从原代培养至首次传代所需的时间短于组织贴块法组,差异有统计学意义（P＜0.05）,细胞纯度显著高于酶消化法组,差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：相比于酶消化法与组织贴块法,免疫磁珠分选法原代培养小鼠PMVECs具有重复性好,分离速度快,细胞纯度高及活性好的优点。     

骨髓基质细胞的分离培养及转基因标记

目的采用密度梯度离心法进行骨髓基质细胞(MSCs)的分离培养,结合体外转入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因标记方法,可提供大量纯度高、便于观察的种子细胞。方法取成年SD大鼠四肢骨及胸骨获取骨髓细胞冲洗液,密度梯度离心法分离后培养,HE染色观察细胞核浆比,流式细胞术测定细胞纯度;用逆转录病毒载体转染EGFP标记基因,G418筛选后传代培养,流式细胞术检测EGFP的表达率。结果原代培养的MSCs形态多样,增殖迅速,随着培养时间的延长,细胞增殖变慢,形态趋于同一,以梭形细胞为主,核浆比高;流式细胞术检测发现CD90 /CD45-/CD11b-细胞达到75%,细胞在体外能够稳定地表达EGFP,表达率达到55.16%。结论运用密度梯度离心法分离培养的MSCs纯度高,增殖能力强;体外转入EGFP基因是一种方便、特异性高的标记MSCs的方法,为脑损伤修复研究提供了依据。     

钩吻素子对免疫磁珠分离纯化的小鼠CD4+T细胞体外增殖的影响

目的 探讨小鼠脾脏CD4⁺T细胞的分离方法,观察钩吻素子(Kou)对小鼠脾脏CD4⁺T细胞体外增殖的影响.方法 以免疫磁珠分选法从小鼠脾脏细胞中分离CD4⁺T细胞,流式细胞术检测所得细胞的纯度,台盼蓝法检测细胞活力.将10～20μg/ml Kou分别作用于经刀豆蛋白A或植物血凝素刺激的小鼠T淋巴细胞,四唑盐比色法检测细胞增殖情况,用酶联免疫法检测细胞上清中IL-2的含量.结果 经过流式细胞仪测定分离后的小鼠脾脏CD4⁺T细胞纯度达到90.%±5.8%:0.2%台盼兰染色细胞活力为94.9%±.6%;增殖试验表明分离后未加Kou的CD4⁺T细胞对刀豆蛋白A、植物血凝素的刺激保持了良好的增殖能力,当浓度范围为20～20μg/ml时,Kou均能抑制淋巴细胞的增殖(P<0.05),且表现出一定的剂量相关性;不同浓度的Kou(20、100、200μgm1)作用后,CD4⁺T细胞培养上清中的IL-2水平明显低于对照组(P<0.05).结论 免疫磁珠阴性分选法操作简单、快速,可获得较高纯化率、有活性的CD4⁺T细胞;Kou明显抑制小鼠CD4⁺T淋巴细胞增殖反应,此抑制作用可能与Kou抑制小鼠CD4⁺T细胞IL-2的分泌及免疫抑制作用相关.     

人真皮淋巴管内皮细胞的分离及冷冻保存

目的建立分离培养人真皮淋巴管内皮细胞(LECs)及其冷冻保存技术。方法采用中性蛋白酶及胶原酶消化结合免疫磁珠方法,分选CD34-/CD31 细胞。所获内皮细胞进行体外培养,经免疫荧光染色、RT-PCR鉴定证实为LECs。采用梯度降温法冻存内皮细胞,经复苏后进行形态学观察,以台酚蓝试验、MTT试验、流式细胞术细胞检测等方法鉴定细胞生物学特性。结果中性蛋白酶及胶原酶消化方法结合免疫磁珠分选,可从真皮组织获取高纯度的LECs。与新鲜细胞相比,复苏的内皮细胞活力保持在92%以上。复苏后的内皮细胞形态学、生物学特性及生长曲线与新鲜细胞差异无统计学意义。冻存内皮细胞的凋亡率较新鲜内皮细胞高,为(9.15±0.34)%vs(5.31±0.23)%,但无统计学差异(P>0.05)。结论中性蛋白酶及胶原酶消化结合免疫磁珠分选,可获取足够数量及纯度的LECs;冻存的内皮细胞复苏后无明显形态学改变,并保持较高的活力及体外增殖能力;可作为种子细胞来源,为淋巴管系统发育和新生研究提供方便。     

冻存对血管内皮干细胞增殖和分化能力的影响

目的探讨冻存对人脐血来源血管内皮干细胞(EPCs)增殖、分化能力的影响。方法采用密度梯度离心法结合MACS分选法提取人脐血中CD133 细胞,进行流式细胞仪检测纯度;将EPCs冻存3,6,12,18个月后进行常规培养、诱导分化,利用细胞免疫组化进行鉴定,并比较不同冻存时间的EPCs的增殖能力。结果经流式细胞仪检测CD133 细胞平均占单核细胞的(1.13±0.10)%,磁珠分选所得CD133 细胞平均纯度为(91.45±1.04)%;CD133 细胞贴壁生长,可分化为梭形血管内皮细胞及形成集落,经免疫组化检测大部分表达CD34和Ⅷ因子;冻存3,6,12,18个月后,EPCs的增殖、分化能力有所下降。结论长时间的冻存可减弱EPCs的增殖、分化能力。     

原代人脐静脉内皮细胞分离和培养方法的改进

目的建立一套高效、方便、可靠的脐静脉内皮细胞的体外分离和培养方法。方法取剖腹产新生婴儿脐带,加入Ⅰ型胶原酶消化分离人脐静脉内皮细胞,内皮专用培养基EGM-2培养传代。应用相差显微镜观察细胞形态。DiL-Ac-LDL染色证实细胞具有内皮功能。免疫荧光染色证明新分离细胞表达FⅧ相关抗原。流式细胞仪检测细胞表面表达CD31。结果原代培养细胞培养10～15d左右长成单层,细胞呈多角形,铺路石样排列。DiL-Ac-LDL染色阳性,证实细胞具内皮吞噬功能。免疫荧光检测证明细胞特异性表达FⅧ相关抗原。流式细胞仪检测证明细胞表面高表达CD31。结论通过酶灌注法消化脐静脉血管获得细胞,操作简便、高效,EGM-2培养基可保证内皮细胞具有较高纯度,细胞形态学观察和细胞生物学鉴定证明获得人脐静脉血管内皮细胞。     

人真皮淋巴管内皮细胞的分离及冷冻保存

目的 建立分离培养人真皮淋巴管内皮细胞(LECs)及其冷冻保存技术.方法 采用中性蛋白酶及胶原酶消化结合免疫磁珠方法,分选CD34-/CD31+细胞.所获内皮细胞进行体外培养,经免疫荧光染色、RT-PCR鉴定证实为LECs.采用梯度降温法冻存内皮细胞,经复苏后进行形态学观察, 以台酚蓝试验、MTT试验、流式细胞术细胞检测等方法鉴定细胞生物学特性.结果 中性蛋白酶及胶原酶消化方法结合免疫磁珠分选,可从真皮组织获取高纯度的LECs.与新鲜细胞相比,复苏的内皮细胞活力保持在92%以上.复苏后的内皮细胞形态学、生物学特性及生长曲线与新鲜细胞差异无统计学意义.冻存内皮细胞的凋亡率较新鲜内皮细胞高,为(9.15±0.34)% vs(5.31±0.23)%,但无统计学差异(P＞0.05).结论 中性蛋白酶及胶原酶消化结合免疫磁珠分选,可获取足够数量及纯度的LECs;冻存的内皮细胞复苏后无明显形态学改变,并保持较高的活力及体外增殖能力;可作为种子细胞来源,为淋巴管系统发育和新生研究提供方便.     

免疫磁珠法分选人骨髓多能成体祖细胞及初步鉴定

目的:应用免疫磁珠法分选人骨髓多能成体祖细胞,观察其分选效果,建立体外分选纯化及培养人骨髓来源多能成体祖细胞(hMAPCs)的方法.方法:取健康成人志愿者适量骨髓后采用梯度密度离心法分离获取单个核细胞,在自制培养基下贴壁培养后,将获取的骨髓贴壁细胞通过CD45、血糖蛋白A(GlyA)免疫微磁珠(miniMACS)负分选,锥虫蓝拒染实验计数MACS分选前后细胞活力.流式细胞仪鉴定分选后细胞纯度;流式细胞仪分析培养细胞CD29、CD44、CD34和HLA-DR表达情况.结果:通过MACS分选,平均每1×106/ml骨髓贴壁细胞可分选出约(5～10)×104/ml hMAPCs,分选后的hMAPCs细胞生长良好,最长传代到第20代.分选前后细胞活力分别为(96.7±1.7)%和(96.0±2.4)%,无明显差异;流式细胞仪分析获取的CD45-、GlyA-细胞纯度大于98%;流式细胞仪检测hMAPCs中CD29阳性表达细胞比率为99.2%,CD44阳性细胞比率为98.3%,CD34阳性细胞比率为1.2%,HLA-DR阳性细胞比率为5.3%.结论:CD45、GlyA免疫微磁珠负分选可从骨髓中分离高纯度的hMAPCs;分选后hMAPCs在自行研制的培养基中有较强的增殖能力.     

利拉鲁肽通过PI3K/Akt 和MAPK/ERK通路促进心肌微血管内皮细胞的增殖和迁移

目的研究胰高血糖素样肽-1类似物利拉鲁肽对原代大鼠心肌微血管内皮细胞（CMECs）增殖和迁移的影响及其机制。方
法使用双酶消化法体外分离培养SD大鼠心肌微血管内皮细胞,差速贴壁法进行纯化,CD31和Ⅷ因子抗体进行免疫细胞化学
染色鉴定。采用不同浓度利拉鲁肽（0~1000 nmol/L）干预1 代细胞,MTT绘制细胞生长曲线,Western blot 检测利拉鲁肽对
PI3K/Akt和MAPK/ERK通路的激活作用,BrdU荧光标记法和划痕实验观察药物作用下细胞增殖和迁移能力,并使用相应的通
路阻断剂LY294002 和PD98059 来进一步证实。结果体外分离原代CMECs,CD31 及Ⅷ因子免疫荧光染色示双阳性率大于
95%,MTT示细胞于种植48 h后进入对数生长期,利拉鲁肽以浓度依赖方式促进CMECs的体外增殖,100 nmol/L为其最适生长
浓度（P<0.05）。予以100 nmol/L利拉鲁肽预干预细胞24 h后,Western blot显示胞内Akt和ERK磷酸化水平与正常细胞组相比
有明显升高（P<0.05）,加入相应通路阻断剂LY294002和PD98059,其磷酸化水平相较于利拉鲁肽组明显降低（P<0.05）。BrdU
和划痕实验均说明利拉鲁肽能促进CMECs的增殖和迁移能力（P<0.05）,使用LY294002和PD98059预处理后,增殖迁移能力均
显著低于利拉鲁肽组（P<0.05）。结论利拉鲁肽是通过激活胞内PI3K/Akt和MAPK/ERK通路从而促进原代大鼠心肌微血管
内皮细胞的增殖和迁移。
     

两种纯化大鼠毛囊干细胞方法的比较

目的:显微分离技术分别与流式细胞仪分选和免疫磁珠分选两种方法联合使用,比较不同方法的优缺点,以进一步探"索毛囊干细胞的体外分选培养的条件.方法:显微分离鼠毛囊隆突部,消化成单细胞悬液.分别利用流式细胞仪和免疫磁珠分选毛囊干细胞.观察细胞形态并检测分选前后细胞的纯度,活性,回收率,进行免疫荧光鉴定.结果:两种方法均能分选出实验所需的毛囊干细胞.流式细胞仪分选细胞纯度高,活性稍弱;免疫磁珠法分选细胞纯度稍低但活性强.结论:流式细胞仪分选和免疫磁珠分选均能有效获取毛囊干细胞.显微分离技术可根据实验需求选择不同的分选方法搭配.     

SD大鼠胚胎后肾间充质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的 对SD大鼠胚胎后肾间充质细胞(MMSCs)进行分离培养,并检测其生物学特性.方法 采用胚胎后肾微组织块接种培养法,检测其生长曲线和生长周期,并进行细胞表面抗原和成骨能力的鉴定.结果 MMSCs体外培养生长状况良好,具有活跃的增殖能力.细胞周期显示90%以上细胞处于G0/G1期.表面抗原检测绝大多数细胞阳性表达波形蛋白(vimentin)和纤维连接蛋白(fibronectin),几乎不表达CD34.在体外能够向成骨细胞分化.结论 原代分离、培养的细胞为MMSCs,细胞纯度高、扩增迅速、生物学性状稳定,可为组织工程提供比较理想的种子细胞.     

血清饥饿对原代人脐静脉内皮细胞周期同步化的影响

目的探讨人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）的最佳饥饿条件,以建立高效稳定的 HUVECs体外分离提取方法,并为HUVECs相关实验提供研究基础。方法用0.1%Ⅱ型胶原酶灌注脐静脉腔消化15 min,收集 细胞并用内皮细胞专用培养基（含5%内皮细胞基础培养基、1%内皮细胞生长因子、1%青链霉素）,置37 ℃,5% CO2培养箱培 养。在倒置显微镜下观察细胞形态特点,并用细胞免疫荧光方法对所得细胞进行鉴定。用流式细胞术检测所得HUVECs的纯 度,并检测0%、0.1%、0.5%、1%血清浓度的培养基饥饿处理0、6、12、18、24 h对细胞周期的影响。结果0.1%Ⅱ型胶原酶消化可 以得到HUVECs,细胞培养呈典型的铺卵石状排列,细胞较密处呈涡旋状排列。免疫荧光检测细胞VIII因子相关抗原表达呈阳 性。流式检测细胞纯度高达99.67%。不同血清浓度培养基培养6 h可获得70%左右的G0/G1期细胞;培养12 h可获得80%~90% 的G0/G1期细胞;培养18、24 h 可获得95%左右的G0/G1期细胞。结论0.1%Ⅱ型胶原酶充盈静脉管腔可以获得高纯度的原代 HUVECs。完全无血清培养基培养12 h即可获得纯度超过80%的G0/G1期HUVECs。     

视网膜Müller细胞条件培养基及抗VEGF对血管内皮细胞的作用

目的：观察高糖条件下制备的视网膜Müller细胞条件培养基（HGMCM）及抗VEGF对血管内皮细胞的作用。 方法：采用免疫荧光、流式细胞术和Boyden小室迁移实验观察HGMCM,含wortmannin及含VEGF单克隆抗体HGMCM对血管内皮细胞的作用。 结果：HGMCM可促进体外培养的血管内皮细胞的增殖和迁移（142.00±15.32/视野）,wortmannin、VEGF单克隆抗体可明显抑制HGMCM诱导的血管内皮细胞的增殖和迁移（89.00±9.28/视野,93.00±9.64/视野）,使血管内皮细胞被阻滞于G₁/S转变期,含wortmennin和VEGF单克隆抗体HGMCM组与HGMCM组比较,差异均有显著性（P<0.01）。 结论：HGMCM诱导血管内皮细胞的增殖和迁移一部分是通过VEGF发挥作用的,拮抗VEGF的活性可抑制血管内皮细胞的增殖和迁移,进而抑制新生血管形成。     

人脐静脉内皮细胞分离、培养及鉴定

目的：寻求一种简单、实用的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分离及培养方法。方法：在传统HUVECs分离、培养的基础上,进行实验方法的改进,用Ⅰ型胶原酶分离HUVECs;通过倒置显微镜观察HUVECs生长情况,最后使用Ⅷ因子免疫荧光及摄取Dil-Ac-LDL实验鉴定HUVECs,采用流式细胞术检测HUVECs纯度。结果：改进实验工序和精化实验操作后,HUVECs分离不受影响,原代HUVECs3～4d后融合,传代后2～3d融合,倒置显微镜下见细胞呈＂铺路石＂状,有接触性抑制现象,Ⅷ因子及摄取Dil-Ac-LDL实验呈阳性,流式细胞术检查细胞纯度达92.9%。结论：本培养方法操作简便,培养周期短,获得的HUVECs纯度较高,有助于体外研究血管内皮细胞模型的构建。     

原代人脐静脉内皮细胞培养方法经验总结

目的 建立分离培养原代人脐静脉内皮细胞的方法。方法 采用0.125%胰酶+0.01%乙二胺四乙酸(EDTA)消化液灌注法,获得原代人脐静脉内皮细胞,用免疫组织化学方法进行细胞鉴定。结果 原代培养的脐静脉内皮细胞呈典型的铺路石样排列;细胞鉴定可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。结论 0.125%胰酶+0.01%EDTA消化法能够获取大量且纯度高的原代人脐静脉内皮细胞,为体外实验提供可靠的细胞模型。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的分离、培养原代脑微血管内皮细胞,建立体外血脑屏障模型。同时探索高纯度、活性好的脑微血管内皮细胞的分离培养方法。方法取3周大鼠大脑,分离皮质,经过匀浆、葡聚糖离心以及消化后,取纯度较高的脑微血管段种植于胶原蛋白包被过的塑料培养瓶中进行培养。显微镜观察及检测Ⅷ因子相关抗原。结果镜下细胞呈长梭形,7d左右细胞可融合,Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测为阳性,且阳性细胞占绝大部分。结论本实验成功分离大鼠脑微血管内皮细胞,并进行原代培养,为脑微血管内皮细胞的进一步研究提供了模型,也为构建更高级的大鼠体外血脑屏障奠定基础。     

胃癌侧群细胞检测分选及其增殖能力的初步分析

 目的 检测和分选胃癌细胞系中的侧群细胞（side population,SP）,并对其体外增殖能力进行初步分析。方法 选择3株不同分化程度的人胃癌细胞系MKN-28、SGC-7901、BGC-823,以Hoechst 33342 / 碘化丙啶（propidium iodidc,PI）荧光染料双染,维拉帕米拮抗对照,应用流式细胞仪荧光激活分选法检测SP细胞比例;通过细胞生长曲线（CCK-8法）对SP细胞体外增殖能力进行初步分析。结果 3株胃癌细胞中均存在含量极少的SP细胞,比例在0.8%～2.7%之间;SP细胞比例随着胃癌细胞分化程度降低而下降（2.20% vs 1. 57% vs 0.93%, P=0.023）人胃癌细胞系MKN-28来源的SP细胞体外培养1周、2周后的增殖倍数分别为22.67和290,明显高于非SP细胞培养后的13.68和124。细胞生长曲线显示,SP细胞体外增殖能力明显强于non-SP细胞及未经分选的MKN-28细胞（P=0. 044）。结论 胃癌细胞系中存在比例相对稳定的SP细胞,SP细胞比例随着胃癌细胞分化程度增高而上升。胃癌SP细胞体外增殖能力明显高于非SP细胞。