N-甲基化嘌呤-DNA-糖基化酶在肺癌H446多药耐药细胞中的表达

目的本研究旨在观察N-甲基化嘌呤-DNA-糖基化酶在小细胞肺癌多药耐药细胞系H446/CDDP中的表达情况。方法以本所前期诱导成功的小细胞肺癌多药耐药细胞系H446/CDDP为研究对象,H446亲代细胞为对照,采用半定量RT-PCR法检测MPG基因mRNA的转录水平,免疫细胞化学法检测其蛋白表达。结果半定量RT-PCR显示,H446细胞MPG基因mRNA的转录量为0.19±0.15,H446/CDDP细胞为0.75±0.08;免疫细胞化学显示,H446/CDDP、H446细胞MPG蛋白表达呈阳性,均表达于细胞核。结论MPG的高表达可能同人小细胞肺癌多药耐药的产生有关。     

miR-135a/b逆转肺癌A549/CDDP细胞对顺铂耐药性及相关机制研究

目的:研究miR-135a/b对肺癌耐顺铂细胞株A549/CDDP顺铂耐药的影响?方法:运用实时荧光定量PCR检测miR-135a/b在A549和A549/CDDP 细胞株中的差异表达;MTT法检测转染后A549及A549/CDDP细胞对CDDP的敏感性;构建MCL1-3′-UTR荧光素酶报告质粒验证miR-135a/b的靶基因;Western blot检测转染前后细胞MCL1蛋白的表达差异;流式细胞术检测转染后耐药细胞对顺铂诱导凋亡的影响?结果:miR-135a/b在A549/CDDP细胞中表达量降低;在耐药株中上调miR-135a/b后显著增加细胞对顺铂的敏感性;荧光素酶实验证实MCL1是miR-135a/b的靶基因;抗凋亡蛋白MCL1在A549/CDDP细胞中呈高表达,上调miR-135a/b明显抑制耐药细胞中MCL1蛋白的表达;miR-135a/b显著增加A549/CDDP细胞对顺铂诱导的凋亡?结论:miR-135a/b通过靶向调控MCL1蛋白表达增加NSCLC细胞对顺铂的敏感性和凋亡?     

人小细胞肺癌多药耐药细胞差异表达基因的克隆研究

目的 构建小细胞肺癌多药耐药细胞(H446/CDDP)差异表达消减cDNA文库.方法 ①以H446/CDDPcDNA为实验方(Tester),小细胞肺癌细胞H446 cDNA为对照方(Driver),应用抑制消减杂交(SSH)技术结合T/A克隆技术构建小细胞肺癌多药耐药细胞差异表达消减cDNA文库.②通过斑点杂交筛选、测序及同源性分析获取H446/CDDP细胞差异表达cDNA片段.结果 成功构建了小细胞肺癌多药耐药细胞H446/CDDP差异表达消减cDNA文库,获得21个H446/CDDP细胞差异表达cDNA片段,经测序及同源性分析表明它们分别代表6个已知基因(同源性为96%～100%).结论 SSH技术是筛选新的功能基因的有效方法;获取的6个差异表达基因可能参与了小细胞肺癌多药耐药细胞H446/CDDP的耐药形成,进一步的功能研究有利于了解它们在小细胞肺癌多药耐药机制中所发挥的作用.     

CA916798基因通过PI3K/AKT/mTOR通路参与顺铂耐药的机制分析

摘要：目的观察阻断PI3K/AKT/mTOR通路对人肺腺癌细胞A549 及多药耐药人肺腺癌细胞A549/CDDP内CA916798 基因
mRNA表达的影响。方法以雷帕霉素、LY294002分别作用于人肺腺癌细胞A549和多药耐药人肺腺癌细胞A549/CDDP,检测
顺铂作用后细胞生长及增殖情况,RT-PCR 检测CA916798 基因mRNA表达水平。结果以雷帕霉素和LY294002 分别阻断
A549、A549/CDDP细胞的PI3K/AKT/mTOR通路后,细胞对于顺铂的耐药性均显著下降（P<0.05）,CA916798基因的表达均显
著下调（P<0.05）。结论CA916798基因位于PI3K/AKT/mTOR通路下游,可能是CA916798诱导肺癌顺铂耐药的机制之一。
     

外源性人分化抑制因子3在A549／DDP细胞中的表达及意义

目的:Id 蛋白即分化抑制因子(Id),在人类多种肿瘤中异常表达,并参与肿瘤细胞的增生、分化和凋亡等.文中旨在探讨人分化抑制因子3(Id3)基因体外转染在人肺腺癌细胞顺铂耐药株A549/DDP细胞中的表达及意义. 方法:构建人Id3基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)真核表达载体Id3/pEGFP,采用脂质体介导的转染技术将Id3融合基因(Id3-EGFP)导入A549/DDP细胞,激光共聚焦显微镜观察细胞内EGFP的表达情况;半定量RT-PCR检测Id3表达的改变;MTT法观察Id3对细胞的增殖抑制情况. 结果:成功构建人Id3/pEGFP真核表达载体并转染A549/DDP细胞,倒置荧光显微镜下转染的A549/DDP细胞发出强绿色荧光,转Id3/pEGFP质粒的细胞其荧光主要表达于细胞核;RT-PCR结果显示Id3 mRNA在转染后的A549/DDP细胞能有效表达;MTT法结果表明,与对照组相比,转染Id3重组质粒的细胞增殖被抑制. 结论:转染的Id3/pEGFP融合基因在A549/DDP细胞能有效表达,外源性Id3基因能抑制该细胞的增殖.     

Runx3基因对HepG2细胞顺铂耐药性的影响

目的探讨Runx3基因对HepG2细胞耐药性的影响及可能机制。方法取在1.6μg/ml顺铂(CDDP)下生长良好的HepG2耐药细胞(HepG2/CDDP-1.6),建立耐药HepG2/CDDP的动态变化模型HepG2/CDDP/2.0,并予以甲基转移酶抑制剂5-氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理;将Runx3-shRNA表达载体转染HepG2/CDDP-1.6细胞,RT-PCR检测处理及转染前后细胞Runx3 mRNA的表达。MTT法检测细胞的增殖活性,流式细胞仪分析细胞周期,Hoechst 33258检测凋亡,Western blot检测P-gp表达的变化。结果在动态变化模型中随CDDP诱导时间的延长,Runx3 mRNA的表达逐渐降低。5-Aza-CdR处理后Runx3 mRNA的表达增加,细胞生长受到明显抑制,S期细胞逐渐增加,凋亡细胞明显增多,细胞内P-gp的表达减少。转染Runx3-shRNA载体后HepG2/CDDP-1.6细胞对CDDP的耐受性增强,G1期细胞增加,P-gp的表达增加。结论 Runx3基因的表达可抑制HepG2/CDDP耐药的形成,提高HepG2/CDDP细胞对化疗药物的敏感性。     

miR-181a/b靶向抑制多种抗凋亡蛋白表达对肺癌细胞顺铂耐药的影响

目的:研究miR-181a/b在肺癌细胞顺铂耐药形成中的作用?方法:运用miRNA实时定量PCR方法检测miR-181a/b在肺癌顺铂耐药细胞A549/CDDP与母代A549细胞中的表达差异,运用Western blot检测A549/CDDP细胞与母代细胞抗凋亡蛋白BCL2?MCL1和XIAP的表达差异,分别构建BCL2?MCL1和XIAP的3′UTR荧光素酶报告质粒验证miR-181a/b的靶基因,在耐药细胞中瞬时转染miR-181a/b模拟物以检测上调miR-181a/b对A549/CDDP细胞中BCL2?MCL1和XIAP蛋白表达及耐药性的影响,并运用流式细胞术检测转染后耐药细胞对CDDP(Cisplatin,顺铂)诱导凋亡的影响?结果:在A549/CDDP细胞中miR-181a/b均呈低表达,而抗凋亡蛋白BCL2?MCL1和XIAP则呈高表达,荧光素酶报告实验证实BCL2?MCL1和XIAP是直接受miR-181a/b调控的靶基因,在耐药细胞中上调miR-181a/b显著抑制BCL2?MCL1和XIAP蛋白表达水平,显著增加耐药细胞对顺铂的敏感性,并显著增加耐药细胞对顺铂诱导的凋亡?结论:miR-181a/b靶向抑制多种抗凋亡蛋白表达可显著增加A549/CDDP细胞对顺铂的敏感性?     

放射诱导HSV-TK基因在肺癌细胞中靶向、高效性表达的研究

目的 构建放射诱导的同步放大基因电路,通过基因电路调控HSV-TK基因在肺癌细胞中靶向、高效性表达,以提高放射-基因治疗的有效性和靶向性.方法 利用分子克隆的方法将HSV-TK基因插入到同步放大基因电路载体的下游,并采用脂质体介导重组载体和对照载体转染肺癌细胞A549;G418筛选阳性克隆,转染细胞给予2Gy X线照射后,检测照射前后不同时相点细胞内TK表达情况,及不同浓度前药GCV对转染重组载体和对照载体的肺癌细胞的生长抑制率.结果 照射后转染同步放大重组载体的细胞内TK的表达明显强于对照组,且随时间的推移而逐渐增强,以照射后16h最为明显.同一浓度的GCV对转染同步放大载体的A549细胞的抑制率明显高于对照组和未转染组,IC50也明显低于对照组和未转染组.结论 同步放大基因电路明显增强了靶细胞内HSV-TK基因的表达,进一步完善了放射-基因治疗这一新的肿瘤治疗模式.     

miRNA765高表达对胃癌耐药细胞株BGC-823/CDDP耐药性的影响

目的 观察miRNA765高表达对胃癌顺铂(CDDP)耐药细胞株BGC-823/CDDP耐药性的影响.方法 将PCR扩增的包含miRNA765前体的基因序列克隆至真核表达载体,构建miRNA重组表达载体;阳离子脂质体转染重组质粒到BGC-823/CDDP细胞.转染后48 h,Real-Time PCR和Western blotting法分别检测细胞中miRNA765和细胞因子诱导的凋亡抑制因子1(CIAPIN1)蛋白的相对表达量;采用不同浓度CDDP处理转染后48 h的BGC-823/CDDP细胞,24和48 h后MTT法检测细胞活性并计算细胞对于CDDP的半抑制浓度(IC50).采用终质量浓度为1μg/mL的CDDP处理基因干预后的BGC-823/CDDP细胞,双染法检测细胞凋亡率.结果 BGC-823/CDDP细胞内miRNA765的相对表达量明显低于其亲本细胞BGC-823,CIAPIN1蛋白相对表达量则明显高于其亲本细胞株(均P＜0.01).在BGC-823/CDDP细胞内高表达miRNA765可明显抑制CIAPIN1蛋白的表达,转染后48 h的CIAPIN1蛋白表达量明显低于未转染组(P＜0.01);miRNA765高表达可明显降低BGC-823/CDDP细胞的耐药能力,48 h后IC50值从(18.27 ±3.92) μg/mL降至(1.50 ±0.43) μg/mL(P ＜0.05).转染48 h后,BGC-823/CDDP细胞的凋亡率从(10.1±1.7)％上升至(53.4±7.9)％(P＜0.01).结论 miRNA765高表达可以明显降低胃癌耐药细胞株BGC-823/CDDP的耐药能力.     

shRNA沉默TPX2基因对肺腺癌细胞A549紫杉醇敏感性的影响

目的观察靶向Xklp2靶蛋白(TPX2)-短发夹状RNA(shRNA)对肺腺癌A549细胞TPX2基因以及紫杉醇敏感性的影响。方法将靶向TPX2基因的片段插入载体后构建重组质粒,经Lipofectamine 2000将其导入A549细胞,并进行筛选及克隆化培养。细胞分3组培养:(1)转染组;(2)阴性对照组;(3)空白对照组。反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹法(Western Blot)分析转染前后TPX2基因的表达情况。MTT法检测转染干扰载体后A549细胞对紫杉醇化疗的敏感性变化。RT-PCR检测肺耐药蛋白(LRP)及多药耐药相关蛋白(MRP)mRNA表达水平的变化。结果与对照组相比,转染重组质粒后,TPX2基因的表达明显降低,MTT法显示转染TPX2-shRNA载体质粒的A549细胞对紫杉醇的敏感性明显增加;RT-PCR检测相关基因显示,LRP、MRP mRNA表达水平与空白对照组相比无明显改变(P>0.05)。结论 TPX2-shRNA干扰载体能有效抑制肺腺癌细胞系A549中TPX2基因的表达,并增强其对化疗药物的敏感性。     

人乙酰肝素酶稳定表达CHO细胞株的建立

目的 在CHO细胞中表达人乙酰肝素酶(HPA)并建立该酶的稳定表达细胞株.方法 在脂质体的介导下,用本实验室构建的pEGFP-N1-HPA重组质粒转染CHO细胞,经G418筛选稳定表达的细胞.通过荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达情况,同时通过RT-PCR检测HPA基因转录水平、免疫细胞化学法检测HPA蛋白表达、MTT方法测定外源基因对CHO细胞增殖的影响.结果 荧光显微镜下可见转染的CHO细胞有绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR证实转染细胞中存在HPA基因mRNA的表达,成功获得HPA的稳定表达细胞株.结论 成功建立人HPA稳定表达CHO细胞株,为该酶的功能研究奠定了基础.     

人PSCA真核表达载体的构建及表达

目的构建含有信号肽及FLAG标签的人前列腺干细胞抗原（PSCA）真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法通过PCR方法获得SIG-FLAG基因片段及人PSCA基因片段,插入到真核表达载体pIRES-neo中。构建的重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及RT-PCR方法检测其表达情况。结果PCR扩增出的SIG-FLAG及PSCA基因测序正确,酶切鉴定证明重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA构建成功;检测结果显示重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA在293T细胞中得到表达。结论成功构建了重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA,且在293T细胞中能有效表达,为后续转人PSCA基因细胞系的构建工作奠定了基础。     

Livin蛋白在肾癌中的表达及意义

目的观察凋亡蛋白抑制因子Livin在肾癌组织中的表达及其临床病理意义。方法采用免疫组化法检测54例肾癌中Livin蛋白的表达。结果Livin蛋白在肾组织中的阳性率明显低于肾癌组织。结论Livin蛋白表达增高与肾癌的临床分期、复发密切相关。检测Livin有助于提高肾癌侵袭转移能力的评估,并可作为判定肾癌生物学行为的客观指标。     

斑蝥酸钠对人肝癌细胞HepG2的增殖作用及血管内皮生长因子表达的影响

目的研究斑蝥酸钠对人肝癌细胞的增殖作用及其对血管内皮生长因子(VEGF)的表达的影响,探讨斑蝥酸钠抗肿瘤的作用机制。方法体外培养人肝癌细胞株(HepG2),用不同浓度的斑蝥酸钠作用于肝癌细胞,采用MTT法观察不同浓度和作用时间下斑蝥酸钠对细胞增殖的影响,采用免疫组化法检测血管内皮生长因子的表达情况。结果在一定浓度范围内斑蝥酸钠对肝癌细胞有明显增殖抑制作用,且降低了VEGF的分泌水平,并呈时间-剂量依赖关系。结论斑蝥酸钠对肝癌细胞的增殖有抑制作用,且减低了细胞内血管内皮生长因子蛋白的表达,表明斑蝥酸钠在抑制肝癌生长的作用机制之一是通过抑制肿瘤血管生成发挥作用的。     

RECK基因GFP融合蛋白表达载体的构建、鉴定及在脑胶质瘤细胞中的表达

目的:获得RECK基因GFP融合蛋白表达载体并使其在脑胶质瘤细胞SHG44中表达。方法:用基因克隆的方法构建RECK基因GFP融合蛋白表达载体,通过酶切和测序鉴定,用绿色荧光蛋白表达载体对RECK基因在人脑胶质瘤细胞SHG44中进行亚细胞定位。结果:所得RECK基因融合蛋白表达载体序列与预期相符。pEGFP-RECK表达质粒转染SHG44细胞后,荧光信号主要集中在与细胞质有关的部位。结论:成功构建了GFP-RECK融合蛋白表达质粒,这为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

人肝癌SMMC-7721细胞株部分线粒体基因表达的研究

目的:观察人肝癌SMMC-7721细胞株部分线粒体DNA(mtDNA)基因表达的情况.方法:根据人线粒体DNA(mtDNA)基因序列,利用primer premier 5.0生物软件设计了4对PCR引物,分别是扩增D-loop区、ND6、ATPase8-ATPase6、16sRNA基因,采用RT-PCR方法对SMMC-7721细胞线粒体DNA上D-loop区及其他3个基因的表达进行了检测,并与其在正常人肝细胞株(L02)线粒体中的表达作了比较.结果:我们发现,与正常人肝细胞株(L02)相比,在SMMC-7721细胞中,D-loop区、ND6、ATPase8-ATPase6基因表达总体是增高的,16sRNA基因表达基本不变,同时在同一基因两条链(重链和轻链)之间的表达也存在差异.结论:我们认为,由于线粒体DNA编码的多肽均是氧化磷酸化酶复合物的亚单位,这些基因表达的异常可能造成细胞对氧利用障碍,细胞能量产生减少,成为造成SMMC-7721细胞主要以糖酵解的方式提供能量的重要原因之一.     

人成骨肉瘤MG-63细胞分化特性及分化过程中的基因表达

观察人成骨肉瘤MG 6 3细胞分化特性及分化过程中的基因表达。在细胞培养的不同时间 ,用α 磷酸奈酚法测定碱性磷酸酶 (ALP)活性 ;放射免疫法测定骨钙素 (BGP)含量 ;半定量逆转录聚合酶链反应测I型胶原、基质金属蛋白酶 (MMP) 1和基质金属蛋白酶抑制因子 (TIMP) 1基因mRNA表达 ;VanGieSon氏苦味酸酸性复红染色法染色细胞I型胶原。结果表明MG 6 3细胞接种培养第 7d后I型胶原基因表达较高。MMP 1表达量随时间推移逐渐增加 ,至第 2 4d达到高峰。第 1～ 9dTIMP 1表达量逐渐增加 ,其后基本恒定。ALP活性第 0～ 12d逐渐增高 ,至第 12d达最高 ,其后逐渐下降。第 18d后 ,细胞有许多大小不等的结节形成 ,I型胶原结节染色较无结节处深。MG 6 3细胞具有成骨细胞表型特征。MG 6 3细胞生长分为细胞增殖、骨基质成熟、骨基质矿化阶段 ,且I型胶原 ,MMP 1,TIMP 1基因表达及ALP活性呈时间特异性。     

重组人促红细胞生成素cDNA在CHO-dhfr-细胞中的高效表达

目的：使重组人促红细胞生成素（ｒｈＥＰＯ）在ＣＨＯ细胞中获得高效表达。方法：利用基因重组构建了两个人促红细胞生成素ｃＤＮＡ重组表达质粒ｐＥＤ－ＥＰＯ和ｐＥＦ－ＥＰＯ，分别用ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，作瞬时高表达，选ｐＥＦ－ＥＰＯ用磷酸钙共沉淀法转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，加入氨甲喋呤（ＭＴＸ）扩增、选择，作稳定性高表达。结果：ｐＥＤ－ＥＰＯ和ｐＥＦ－ＥＰＯ转染ＣＯＳ７细胞后７２ｈ表达量分别为１７．８和２１．０ｎｇ／ｍｌ，ｐＥＦ－ＥＰＯ转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，随着ＭＴＸ浓度的增加，ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＋的克隆数减少，而混合克隆的ＥＰＯ表达量逐渐升高。筛选了一株稳定性高表达ｒｈＥＰＯ的细胞株，其３ｄ表达量为１６μｇ／ｍｌ。结论：ｒｈＥＰＯ在ＣＨＯ细胞中获得了高表达