芹菜素逆转肺癌A549/DDP细胞耐药及机制

目的：研究芹菜素对肺癌A549/DDP细胞的作用,探讨芹菜素逆转肺癌耐药的作用及机制。方法：体外培养肿瘤细胞,以不同浓度芹菜素作用为实验组,用MTT法检测A549/DDP细胞增殖和分析药物敏感性,用Rhodamine-123潴留实验检测A549/DDP细胞内药物外排情况,用Western blot法检测肿瘤细胞内P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp)和肺耐药蛋白(lung resistance-related protein,LRP)表达情况,用RT-PCR法检测肿瘤细胞内多药耐药基因（multidrug resistance gene l,MDR1）mRNA和LRP mRNA的转录情况。结果：与DDP组相比,20、40、80 μmol/L的芹菜素明显抑制了A549/DDP细胞生长增殖（P＜0.05）。DDP对A549/DDP细胞的IC50为(14.33±0.41) μg/mL,在芹菜素作用下其IC50降为(5.76±0.36) μg/mL,逆转倍数为2.48,两者相比有统计学差异（P＜0.05）。芹菜素作用下,A549/DDP细胞内的Rhodamine-123蓄积增加,细胞内P-gp表达减弱,MDR1 mRNA转录水平下降,对LRP表达及LRP mRNA转录无明显改变。结论：芹菜素对A549/DDP细胞生长有抑制作用;芹菜素还具有逆转A549/DDP细胞肿瘤耐药的功能,其机制与降低MDR1 mRNA转录和下调P-gp介导的药物外转功能有关。     

染料木素对非小细胞肺癌A549/DDP细胞的耐药逆转及其机制

目的:探讨染料木素(genistein)对非小细胞肺癌A549/DDP细胞的耐药逆转及对肺耐药相关蛋白(LRP)和多药耐药相关蛋白(MRP)表达的影响。方法:采用细胞计数法绘制A549/DDP及A549细胞生长曲线;MTT法测定12.5μg/ml染料木素预处理对A549/DDP细胞耐药的逆转作用,并在荧光显微镜下观察细胞形态变化;用RT-PCR和Western blotting分别检测染料木素对肿瘤细胞LRP和MRP的mRNA及蛋白表达的影响。结果:A549/DDP和A549细胞生长曲线相似,倍增时间分别为(27.38±0.25)h和(18.15±0.36)h;染料木素预处理后耐药倍数从2.28倍下降至1.57倍;镜下观察细胞形态出现体积过大、伪足过度伸展、细胞边缘模糊等变化;LRP及MRP mRNA表达均出现明显下调(P<0.05),但二者蛋白表达无明显改变。结论:A549/DDP细胞基本保留了亲代细胞的生长特性;染料木素可以逆转A549/DDP细胞的耐药性,作用机制可能与下调LRP及MRP mRNA表达有关。     

人参皂甙Rg3对耐顺铂人肺腺癌细胞系A549DDP逆转作用及其机理的研究

目的探讨人参皂甙Rg3对耐顺铂(CDDP)人肺腺癌细胞系A549DDP的逆转作用及其机理.方法以A549DDP及其亲本细胞A549为研究对象,MTT法观察Rg3对A549DDP耐药的逆转作用,采用免疫组化及RT-PCR方法分别在蛋白质和mRNA水平检测耐药相关蛋白MDR1、MRP、LRP表达.结果 MTT法显示低细胞毒浓度Rg3(10 μmol)有效逆转A549DDP细胞耐药7.3倍,而20、30 μmol Rg3分别逆转耐药1.3、1.2倍;10 μmol Rg3预处理A549DDP细胞12、24、36及48 h后分别逆转耐药1.0、1.6、7.6及10.4倍,表明Rg3逆转耐药呈时间依赖性.免疫组化和RT-PCR显示:A549DDP细胞MDR1、MRP、LRP呈过量表达,以Rg3(10 μmol)预处理A549DDP 12、24、36及48 h后,MDR1、MRP表达减弱,呈时间依赖性,而LRP表达无明显时间依赖性.结论 Rg3具有中度逆转肿瘤耐药作用,并呈时间依赖性.     

金复康口服液对耐药人肺腺癌A549/DDP膜转运蛋白LRP MRPmRNA表达的影响

目的:从逆转多药耐药的角度,研究金复康口服液对耐药人肺腺癌细胞A549/DDP的化疗增效的作用和分子机制。方法:应用血清药理学方法,选择A549、A549/DDP细胞,实验分为实验组和空白对照组,从细胞水平、分子水平进行研究。结果:金复康口服液低剂量能够逆转A549/DDP对DDP的耐药,逆转耐药倍数为3.45倍,与DDP(320μmol/L)合用,使DDP(320μmol/L)对A549/DDP细胞的抑制率由47.55%升高为73.32%,且q>1.15,表明金复康口服液与DDP合用有明显的协同增效作用,增加了DDP对A549/DDP细胞的敏感度;金复康口服液低剂量能够降低A549/DDP膜转运蛋白LRP、MRP的mRNA表达。结论:(1)低剂量金复康口服液与DDP合用能够增加DDP对A549/DDP的增殖抑制作用,二者具有显著的协同增效作用。(2)金复康口服液能够降低A549/DDP膜转运蛋白LRP、MRP的mRNA表达。金复康口服液可能通过降低耐药肿瘤细胞膜转运蛋白的表达而逆转肿瘤多药耐药,为扶正方药对化疗增效机理提供了新的实验依据。     

川芎嗪对人非小细胞肺癌耐药细胞株A549/DDP的相关ATP结合盒转运体表达水平的影响

目的：观察川芎嗪（四甲基吡嗪）对耐药相关ATP结合盒转运体B1(ABCB1)、C1(ABCC1)和G2(ABCG2)表达水平的影响，揭示其逆转人非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP耐药的机制。方法：采用细胞增殖（CCK8）实验，分析人肺腺癌细胞株A549及顺铂耐药株A549/DDP对顺铂的耐受性，计算耐药指数。分析A549/DDP对川芎嗪的耐受性，遴选逆转耐药所需的工作浓度并检测逆转效果。设置空白组接种A549细胞，模型组、实验组和阳性对照组均接种A549/DDP细胞；空白组和模型组均用1640完全培养基孵育，实验组用含工作浓度川芎嗪的1640完全培养基孵育，阳性对照组用含Tariquidar的1640完全培养基孵育。提取各组全部蛋白及mRNA，用免疫印迹法（Western Blot）和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分析川芎嗪对ABCB1、ABCC1和ABCG2及其m RNA表达水平的影响。结果：A549细胞对顺铂的半数抑制浓度（IC50）为（28.33±3.19）μM,A549/DDP对顺铂的IC50为（983.43±101.67）μM,A549/DDP的耐药指数为34....     

CA916798基因通过PI3K/AKT通路参与肺癌顺铂耐药

目的在前期体外研究的基础上,建立裸鼠移植瘤模型,观察阻断PI3K/AKT通路对肺腺癌细胞A549及多药耐药肺腺癌细胞A549/CDDP内CA916798基因mRNA表达的影响。方法建立A549、A549/CDDP裸鼠移植瘤模型,以LY294002作用A549组和A549/CDDP组后,比较各组移植瘤生长情况,HE染色观察组织结构变化,实时荧光定量PCR检测肿瘤细胞中CA916798基因mRNA的表达水平。结果成功建立裸鼠移植瘤模型,以LY294002分别阻断A549、A549/CDDP组裸鼠移植瘤细胞的PI3K/AKT通路后,移植瘤体积明显缩小,CA916798基因的表达明显下调(P<0.05)。结论抑制PI3K/AKT通路能够明显抑制肺腺癌细胞A549及A549/CDDP的恶性增殖。     

利福霉素逆转多药耐药细胞系A549/ADM的实验研究

目的:探讨利福霉素逆转人肺腺癌细胞多药耐药的发生及逆转机制.方法:采用流式细胞仪检测敏感细胞系、耐药细胞系的P糖蛋白(P-gp)和多药耐药相关蛋白(MRP)表达;MTT法检测其对多种化疗药物的耐药程度及利福霉素对其耐药的逆转效果;采用细胞内阿霉素含量的方法测定利福霉素对多药耐药的逆转作用.结果:多药耐药细胞系A549/ADM的P-gp、 MRP表达分别为74.8%和61.2%;加用利福霉素后,A549/ADM细胞内ADM的含量显著增加,A549/ADM对ADM敏感性增加了2.51倍,对VCR、DDP及VP-16敏感性分别增加7.38倍、1.29倍、2.86倍.结论:A549/ADM对多种常见肿瘤化疗药物表现不同程度耐药,其耐药性可能与P-gp、MRP高表达有关;利福霉素对A549/ADM的多药耐药有一定的逆转作用.     

小分子 NEK2 干扰 RNA 对肺癌细胞耐药的研 究简

目的 探讨小分子NEK2干扰RNA （siRNA-NEK2）逆转人肺癌耐药细胞（A549/DDP）耐药性的研究.方法 应用Real-time PCR法及Western blot法验证NEK2基因在人肺腺癌耐药细胞系（A549/DDP）细胞系呈现高表达;并采用脂质体为转染介质,将NEK2小片段RNA导入A549/DDP细胞沉默NEK2基因;应用MTT法观察顺铂、阿霉素对沉默NEK2基因后的A549/DDP细胞的细胞毒活性变化.结果 NEK2-mRNA、NEK2蛋白在A549/DDP细胞系表达水平均显著高于A549细胞系,差异有统计学意义（P＜0.05）;顺铂、阿霉素对A549/DDP细胞的半数抑制浓度（IC50）分别是（53.08±0.56）、（8.09±0.31） μg/mL,对siRNA-control A549/DDP细胞的IC50分别是（53.09±0.78）、（8.10±0.98） μg/mL,而对siRNA-NEK2 A549/DDP细胞的1C50有显著下降,其值分别是（18.59±0.10）、（2.30±0.14） μg/mL,两组比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 小分子NEK2干扰RNA沉默NEK2可以提高耐药的肺癌细胞对化疗药物的敏感性.NEK2可能成为逆转肺癌耐药的一个新的靶点.     

CIK逆转耐顺铂人肺腺癌细胞对顺铂耐药与ERCC1的相关性

目的观察脐血来源的CIK细胞对A549/DDP细胞的耐药逆转作用。并探讨CIK逆转耐药机制是否与核苷酸切除修复交叉互补基因1（excision repair cross complementation group 1,ERCC1）的表达存在相关性。方法采集脐血单个核细胞经细胞因子体外诱导获得CIK细胞（cytokine induced killer cells,CIK）,MTT法检测顺铂（cisplatin,DDP）对A549细胞和A549/DDP细胞的体外杀伤作用,以及CIK细胞与A549/DDP细胞共培养前后对DDP敏感性的变化。Real-time RT-PCR法检测A549细胞、A549/DDP细胞以及CIK干预后的A549/DDP细胞中ERCC1 mRNA的表达情况。Western blot法检测A549细胞、A549/DDP细胞以及CIK干预后的A549/DDP细胞中ERCC1蛋白的表达情况。结果 A549/DDP细胞对DDP耐药,耐药指数为2.391。CIK细胞能逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性,逆转倍数为3.967。Real-time RT-PCR、Western blot测得A549/DDP细胞中ERCC1 mRNA和蛋白表达量比A549细胞高（P〈0.05）,CIK细胞共培养前后A549/DDP细胞中ERCC1 mRNA和蛋白表达量无明显变化。结论 CIK细胞能逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性,其逆转耐药的机制与ERCC1的表达无明显相关性。     

参慈胶囊影响人肺腺癌A549/DDP裸鼠体内多药耐药DNA损伤修复的研究

目的探讨参慈胶囊对人肺腺癌A549/DDP裸鼠体内多药耐药的影响。方法将40只C57BL/6小鼠接种人肺腺癌A549/DDP细胞悬液建立实体瘤模型，随机分为参慈胶囊组、参慈胶囊+顺铂组、顺铂组、对照组。对照组予等量生理盐水，其余各组荷瘤小鼠均用药21d，采用FQ-PCR技术检测人肺腺癌A549/DDP肺癌组织ERCC1mRNA、RRM1mRNA、hMLH1mRNA、BRCA1mRNA的表达情况。结果参慈胶囊能够降低ERCC1、RRM1、BRCA1基因的表达，且能够增加hMLH1mRNA基因的表达。结论通过多基因调节以改善人肺腺癌A549/DDP裸鼠体内顺铂耐药状态，可能是参慈胶囊逆转肺癌多药耐药的途径之一。     

三氧化二砷逆转肺癌细胞株耐药的实验研究

目的：观察三氧化二砷（As2O3）与肺腺癌细胞株HTB-56、相应耐药细胞株HTB-56／DDP共孵育有无诱导细胞凋亡以及逆转耐药作用。方法：采用人肺腺癌细胞株HTB-56、HTB-56／DDP作为实验细胞，以As2O3和顺铂（DDP）作干预，用MTT法检测As2O3单独和与DDP共孵育后细胞的生长抑制率得半数抑制浓度得出抗药倍数；以电镜观察干预后细胞凋亡情况。结果：不同浓度As2O3作用相同时间或相同浓度作用不同时间对HTB-56、HTB-56／DDP的细胞抑制率有明显差异（P〈0．05）；HTB-56／DDP细胞株与HTB-56细胞株相比，对顺铂的抗性倍数为14．65倍；而与As2O3共孵育对DDP的抗药倍数则为6．35，逆转倍数约为3．5，As2O3对其有增敏及逆转耐药作用和诱导细胞凋亡。结论：As2O3有明显抗肿瘤作用，能增强肺癌耐药细胞株对DDP的敏感性，对逆转耐药有一定的作用。     

高温对人肺腺癌耐药细胞株A549／DDP放射增敏作用研究

目的观察高温对人肺腺癌耐药细胞株A549／DDP的放射增敏作用并探讨其机制,为临床上联合应用热放疗治疗非小细胞肺癌提供理论依据。方法流式细胞仪检测热疗或热放疗作用后A549／DDP细胞周期的改变,原位末端转移酶标记术（TUNEL）法和流式细胞仪检测热放疗对A549／DDP细胞凋亡的作用;应用蛋白芯片结合表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（SEL-DI—TOF—MS）技术分析各组A549／DDP细胞蛋白质图谱的差异。结果流式细胞仪显示热疗后G2～M期细胞明显增多,Go～G2期细胞明显减少;TUNEL法和流式细胞仪观察到热放疗有诱导A549／DDP细胞凋亡作用;SELDI—TOF-MS技术分析热放疗组中质荷比分别为3974Da,4288Da,4680Da的3种蛋白质表达增高,质荷比为3270Da的蛋白质表达降低;热疗组质荷比分别为4288Da,4680Da的蛋白质表达增高,而质荷比为8941Da的蛋白质表达降低;放疗组只有质荷比4680Da的蛋白质表达增高。结论热疗可能通过影响细胞蛋白质表达,诱导细胞停滞于对放射线敏感的G2～M期,从而诱导细胞凋亡,增加放射敏感性。     

人肺腺癌亲代与耐顺铂细胞系耐药与凋亡相关基因表达差异及其相关性

目的 探讨人肺腺癌亲代与耐顺铂细胞系A549和A549^DDP耐药及凋亡相关基因表达的差异，以及多药耐药的发病机制。方法 采用逆转录-PCR及免疫细胞化学方法检测A549和A549^DDP细胞多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药蛋白(LRP)、bcl-2及C-erbB-2的表达水平。结果 逆转录-PCR结果显示：A549细胞表达MRP、bcl-2及C-erbB-2mRNA，无LRP mRNA表达，A549^DDP细胞亦表达MRP、bcl-2及C-erbB-2mRNA，且表达LRP mRNA，耐药细胞MRP及C-erbB-2mRNA表达水平较亲代显增高，bcl-2mRNA表达水平与亲代无显性差异(P=0．731)；A549^DDP细胞血管生成因子及耐药相关基因mRNA表达水平较A549细胞显增高，差异有显性(P=0．007)。免疫细胞化学结果显示：亲代和耐药细胞bcl-2蛋白表达呈强阳性，亲代C-erbB-2及LRP呈阴性，MRP轻度阳性，耐药细胞MRP蛋白呈中度阳性，C-erbB-2及LRP轻度阳性。结论 A549细胞的原发耐药与耐药及凋亡相关基因MRP、C-erbB-2和Bcl-2的异常表达和协同作用有关。A549^DDP细胞MRP和C-erbB-2的表达增强，且表达LRP，可能是继发耐药的产生机制。     

去甲斑蝥酸钠对耐顺铂肺腺癌A549／DDP细胞逆转的分子机制

目的探讨去甲斑蝥酸钠（SNCTD）对耐顺铂人肺腺癌细胞系A549／DDP的逆转作用及可能分子机制。方法（1）采用CCK法筛选出SNCTD对A549／DDP的无毒浓度（即对细胞抑制率〈10％的药物浓度）,并检测出顺铂及与无毒浓度SNCTD联合对耐药细胞株的半数抑制浓度（IC50）;（2）采用流式细胞仪分别检测1、2倍无毒浓度SNCTD对细胞内罗丹明123的蓄积情况;（3）采用逆转录-多聚酶链反应（RT—PCR）检测1、2倍无毒浓度SNCTD处理细胞48h后耐药相关基因mdr1mRNA、MRP1mRNA、GST—PimRNA表达,并检测药物处理72h后GST—PimRNA的表达。结果（1）SNCTD对A549／DDP的无毒浓度为5μg／ml,无毒浓度SNCTD与顺铂联合应用可使A549／DDP细胞对顺铂的IC50值下降为4．32μg／ml,逆转倍数为1．97倍;（2）无毒浓度SNCTD处理耐药细胞48h后细胞内罗丹明123荧光强度明显增强（P〈0．05）;（3）5、10μg／ml SNCTD处理耐药细胞株48h后mdr1 mRNA、MRP1 mRNA表达均明显减弱（P〈0．05）,而且10μg／ml SNCTD处理组减弱强度亦明显大干5μg／mlSNCTD处理组（P〈0.05）,呈现浓度依赖性;而GST—PimRNA表达并无明显变化（P〉0．05）,72h后GST—PimRNA表达也未出现下降（P〉0．05）。结论SNCTD可以逆转A549／DDP细胞的耐药作用。其作用机制可能与下调耐药相关基因mdr1、MRP1的表达,影响膜蛋白外排泵功能有关。     

三氧化二砷对鼠肝癌VEGF及COX-2表达影响的研究

目的 研究三氧化二砷(As2O3)对HepA小鼠肝癌血管内皮生长因子(VEGF)及环氧合酶-2(COX-2)表达的影响.方法 建立皮下种植肝癌小鼠模型,用药后观察小鼠肿瘤体积变化及抑瘤率;利用免疫组化观察移植瘤中VEGF及COX-2.结摹三氧化二砷对小鼠肝癌瘤体体积和抑瘤率均具有抑制作用;三氧化二砷降低了VEGF及COX-2的表达,与未用药对照组相比均差异有统计学意义(P<0.05).结论三氧化二砷能缩小肿瘤体积、增加抑瘤率,并能降低VEGF及COX-2的表达.     

三氧化二砷联合全反式维甲酸对小鼠肝癌细胞H22及移植瘤的抑制作用

目的探讨三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)联合全反式维甲酸(all trans retinoic acid,ATRA)在体内和体外对小鼠肝癌H22细胞的抑制作用.方法建立小鼠肝癌H22移植瘤模型,观察As2O3联合ATRA的体内抑瘤作用;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)方法测定As2O3联合ATRA在体外对小鼠肝癌H22细胞株的生长抑制作用.结果 As2O3联合ATRA在体外能明显抑制H22细胞的生长和增殖,抑制率为52.24%;在体内对H22小鼠的肿瘤体积、重量均有明显的抑制作用,抑制率分别为66.25%、62.07%.结论 As2O3和ATRA在体内和体外对H22肿瘤细胞的生长均有抑制作用,联合应用作用加强,有协同作用.     

三氧化二砷对裸鼠人乳腺癌移植瘤的作用及机制

目的探讨三氧化二砷（As2O3）对乳腺癌移植瘤的作用及其机制。方法建立BALB／C—nu／nu裸鼠ER阴性MDA—MB-435s人乳腺癌移植瘤模型,分别以不同浓度的As2O3、顺铂和生理盐水（NS）腹腔内注射,观察移植瘤的瘤重及抑瘤率。并用免疫组化检测乳腺癌石蜡标本中PTEN和Caspase-7的表达。结果As2O3高剂量组、As2O3低剂量组、顺铂组均能明显抑制裸鼠皮下肿瘤的生长,抑瘤率分别为48．68％、32．80％、66．67％。用药后移植瘤组织中PTEN和Caspase-7蛋白阳性细胞数显著增多（P〈0．05）。结论As2O3能明显抑制乳腺癌移植瘤的生长,其作用机制可能是通过上调PTEN和Caspase-7的表达,促进细胞的凋亡来抑制人乳腺癌细胞的生长。     

格列卫联合三氧化二砷对K562细胞Caspase-3和Bcl-xL mRNA表达影响的研究

目的探讨格列卫（STI571）单独应用及其与三氧化二砷（As2O3）联合应用对K562细胞增殖、凋亡及凋亡相关因子Caspase-3和Bcl-xL mRNA表达的影响。方法将K562细胞分为3组：对照组为未用药物处理的K562悬浮培养组;实验1组为单用1μmol/LSTI571处理组,实验2组为1μmol/L STI571与2μmol/L As2O3处理组。采用实时荧光定量PCR检测K562细胞Caspase-3、Bcl-xL mRNA的表达,比较不同条件下Caspase-3、Bcl-xLmR-NA表达的变化。结果与对照组相比,实验1组、实验2组Bcl-xL mRNA的表达减少,且减少程度实验2组〉实验1组（P〈0.05）;与对照组相比,实验1组、实验2组Caspase-3 mRNA的表达增强,且增强程度实验2组〉实验1组（P〈0.05）。结论两药联用后Caspase-3 mRNA的表达较STI571单独应用时增强而Bcl-xL mRNA的表达减弱;影响凋亡相关因子Caspase-3、Bcl-xL mRNA的表达,可能为As2O3与STI571联合抗白血病细胞产生协同作用的分子机制之一。     

五氧化二砷对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响

目的 评估五氧化二砷(As_2O_5)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖及凋亡的影响,比较As_2O_5和三氧化二砷(As_2O_3)影响HUVEC增殖的差异.方法 以不同浓度As_2O_5和As_2O_3作用于指数生长期的3～5代HUVEC,采用3-(4,5-二甲基)-二苯基四氮唑溴盐法(MTT)检测HUVEC存活情况,相差显微镜观察和Annexin V/PI双染法流式细胞仪观察HUVEC凋亡情况.结果 MTT检测结果显示,0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L As_2O_5作用48 h下HUVEC存活率分别为(72.5±13.8)%、(52.9±6.2)%、(15.0 ± 12.8)%、 (13.8 ± 13.2)%,其中1.0(P=0.006)、5.0(P=0.007)和10.0mg/L(P=0.008)作用组的HUVEC存活率明显低于对照组,但5.0与10.0mg/L组间差异无统计学意义(P=0.119);在1.0 mg/L As_2O_5作用下,24、48、72、96 h时HUVEC存活率分别为(88.4 ± 6.3)%、(53.1 ±8.8)%、(30.7 ± 7.9)%、(16.3 ± 4.6)%,其中48(P=0.042)、72(P=0.025)和96 h(P=0.012)时间组的HU-VEC存活率明显低于对照组.相差显微镜和Annexin V/PI双染法观测结果显示,As_2O_5可诱导HUVEC凋亡.培养48 h时,As_2O_5和As_2O_5对HUVEC的IC_(50)值分别为1.1和0.3 mg/L.结论 As_2O_5可抑制HUVEC增殖,起效浓度为1 mg/L.As_2O_5导致HUVEC死亡的主要方式是细胞凋亡.As_2O_5对HUVEC增殖的抑制作用弱于As_2O_3.