Runx3 improves chemosensitivity of hepatocellular carcinoma cells HepG2 to cisplatin

目的 探讨Runx3基因对HepG2细胞耐药性的影响及可能机制.方法 取在1.6 μg/ml顺铂(CDDP)下生长良好的HepG2耐药细胞(HepG2/CDDP-1.6),建立耐药HepG2/CDDP的动态变化模型HepG2/CDDP/2.0,并予以甲基转移酶抑制剂5-氮-2 '-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理;将Runx3-shRNA表达载体转染HepG2/ CDDP-1.6细胞,RT-PCR检测处理及转染前后细胞Runx3 mRNA的表达.MTT法检测细胞的增殖活性,流式细胞仪分析细胞周期,Hoechst 33258检测凋亡,Western blot检测P-gp表达的变化.结果 在动态变化模型中随CDDP诱导时间的延长,Runx3 mRNA的表达逐渐降低.5-Aza-CdR处理后Runx3 mRNA的表达增加,细胞生长受到明显抑制,S期细胞逐渐增加,凋亡细胞明显增多,细胞内P-gp的表达减少.转染Runx3 -shRNA载体后HepG2/CDDP-1.6细胞对CDDP的耐受性增强,G1期细胞增加,P-gp的表达增加.结论 Runx3基因的表达可抑制HepG2/CDDP耐药的形成,提高HepG2/CDDP细胞对化疗药物的敏感性.     

抑癌基因Runx3增强顺铂致肝癌细胞的凋亡效应

目的:探讨腺病毒介导的Runx3基因(Ad-Runx3)与化疗药物顺铂(DDP)联合应用对肝癌细胞HLE增殖的抑制效果.方法:检测肝癌细胞HLE中Runx3基因启动子区域甲基化状态及表达情况.通过Ad-Runx3感染肝癌细胞HLE,利用RT-PCR方法检测Runx3基因在肝癌细胞中的转录,用Ad-Runx3联合化疗药物...     

Runx3基因启动子甲基化及其蛋白表达与喉癌的关系

目的探讨Runx3基因启动子甲基化状态及其蛋白表达与喉癌临床病理特征的关系。方法采用免疫组化SP法检测55例喉癌组织及癌旁正常黏膜组织中Runx3DNA的表达,并用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测Runx3基因启动子甲基化情况。结果55例喉癌组织标本中Runx3基因蛋白的表达较癌旁正常组织中表达明显降低,差异有统计学意义（P〈0.05）;癌旁正常黏膜组织中无Runx3基因启动子的甲基化,喉癌组织中有32例（58.2%）检测到Runx3基因启动子的甲基化,2者比较差异有统计学意义（P〈0.05）;喉癌组织中Runx3基因启动子甲基化及Runx3蛋白的表达与性别、临床分型及分级、有无淋巴结转移均无关（均P〉0.05）;喉癌组织中Runx3基因启动子甲基化与Runx3蛋白表达呈负相关（r=-0.7092,P〈0.01）。结论Runx3基因启动子甲基化是其基因失活的可能机制之一,在喉癌的发生中起重要作用。     

胃癌中Runx3表达及其甲基化

目的探讨Runx3表达及其甲基化与胃癌的关系。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测42例胃癌组织、癌旁正常组织及转移淋巴结中Runx3 mRNA的表达,同时用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测Runx3甲基化状况。结果胃癌组织、转移淋巴结、癌旁正常组织中Runx3 mRNA的表达相对值分别为0.569±0.131、0.609±0.141、0.871±0.237,胃癌组织、转移淋巴结与癌旁正常组织相比,均有显著性差异（P〈0.05）。胃癌组织、转移淋巴结Runx3甲基化阳性率分别为71.4%、62.5%,两者无显著性差异（P〉0.05）;而癌旁正常组织中未检测到Runx3甲基化。胃癌组织中Runx3甲基化表达与肿瘤的分化程度有关,与性别、肿瘤大小、浸润深度等临床病理特征无关。结论Runx3甲基化是胃癌发生、发展过程中的频繁事件,通过对其检测,可能会对胃癌的早期诊断、治疗提供重要依据。     

HER-2 siRNA对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响

目的:观察表皮生长因子受体2(HER-2)siRNA转染SKOV-3细胞抑制HER-2表达后对卵巢癌细胞耐药性的影响.方法:体外转录合成HER-2序列特异性双链RNA(dsRNA),转染SKOV-3细胞株中,RT-PCR方法检测转染前后HER-2基因的mRNA的表达,MTT法检测顺铂对转染前后卵巢癌细胞的生长抑制率.结果:HER-2siRNA转染72 h后,对SKOV-3细胞HER-2 mRNA表达明显抑制.在不同浓度顺铂(0.05～50μg/ml)的作用下,转染HER-2 siRNA与转染非特异性siRNA、空白对照组相比,差异有十分显著性意义(P＜0.01).细胞对顺铂的敏感性约提高10倍.结论:体外转录合成的siRNA能有效抑制SKOV-3细胞中HER-2的表达,提高细胞对顺铂的敏感性,RNA干扰技术为卵巢癌的治疗提供了一种新策略.     

肝细胞癌中Runx3基因启动子区甲基化研究

目的 通过检测肝细胞癌中Runx3基因启动子区域甲基化状态及Runx3基因表达情况,探讨Runx3基因启动子区域异常甲基化状态在肝细胞癌发生和发展过程中的意义.方法 采用DNA甲基化特异性PCR(MSP)技术分别对5种肝癌细胞系和52例肝细胞癌患者肿瘤组织及其癌旁组织Runx3基因启动子区域甲基化进行检测,同时采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测3种肝癌细胞系Runx3 mRNA在使用药物5-氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)前后的表达情况.结果 在肝细胞癌组织中,Runx3基因启动子区域甲基化率占42.3%(22/52),而在相对应的癌旁正常组织中,Runx3基因启动子区域未发现高甲基化现象;Runx3基因启动子区域甲基化状态与患者临床病理参数均无相关关系;在5种肝癌细胞系中,有3种细胞Runx3基因启动子区域存在甲基化异常;用药物5-Aza-CdR处理后的3种肝癌细胞中Runx3 mRNA表达明显增强.结论 Runx3基因启动子区域甲基化是导致Runx3基因失活的主要原因之一,与肝细胞癌发生早期密切相关,可作为肝细胞癌早期诊断的分子标记物及分子治疗的靶点.     

胃癌及癌旁组织中Runx3基因甲基化研究及临床意义

目的:探讨Runx3基因启动子区域甲基化及表达在胃癌发生和发展过程中的意义。方法:采用DNA甲基化特异性PCR(MSP)技术对35例胃癌患者手术切除肿瘤组织及其癌旁组织Runx3基因启动子区域甲基化进行检测,同时采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Runx3 mRNA的表达情况。结果:Runx3基因在35例胃癌及其癌旁组织中甲基化率分别为40.0%(14/35)和8.5%(3/35);胃癌组织标本中Runx3基因表达(0.593 8±0.100 7)较癌旁正常组织表达(0.831 1±0.287 2)明显下调,差异有统计学意义(P﹤0.05)。Runx3 mRNA在胃癌标本的表达与其病理临床特征密切相关,在伴有淋巴结转移和低分化的胃癌组织标本中Runx3 mRNA的表达显著下调(P﹤0.05)。结论:Runx3基因启动子区域甲基化是导致Runx3基因失活的主要原因之一,与胃癌的发生发展密切相关,可作为胃癌早期诊断的分子标记物及分子治疗的靶点。     

Runx3和胃癌发生发展关系的研究进展

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一．在分子生物学及遗传学研究中发现胃癌的发生与端粒酶激活、基因不稳定性、癌基因激活和抑癌基因失活等多种因素和多基因损伤有关．其中抑癌基因的失活在胃癌发生发展中更常见、更重要。Runx3是新发现的在迄今为止约10余种和胃癌相关的基因中与胃癌关系最密切的抑癌基因，可能是胃癌发生发展中的关键性基因。所以以下将从Runx3的结构功能、调节胃黏膜细胞增殖、凋亡和分化机制，胃癌中Runx3编码蛋白改变．胃癌中Runx3失活机制对Runx3在胃癌的发生和发展过程中的重要作用进行综述。     

p15基因干扰对肝癌耐药的影响

目的探讨小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制p15基因对肝癌耐药的影响。方法采用浓度递增法用顺铂(cisplatin,CDDP)诱导肝癌细胞HepG2建立动态耐药模型HepG2/CDDP/2.0。脂质体法将针对p15 mRNA的siRNA(Y1、Y2、Y3)和阴性对照siRNA-F转染至HepG2/CDDP/2.0细胞,筛选最佳转染浓度和最有效的干扰序列。MTT法检测HepG2/CDDP/2.0对CDDP的半数抑制浓度(IC50)、流式细胞仪分析HepG2/CDDP/2.0细胞周期分布、RT-PCR和Western blot分别检测p15 mRNA和p15蛋白、P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达。结果成功建立肝癌耐药模型HepG2/CDDP/1.6,系中度耐药。RT-PCR显示siRNA Y3干扰效果最佳。转染后G1期细胞比例分别为53.8%(24 h),51.6%(48 h),48.8%(72 h)(P<0.05);RT-PCR和Western blot显示p15表达降低,p-gp表达增加。结论在肝癌耐药的动态过程中,随着耐药时间的延长,G1期的...     

索拉非尼联合顺铂对肝癌HepG2细胞的抑制作用

目的 探讨索拉非尼联合顺铂(DDP)对肝癌细胞HepG2的抑制作用及其可能分子机制.方法 单独及联合给药后以MTT法测定HepG2细胞的增殖,用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡,用Western blotting观察ERK及pERK蛋白的表达.结果 索拉非尼及DDP单药对HepG2均有抑制作用,两药联合具有协同或相加作用(P＜0.05).索拉非尼及DDP分别主要使细胞阻滞于G1及G2期.两药联用后同时阻滞于G1及G2期.联合组凋亡率明显比单药组高(P＜0.05).单用及联合用药对HepG2细胞ERK表达无明显影响,索拉非尼及联合用药减少pERK的表达.结论 索拉非尼和DDP对肝癌HepG2细胞有增殖抑制及促凋亡作用,两药联合表现为协同或相加作用,其机制可能与细胞周期的双重阻滞及细胞增殖通路Raf/MEK/ERK的抑制有关.     

紫花牡荆素诱导肝癌Hep G2细胞分化

目的:研究紫花牡荆素诱导人肝癌Hep G2细胞分化作用.方法:体外培养人肝癌Hep G2细胞,采用瑞氏-姬姆萨染色显微镜下测量细胞核质比,放射免疫法检测细胞上清液甲胎蛋白(AFP)水平,酶促反应试剂盒检测细胞碱性磷酸酶(ALP)和γ-谷胺酰转肽酶(γ-GT)的活性;Diamond stone分光光度法测定细胞酪氨酸α-...     

RNAi技术抑制HepG2细胞中DcR3的表达

目的探讨特异性DcR3-siRNA对人肝细胞癌细胞系HepG2的DcR3基因表达的影响。方法设计并合成带FAM荧光标记的针对DcR3的siRNA4条和非特异性siRNA1条,用脂质体转染HepG2细胞,应用荧光显微镜和流式细胞仪判断转染效果;应用半定量RT-PCR和免疫细胞化学检测特异性DcR3-siRNA的对HepG2细胞中DcR3表达的抑制作用。结果各特异性DcR3-siRNA均能抑制DcR3 mRNA表达(P<0.05),其中以siRNA4的作用更明显,干扰作用达62.9%;将siRNA4转染HepG2细胞,免疫细胞化学结果显示,siRNA4能明显抑制HepG2细胞中DcR3蛋白的表达(P<0.01)。结论特异性DcR3-siRNA在体外实验能抑制目的基因的表达。     

RNA干扰HBx基因对肝癌细胞化疗效果的影响

目的：探讨RNA干扰技术和传统的化疗方法联合应用对肝癌细胞生长抑制作用的影响,并选择高效的治疗组合,研究其凋亡机制。方法：鉴定3组肝癌细胞——MHCC97-H(原肝癌细胞株),HK3细胞（转染空质粒的MHCC97-H细胞）和21543细胞（转染含HBx-shRNA质粒的MHCC97-H细胞）;RT-PCR检测RNA干扰对HBx mRNA沉寂作用,CCK8和TUNEL分别检测RNA干扰HBx后化疗药物对MHCC97-H肿瘤细胞生长的抑制及诱导细胞凋亡情况。结果：RT-PCR结果显示,与MHCC97-H细胞组比较,21543细胞的HBx mRNA水平下降约91%,HK3细胞HBx mRNA水平下降不明显;RNA靶向干扰HBx基因后的肝癌细胞（21543细胞）较原肝癌细胞（MHCC97-H细胞）和HK3细胞增殖明显减慢,而后两种细胞差别无统计学意义;3种不同细胞加用3种不同浓度的氟尿嘧啶(0~120 mg/L)、顺铂(0~32 mg/L)后细胞生长明显减慢并呈浓度依赖性,以RNA靶向干扰HBx基因后的21543细胞生长抑制最明显;相同浓度的氟尿嘧啶对3组不同肝癌细胞均可引起细胞凋亡,以21543细胞凋亡最明显。结论：RNA干扰HBx可明显抑制肝癌细胞的增殖,并增加肝癌细胞对化疗药物的敏感性;RNA干扰HBx基因和化疗药物联合应用使肝癌细胞凋亡更明显,细胞增殖速度明显减慢。     

Establishment of hepatocellular carcinoma multidrug resistant monoclone cell line HepG2/mdr1

Background  The multidrug resistance (MDR) associated with the expression of the mdr1 gene and its product P-glycoprotein is a major factor in the prognosis of hepatocellular carcinoma cell (HCC) patients treated with chemotherapy.  Our study was to establish a stable HCC MDR cell line where a de novo acquisition of multidrug resistance specifically related to overexpression of a transgenic mdr1.
Methods  The 4.5-kb mdr1 cDNA obtained from the plasmid pHaMDR1-1 was cloned into the PCI-neo mammalian expression vector, later was transferred by liposome to human hepatocarcinoma cell line HepG2. Then the transfected HepG2 cells resisting G418 were clustered and cultured and the specific fragment of mdr1 cDNA, mRNA and the P-glycoprotein (Pgp) in these HepG2 cells were detected by PCR, RT-PCR and flow cytometry, respectively.  The accumulation of the daunorubicin was determinated by flow cytometry simultaneously. The nude mice model of grafting tumour was established by injecting subcutaneously HepG2/mdr1 cells in the right axilla. When the tumour diameter reached 5 mm, adriamycin was injected into peritoneal cavity. The size and growth inhibition of tumour were evaluated.
Results  The mdr1 expression vector was constructed successfully and the MDR HCC line HepG2/mdr1 developed.  The PCR analysis showed that the specific fragment of mdr1 cDNA in HepG2/mdr1 cells, but not in the control group HepG2 cells. Furthermore, the content of the specific fragment of mdr1 mRNA and Pgp expression in HepG2/mdr1 cells were (59.7±7.9)% and (12.28±2.09)%, respectively, compared with (16.9±3.2)% and (3.07±1.06)% in HepG2 cells.  In the nude mice HCC model, the tumour genes of both groups were identified. After ADM therapy, the mean size of HepG2 cell tumours was significantly smaller than HepG2/mdr1 cell tumours.
Conclusion  The approach using the transfer of mdr1 cDNA may be applicable to the development of MDR hepatocarcinoma cell line, whose MDR mechanism is known. This would provide the experimental basis of MDR research.

     

RNA干扰逆转肝细胞癌多药耐药

目的 筛选高效dsRNA/mdr1,以备研究RNA干扰逆转肝细胞癌多药耐药之用.方法 首先根据siRNA设计原则,以多药耐药基因(mdr1)为靶基因,设计并选择4～5条siRNA/mdr1,经BLAST后体外转录法合成dsRNA/mdr1,用Oligofectamine试剂分别转染HepG2/mdr1,然后从mRNA、蛋白(P-gp)表达水平和细胞功能变化评价HepG2/mdr1耐药性被逆转的程度,比较各个dsRNA/mdr1的逆转效率,筛选出有效的siRNA/mdr1.结果 成功合成5条dsRNA/mdr1(其中1条为阴性对照),dsRNA/mdr1-4 mRNA表达(18.73±1.33)%、蛋白表达变化(79.1±1.6)%～(16.8±0.4)%与其他各组细胞比较,有显著性差异;细胞内柔红霉素(DNR)累积量也较其他组明显增加(平均荧光强度79.58,阳性率84.25%,P＜0.05).结论 体外转录法结合脂质体转染适用于筛选高效siRNA,肯定了siRNA干扰序列能够有效阻抑mdr1基因编码蛋白p170的功能.     

沉默干扰素诱导跨膜蛋白3可抑制肝癌细胞HepG2增殖和侵袭

目的研究干扰素诱导跨膜蛋白3（IFITM3）在原发性肝癌中的异常表达,探讨沉默IFITM3表达对肝癌细胞系HepG2生
物学特征的影响。方法通过Western blot和免疫组织化学染色法检测60例肝癌组织及对应癌旁组织中IFITM3的表达情况及
相关性;构建IFITM3小干扰RNA片段（IFITM3 si-RNA）,采用脂质体介导转染肝癌细胞（HepG2细胞系）,同时设置无义序列组
和空白对照组,实时荧光定量PCR检测转染后IFITM3 mRNA的表达;CCK8（cell counting kit 8）检测转染后细胞增殖能力;
Western blot检测IFITM3在蛋白水平的表达;Transwell实验和划痕实验检测细胞侵袭和迁移能力的变化。结果和癌旁组织相
比,IFITM3在肝癌组织中的明显高表达。与无义序列组和空白对照组比较,IFITM3 si-RNA转染组细胞IFITM3表达和细胞增
值率降低,穿膜细胞数也明显减少,差异均有统计学意义（P<0.05）。划痕实验也表明迁移能力降低。结论IFITM3在原发性肝
癌中高表达;IFITM3在肝癌细胞增殖和侵袭过程中发挥重要作用,有望成为原发性肝癌基因治疗的侯选靶点。
     

选择性ＣＯＸ-２抑制剂ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ对肝细胞癌细胞周期的影响

目的:探讨选择性COX-2抑制剂celecoxib对培养的人肝细胞癌细胞的细胞周期的阻滞作用.方法:采用3种常规培养的人肝细胞癌细胞株HUH-7、Hep3B和HepG2,分别给予不同浓度的celecoxib(0、10、25、50 μmol/L),作用不同的时间(0、12、24、48 h),用WST-8法检测细胞的活性,用流式细胞仪检测肝癌细胞的细胞周期变化.结果:WST-8检测发现,随着celecoxib的作用浓度的增加和作用时间的延长,3种肝癌细胞的细胞活性明显下降.流式细胞仪检测发现,3种肝癌细胞在celecoxib 25μmol/L作用24 h后出现Go/G1期阻滞,HUH-7细胞也出现较弱G2/M期阻滞的现象,48 h时更为明显.结论:选择性COX-2抑制剂celecoxib可以通过明显的细胞周期阻滞作用降低肝细胞癌细胞活性,阻滞的时期主要位于Go/G1期和G2/M期.