热断层成像技术用于乳腺癌裸鼠模型实验初探

目的探讨热断层成像技术(TTM)应用于乳腺癌裸鼠模型扫描的可行性。方法采用既往实验中用逆转录病毒介导RNA干扰的方法,已构建的能不同程度抑制人的乳腺癌细胞MCF7中LRP16基因表达的两株细胞pL374/MCF7(抑制率90%)和对照细胞系pGFPi/MCF7(阴性);选取BALB/c雌性裸小鼠共20只,随机分为两组,10只/组。分别接种pL374/MCF7及对照细胞系pLGFPi/MCF7。接种细胞6周后,用TTM观察裸鼠成瘤情况。将20只裸鼠处死,解剖观察,取形成的小结节和相应的肺组织进行HE染色。结果TTM值异常升高的裸鼠有13只。11只裸鼠有≤3mm小结节。HE结果显示,以上11只裸鼠体内形成的小结节为阳性肿瘤组织,4只肺部组织显示有阳性肿瘤细胞。TTM值异常升高与HE染色阳性高度相关。结论TTM技术可能在肿瘤的动物模型研究中发挥一定的作用。     

白细胞介素-10对急性肺损伤炎症/抗炎介质表达的影响

目的探讨白细胞介素-10(IL—10)对急性肺损伤(ALI)大鼠炎症介质／抗炎介质表达的影响。方法向气道内滴注内毒素(LPS，10mg／kg)建立大鼠ALI模型。54只雄性SD大鼠随机分为对照组、LPS损伤组、LPS加IL-10组，每组18只，各组又分为2、6和24h3个亚组，每个亚组各6只。按各时间点观察大鼠动脉血氧分压(PaO2)、支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数及分类计数、肺系数、BALF总蛋白水平及肺病理，同时用逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)方法检测肺组织中炎症介质／抗炎介质的表达。结果①LPS损伤组大鼠PaO2呈进行性降低；肺系数、BALF总蛋白水平及BALF中细胞总数均明显增加，分类以中性粒细胞为主；肺病理示肺内中性粒细胞大量浸润，伴出血、透明膜形成。LPS加IL-10组的各项指标均较LPS损伤组减轻。②LPS损伤组肺组织肿瘤坏死因子-α(TNF—α)mRNA表达于2h达高峰，随后迅速下降；白细胞介素-1β(IL—1β)mRNA表达于2h显著升高，6h达高峰，随后迅速下降；IL-1受体拮抗剂(IL—1ra)mRNA表达6h开始升高，且为峰值。24h仍高于对照组。LPS加IL-10组肺组织TNF—αmRNA、IL-1βmRNA表达受抑，而IL—1ra mRNA表达不受影响。结论①ALI早期TNF—αmRNA、IL-1βmRNA表达明显增加，而IL—1ra mRNA表达滞后，提示在无外来干预情况下，ALI早期存在炎症介质／抗炎介质的失衡。②IL-10可明显抑制炎症介质表达，不影响抗炎介质表达，有利于重建炎症介质／抗炎介质平衡，减轻LPS所致ALI。     

人抗地高辛单链抗体在大肠杆菌的表达

目的：研究人抗地高辛（Dig）单链抗体（ADAscFv）在大肠杆菌（E．coli）的表达及包涵体变性和复性条件。方法：（1）用PCR扩增人ADAscFv基因，重组于克隆载体pGEM—T，NdeI＋Sail消化回收目的基因，插入pT7．7载体构建表达载体pT—ADAscFv，转化E．coliBL21（DE3），IPTG诱导表达，SDSPAGE分析目的蛋白的表达情况，筛选高表达克隆；（2）提取纯化包涵体，SDS-PAGE分析其纯度，采用不同的方法及条件进行变性及复性，ELISA检测活性。结果：（1）SDS＋PAGE显示，含有重组质粒pT-ADAscFv的E．coli菌株BL21（DE3）的表达产物中有一条约30kD的条带，其分子量与预期值相符，提取纯化的包涵体的纯度较高；（2）ELISA显示，透析复性法和稀释复性法均可使其复性。结论成功地构建了人ADAscFv表达载体，实现了其在E．coli的表达并对其包涵体变性、复性条件进行了研究，为制备适于临床上诊断及治疗Dig中毒的人源性单抗奠定了基础。     

端粒酶逆转录酶激活脐静脉内皮细胞端粒酶活性

目的　探讨外源性端粒酶逆转录酶 (hTERT)能否激活人脐静脉内皮细胞端粒酶活性 ,为建立体外人脐静脉内皮细胞系奠定基础。方法　用逆转录病毒转染法 ,将编码hTERT片段逆转录病毒载体与VSV G共转染 2 93 GP2 细胞 ,产生病毒上清液 ,感染原代分离的人脐静脉内皮细胞 (hUVEC) ,以嘌呤霉素筛选。观察细胞生长曲线、第Ⅷ因子、CD34、β 半乳糖苷酶染色、逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)等指标。 结果　细胞生长曲线显示培养至 30代的转染细胞生长速度基本与原代培养脐静脉内皮细胞一致但快于原代培养传至第 10代内皮细胞 ;RT PCR结果转染细胞有特异扩增 ;衰老指标 β 半乳糖苷酶染色显示转染后细胞胞浆内着染阳性细胞数明显少于第 10代内皮细胞。结论　外源性hTERT转入原代培养人脐静脉内皮细胞 ,可重现其端粒酶活性 ,从而阻止人脐静脉内皮细胞老化     

反义hTERT对胃癌细胞SGC7901 VEGF及其受体表达的影响

目的研究反义hTERT对胃癌细胞SGC7901 VEGF及其受体表达的影响,探讨其对肿瘤发展和转移的影响.方法以端粒酶逆转录酶组分hTERT cDNA为模板构建反义hTERT逆转录病毒表达载体,包装重组逆转录病毒后感染胃癌SGC7901细胞,用半定量RT-PCR检测基因转染前后VEGF-C及其受体Flt-4 mRNA表达水平的变化,免疫组化法检测VEGF-C、Flt-4蛋白表达.结果反义hTERT稳定转染后SGC7901细胞VEGF-C及其受体VEGFR-3（Flt-4） mRNA和蛋白表达均受到明显抑制.结论反义hTERT可有效抑制胃癌细胞VEGF-C及其受体Flt-4的表达,阻断肿瘤血管和淋巴途径转移.     

Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂RNA探针的构建及应用

组织型纤溶酶原激活物（ｔＰＡ）和尿激酶型纤溶酶原激活物（μＰＡ）可使纤溶酶原转变为纤溶酶,参与纤溶、炎症、细胞迁移、排卵、肿瘤浸润和转移等许多生理和病理过程。Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂（ＰＡＩ－１）是这两者主要的快速作用的抑制剂,它能抑制ＰＡ介导的纤溶活性,认为是体内最重要的纤溶活性调节者,因而肿瘤组织中ＰＡＩ河的表达特性备受关注［１、２］。已检测过胃癌、结肠癌、乳腺癌、子宫癌等多种肿瘤组织中的ＰＡＩ－１河的表达特性,在乳腺癌患者中已作为诊断与预后的指标［３、４］。以往研究多采用免疫组化或ＤＮＡ探…     

应用原位免疫聚合酶链反应检测活动性巨细胞病毒感染

目的建立一种新的诊断活动性巨细胞病毒感染的方法。方法应用原位免疫聚合酶链反应(PCR)技术检测早、中、晚期孕妇宫颈脱落细胞中巨细胞病毒抗原。结果119例受检标本中有16例出现人巨细胞病毒(HCMV)抗原阳性,孕早、中、晚期孕妇活动性HCMV感染率分别为：9.37%、11.90%、17.77%;检出的HCMV抗原阳性细胞数为2～38／5万宫颈脱落细胞,平均8.5／5万细胞。常规ABC法平行检测,原位免疫PCR法检测敏感性高于ABC法。结论原位免疫PCR方法敏感性高、特异性强,可检出微量HCMV抗原,为临床诊断活动性HCMV感染提供一种新方法。     

甲基化特异PCR方法对p16肿瘤抑制基因的研究

目的：研究肺癌、结肠癌组织中p16肿瘤抑制基因甲基化状态及其临床意义。方法：采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）方法,特异扩增分析甲基化和非甲基化两种状态。结果：p16基因在人胚肺组织处于非甲基化状态;在人肺巨细胞癌细胞系（PLA801-D）呈甲基化状态;在检测的肿瘤标本中,60%肺癌组织及70%结肠癌组织出现甲基化状态。结论：p16基因的甲基化状态是肺癌、结肠癌组织中p16基因异常形式之一,有可能成为肿瘤分子诊断的重要标志,MSP方法有临床普及应用前景。     

血小板因子4对人肺巨细胞癌细胞系尿激酶和其受体表达的影响

目的：探讨人血小板因子4（hPF4)抑制血管生成的作用机制。方法：构建含生长hPF4 cDNA重组真核表达载体pcDNA3-hPF4，将其转染到人肺巨细胞癌细胞系PLA801D细胞内，应用RT－PCR及免疫组化法观察肿瘤细胞自分泌的尿激酶（uPA)及其受（uPAR)等的mnRNA和蛋白表达水平的变化。结果：导入pcDNA3-hPF4,PLA801D细胞能稳定表达hPF4 mRNA，其uPA及uPAR的mRNA和蛋白表达水平均明显降低，表明hPF4可直接调控uPA及uPAR基因转录，影响其蛋白质生物合成，结论：hPF4可直接下调肿瘤细胞自分泌的uPA及uPAR 基因转录，抑制肿瘤细胞释放uPA及uPAR，是hPF4抗血管生成抑制肿瘤细胞生长的机制之一。     

缺血预处理对缺血再灌注后兔腰髓组织中HSPs-70 mRNA表达的影响

为研究缺血预处理对缺血再灌注后兔腰髓组织中HSPs-70mRNA表达的影响，探讨缺血预处理脊髓缺血再灌注损伤保护作用的机制，经股动脉向腹主动脉内置入4F Swan-Ganz导管，导管气囊置于左肾动脉开口远端,0.5-1.0cm，向气囊内注气建立脊髓缺血模型。将实验兔分为假手术组，对照组和预处理组，应用RT－PCR方法对3组兔缺血再灌注后不同时间点脊髓组织中HSPs-70mRNA表达进行观察。结果发现，假手术组兔的脊髓组织没有HSPs-70mRNA的阳性表达，缺血再灌注后，预处理组兔脊髓组织的HSPs-70mRNA表达较对照组明显增强（P＜0.01)，表达时间也显著延长。提示缺血预处理可以明显增强缺血后脊髓组织中HSPs-70mRNA的表达，延长HSPs-70mRNA的表达时间，并可能通过此机制对缺血脊髓产生保护作用。