慢病毒载体介导的shRNA对小鼠T细胞CD28基因表达的影响

目的探讨编码针对小鼠CD28的短发卡状RNA（short hairpin RNA,shRNA）的慢病毒载体对小鼠T细胞CD28基因表达的影响。方法设计并合成3对靶向小鼠CD28的特异性干扰序列和1对非特异性干扰序列,亚克隆入慢病毒载体pLB中,构建出重组慢病毒干扰质粒,行PCR鉴定并进一步测序证实。分别将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞,生产慢病毒颗粒,并依据绿色荧光蛋白（GFP）表达水平检测病毒滴度。慢病毒感染小鼠脾淋巴细胞,实时荧光定量RT-PCR和Western blot技术分别从mRNA水平和蛋白水平检测CD28的表达。结果PCR鉴定及测序结果证实4种重组慢病毒质粒均构建成功,重组慢病毒滴度均达1×1011U/L。感染T细胞后,CD28基因mRNA和蛋白表达量均有明显下降。结论成功构建了CD28 shRNA慢病毒载体,可有效下调小鼠T细胞CD28基因的表达,其为进一步研究体内沉默CD28基因控制移植物抗宿主病奠定了基础。     

携带鼠Foxp3基因的自身失活型慢病毒载体的构建及表达

目的 构建携带鼠Foxp3基因的自身失活型慢病毒载体,并研究其在CD4+CD25-T细胞中的表达.方法 构建含鼠Foxp3基因及内部核糖体进入位点序列(IRES)和绿色荧光蛋白基因(GFP)的双顺反子慢病毒载体.采用脂染法将慢病毒载体三质粒转染293T细胞,经共培养法感染免疫磁珠分离的小鼠CD4+CD25-T细胞,流式细胞术(FCM)检测基因转导效率,通过RT-PCR及Western Blotting法分别从mRNA和蛋白水平检测Foxp3的表达.结果 成功构建了慢病毒表达质粒pXZ208-IRES-GFP/pXZ208-Foxp3-IRES-GFP,包装的重组慢病毒滴度达106 IU/mL.以pXZ208-IRES-GFP为阴性对照组,共培养法感染CD4+CD25-T细胞,实验组细胞基因转导效率达55.95%,并且存在Foxp3 mRNA和蛋白水平的高表达.结论 成功构建了携带鼠Foxp3基因的自身失活型慢病毒载体;该系统可有效的介导Foxp3基因在CD4+CD25-T细胞中表达.     

针对糖尿病易感基因Vβ13的慢病毒系统的建立及其对T细胞的转导

目的 应用慢病毒介导的RNA干扰技术,有效沉默连接红色荧光蛋白mCherry与靶基因1型糖尿病易感基因Vβ13的表达,建立一种简便有效基因沉默的系统,并初步研究慢病毒感染T细胞的可能性.方法 以Vβ13 mRNA编码序列作为干扰靶点,以慢病毒质粒UTG作为载体,构建靶向Vβ13的shRNA表达质粒,构建携带Vβ13的mCherry红色荧光蛋白的质粒作为验证shRNA有效性的靶点,并转染293FT细胞.通过红色荧光的表达及RT-PCR和Western blot确定最佳沉默Vβ13序列后,将有效的UTG-Vβ13质粒与辅助质粒共转染293FT细胞,低温超高速离心,获取高滴度慢病毒.应用慢病毒感染大鼠T细胞,光镜观察T细胞被慢病毒感染的情况,流式细胞术检测T细胞的绿色荧光表达情况.结果 成功构建Vβ13-shRNA慢病毒载体UTG-shRNA-Vβ13,RT-PCR及Western blot结果显示慢病毒感染的293FT细胞Vβ13 mRNA及蛋白表达相对于对照组显著降低.构建的慢病毒可以成功感染T细胞.结论 红色靶基因-绿色慢病毒系统具有简便的筛选性能;UTG慢病毒对神经干细胞具有较高感染效率.可作为一种良好的基因导入载体,实现慢病毒介导的RNA干扰在T细胞内的有效表达,并为T细胞过继性转移的相关研究提供技术支持.     

SMO特异性siRNA慢病毒载体的筛选构建

目的构建特异性沉默SMO基因的重组慢病毒载体,筛选对T293细胞SMO基因表达抑制效率最高的siRNA。方法根据SMO基因信息,设计了4个小干扰序列和1个阴性对照序列,利用慢病毒质粒载体pGCSIL-GFP构建了5个重组质粒。用脂质体将重组慢病毒载体转染293T细胞后,Western blot检测沉默效率,从中筛选沉默效率高的质粒载体进行慢病毒颗粒大量包装。结果测序结果证明4个重组慢病毒质粒载体pGCSIL-GFP-721、pGCSIL-GFP-722、pGCSIL-GFP-723、pGCSIL-GFP-724的插入序列完全正确,重组慢病毒载体转染293T细胞后,Western blotting证实重组慢病毒质粒载体pGCSIL-GFP-723的干扰效率最高。包装获得Lv-SIL-SMO723慢病毒颗粒。结论成功筛选获得特异性抑制SMO的siRNA,成功构建了特异性沉默SMO基因慢病毒载体,其产生的慢病毒颗粒能高效特异地沉默SMO基因,为进一步应用奠定基础。     

p38MAPK基因RNAi慢病毒载体的构建及在MC3T3-E1细胞的表达

目的 构建小鼠p38MAPK基因RNAi慢病毒载体,观察其对MC3T3-E1成骨细胞p38MAPK表达及细胞凋亡的影响.方法 设计并合成3对互补的针对小鼠p38MAPK mRNA的oligoDNA片段,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ酶切后的载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.重组质粒与慢病毒包装载体共转染293T细胞,包装产生慢病毒,流式细胞仪检测病毒滴度,p38MAPK-shRNA慢病毒载体转染体外培养MC3T3-E1细胞,荧光定量PCR 检测MC3T3-E1细胞p38MAPK mRNA表达,进行p38MAPK干扰有效靶点的筛选.22.2 mol/L葡萄糖刺激培养MC3T3-E1细胞7 d,Western blot检测MC3T3-E1细胞p38MAPK蛋白的表达,流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡.结果 酶切和测序均证实各重组质粒核苷酸序列插入正确,所得质粒分别命名为p38MAPK-shRNA1、p38MAPK-shRNA2、p38MAPK-shRNA3,流式细胞仪测定病毒滴度分别为2.4×108、2.8×108、2.5×108 TU/ml. p38MAPK-shRNA转染MC3T3-E1细胞效率达到74%以上,RT-PCR检测结果显示,各p38MAPK-shRNA转染组MC3T3-E1细胞p38MAPK mRNA表达较正常对照组分别下降了78.8%、84.3%和60.2%(P<0.01),其中以p38MAPK-shRNA2的干扰效率最高.Western blot检测结果显示,与正常对照组相比,高糖组、空载体转染组MC3T3-E1细胞p-p38MAPK蛋白表达明显增加(P<0.01).p38MAPK-shRNA慢病毒转染组MC3T3-E1细胞p-p38MAPK蛋白表达水平较高糖组明显下调(P<0.01).流式细胞仪检测结果显示,与正常对照组相比,高糖组MC3T3-E1细胞凋亡率显著增加(P<0.01);p38MAPK-shRNA慢病毒转染组以及p38MAPK信号转导阻断剂组较高糖组MC3T3-E1细胞凋亡率明显减少(P<0.05,P<0.01).结论 成功构建了靶向p38MAPK基因RNAi慢病毒载体,其能有效抑制MC3T3-E1细胞p38MAPK基因表达,减少高糖诱导的MC3T3-E1细胞凋亡.     

CD47-shRNA慢病毒载体构建及其介导Hep-2细胞CD47基因沉默效应鉴定

目的构建CD47靶向shRNA慢病毒干扰载体,并观察其对Hep-2细胞CD47基因的抑制效应。方法设计CD47靶点特异性的寡核苷酸序列,利用酶切反应合成含特异性系列线性化的pGCSIL-GFP载体,包装293T细胞产生慢病毒并行滴度测定,再转染人喉癌Hep-2细胞,通过实时荧光定量PCR及Western Blotting检测重组慢病毒对CD47靶基因在mRNA和蛋白水平上的沉默抑制情况。结果阳性克隆PCR及测序证实针对CD47基因shRNA慢病毒干扰载体构建成功,RT-PCR及Western Blotting检测载体在mRNA和蛋白水平上可抑制喉癌Hep-2细胞的CD47表达。结论成功构建针对CD47基因的慢病毒干扰载体,为进一步行喉癌CD47基因功能研究提供了较好的实验工具。     

过表达Mxi1对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响

目的：构建含有Max结合蛋白1（Mxi1）基因的重组慢病毒载体,并探讨过表达Mxi1基因对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。方法：利用DNA重组技术将Mxi1基因克隆至慢病毒载体,经酶切和测序鉴定后,将重组质粒与慢病毒辅助包装元件质粒共转染293T 细胞,获得含 Mxi1基因的重组慢病毒。重组慢病毒感染人胃癌SGC-7901细胞,荧光显微镜下观察感染效率,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Mxi1、cyclinB1和caspase-8的基因表达,免疫印迹法（Western blot）检测Mxi1蛋白的表达。CCK-8比色法和流式细胞术分别检测Mxi1 基因对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。结果：成功构建含 Mxi1基因的慢病毒表达载体,RT-PCR和Western blot检测到Mxi1 基因和蛋白的表达。RT-PCR结果显示,过表达Mxi1 的SGC-7901细胞与空白对照细胞及过表达空病毒对照细胞相比,细胞内cyclinB1的mRNA表达水平明显降低,而caspase-8的 mRNA表达水平显著升高。CCK-8实验和流式细胞术检测结果显示,过表达Mxi1的SGC-7901细胞与空白对照细胞及过表达空病毒对照细胞相比,细胞增殖活性明显降低,细胞凋亡率显著升高。结论：成功构建Mxi1慢病毒载体且有效转染SGC-7901细胞,过表达Mxi1 可以抑制胃癌细胞增殖并促进其凋亡。     

小鼠骨桥蛋白(OPN)基因RNA干扰慢病毒载体的构建及体内抑制效果鉴定

 目的 构建骨桥蛋白(osteopontin,OPN)基因RNA干扰慢病毒载体并在小鼠体内鉴定其抑制效果。方法 参照OPN GenBank上的序列,对OPN基因沉默位点进行分析,设计针对OPN信使RNA的小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)OPN shRNA及阴性对照(negative control shRNA,NC shRNA)序列,合成pSicoR GFP shRNA重组体。经鉴定序列无误后,与pCMV VSV G 和pCMV dR8.91辅助质粒包装并转染293FT细胞,得到有效滴度为5×109 TU/mL的病毒原液。经尾静脉将构建的慢病毒载体注射入小鼠体内,qRT PCR及Western blot检测小鼠肝脏OPN mRNA及蛋白的抑制效果。结果 成功构建针对OPN的shRNA慢病毒载体,经纯化、浓缩得到滴度为5×109TU/mL病毒原液。与正常对照组、阴性对照组相比,实验组OPN mRNA及蛋白表达水平明显下降;正常对照组、实验组OPN mRNA及蛋白表达水平无明显差别。结论 利用RNA干扰技术,借助慢病毒载体,成功构建小鼠肝脏OPN基因低表达模型。为进一步研究OPN在胆石症等疾病中的作用提供了有力工具。     

shRNA 沉默YAP基因对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨慢病毒干扰载体沉默Yes-相关蛋白（Yes-associated protein,YAP）对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响。方法：用细胞免疫荧光法检测肾癌786-O细胞中YAP蛋白表达情况;构建针对YAP基因的shRNA慢病毒干扰载体转染786-O细胞。RT-PCR和Western blot分别检测干扰786-O细胞前后 YAP mRNA及蛋白的表达情况;CCK-8（cell counting kit-8）法检测沉默YAP后细胞增殖的改变;流式细胞仪（flow cytometry,FCM）检测细胞凋亡和周期的变化。结果：786-O细胞中YAP蛋白表达于细胞浆和细胞核;shRNA-YAP慢病毒干扰载体转染4 d后,可明显下调786-O细胞YAP mRNA及蛋白表达水平（P=0.000）,并且明显抑制细胞增殖和促进细胞凋亡（P=0.000）;细胞周期紊乱,G1 期细胞明显增加,S期细胞明显降低（P=0.000）。结论：YAP-shRNA慢病毒干扰载体能有效抑制YAP基因在786-O细胞中表达,进而抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。     

慢病毒介导HIF-1α沉默对缺氧肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响

目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,转染293T细胞包装产生慢病毒,转染人肝癌细胞株HepG2细胞,嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。将HepG2细胞分为正常对照组、干扰对照组(转染NC-shRNA)、干扰组(转染HIF-1α-shRNA),应用化学缺氧法(150μmol/L CoCl2)模拟肿瘤细胞缺氧微环境,应用Western Blot检测HepG2细胞中HIF-1α蛋白表达证实基因沉默效果,CCK-8检测沉默HIF-1α基因对HepG2细胞增殖的影响,Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测沉默HIF-1α基因对细胞凋亡的影响。Western Blot检测HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和细胞质细胞色素C(Cyt-C)表达的变化。结果:①成功构建HIF1α-shRNA慢病毒载体并转染HepG2细胞,缺氧培养细胞24h后,与正常对照组及干扰对照组相比,干扰组细胞内HIF-1α蛋白表达明显降低(P<0.01),证实慢病毒载体能够有效沉默HIF-1α基因。②沉默HIF-1α基因后缺氧培养的HepG2细胞增殖率下降(P<0.05),而细胞凋亡比例升高(P<0.01)。③Western Blot结果显示,与正常对照组及干扰对照组相比,沉默HIF-1α基因后细胞内凋亡相关蛋白Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和细胞质Cyt-C表达上调(P<0.05或P<0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.01),Bax/Bcl-2蛋白表达比例升高。结论:通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默缺氧HepG2肝癌细胞HIF-1α基因,HIF-1α沉默能显著抑制缺氧HepG2细胞增殖活性,促进细胞凋亡,其凋亡途径可能与激活内源性线粒体凋亡通路有关。     

IRF5基因慢病毒表达载体的构建及其在巨噬细胞RAW264.7中的表达

目的: 构建干扰素凋节因子5(IRF5)慢病毒表达载体LV11-cmv-neo-IRF5并转染巨噬细胞RAW264.7,观察IRF5巨噬细胞RAW264.7中的表达。方法: 采用基因重组技术,将PCR技术钓取的目的基因IRF5片段克隆至线性化慢病毒表达载体LV11中,重组载体经PCR、双酶切和测序鉴定构建成功后,采用脂质体转染技术将表达质粒和包装质粒共转染293FT细胞,获得携带IRF5基因的重组慢病毒;收集病毒上清液感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,用G418将非浸染的细胞致死,获得纯净的浸染细胞,即RAW264.7-IRF5细胞(实验组),并将RAW264.7-NC细胞作为对照(对照组)。分别采用RT-qPCR和Western blotting法检测2组细胞中IRF5mRNA和蛋白的表达水平。结果: 重组慢病毒质粒LV11-cmv-neo-IRF5经PCR和酶切法鉴定构建成功;病毒上清液感染RAW264.7细胞并经G418筛选获得阳性细胞;RT-qPCR法检测,与对照组比较,实验组细胞中IRF5mRNA表达水平升高(P<0.001);Western blotting法检测,实验组细胞中IRF5蛋白的表达水平明显高于对照组。结论: 成功构建携带IRF5基因的慢病毒表达载体LV11-cmv-neo-IRF5,IRF5基因在巨噬细胞RAW264.7中稳定表达。     

人FAM172A干扰慢病毒载体的构建及在甲状腺乳头状癌细胞中的表达

目的 构建人FAM172A干扰慢病毒表达载体,并包装成FAM172A干扰慢病毒感染甲状腺乳头状癌细胞予以鉴定。方法 根据人FAM172A mRNA序列设计退火Oligo,与慢病毒载体pL/shRNA/F经酶切、连接、转化、测序鉴定。病毒包装后,转染HEK293细胞测定病毒滴度。将重组慢病毒感染甲状腺乳头状癌细胞,利用荧光显微镜和QPCR检测FAM172A的表达。结果 重组慢病毒载体pL/shRNA/F-shFAM172A经PCR扩增及测序鉴定正确,病毒包装后荧光显微镜观察到FT293细胞中有大量绿色荧光,测定病毒滴度为5×10⁶TU/ml。FAM172A干扰慢病毒感染的甲状腺乳头状癌细胞中FAM172A表达被显著减少。结论 成功制备了人重组FAM172A干扰慢病毒,并在甲状腺乳头状癌细胞中高效减少FAM172A的表达,为进行FAM172A的功能和机制奠定了良好的基础。     

连环蛋白p120 shRNA重组慢病毒载体构建及鉴定

目的构建连环蛋白p120特异性shRNA重组慢病毒载体,感染胰腺癌PANC-1细胞,鉴定干扰效果。方法针对p120ctn mRNA设计合成3对shRNA序列,连接入酶切线性化的慢病毒载体pGCSIL-GFP,PCR鉴定及测序正确后与构建成功的含p120ctn基因的载体pGC-FU-p120ctn-3FLAG共转染293T细胞,蛋白质印迹分析筛选有效shRNA序列,包装慢病毒,测定病毒滴度。重组慢病毒感染胰腺癌PANC-1细胞,实时定量PCR及蛋白质印迹分析鉴定干扰效果。结果 PCR及测序证实成功构建出p120ctn-shRNA-LV慢病毒载体,病毒滴度达到3×109TU/ml。重组慢病毒感染PANC-1细胞后,实时定量PCR提示PANC-1细胞p120ctn mRNA表达下降82.6%(P0.05),蛋白质印迹分析提示p120ctn蛋白表达较转染前显著下降。结论成功构建出p120ctn基因shRNA慢病毒载体,为进一步研究p120ctn在胰腺癌浸润及转移中的作用奠定了基础。     

FoxM1 shRNA慢病毒载体构建及感染人前列腺癌细胞的稳定细胞株筛选

目的构建携带绿色荧光蛋白（GFP）的人FoxM1 shRNA重组慢病毒载体,并构建筛选FoxM1敲低的人前列腺癌稳定细胞
株,检测FoxM1的表达及对细胞增殖能力的影响。方法设计并合成3对特异性针对人FoxM1基因的shRNA靶序列,构建到
pHBLV-U6-ZsGreen-Puro 慢病毒载体中,测序鉴定载体构建情况,利用慢病毒三质粒系统转染包装293T细胞,荧光显微镜下观
察转染效率。收集到的病毒上清转染人前列腺癌DU-145细胞,Real-time PCR检测各组细胞FoxM1 mRNA水平,经嘌呤霉素
筛选建立FoxM1敲低稳定细胞株,用Western blotting法检测细胞中FoxM1表达,并用MTT法观察稳转细胞的生长增殖活性,
流式细胞术观察稳转细胞凋亡情况,平板克隆实验观察稳转细胞的克隆形成能力。结果经测序鉴定成功构建了3对FoxM1
shRNA慢病毒载体,并进行包装,感染DU-145细胞后Real-time PCR检测结果表明第1对慢病毒载体干扰效率最佳,嘌呤霉素
抗性筛选建立了FoxM1敲低稳定细胞株,荧光显微镜观察感染效率较高,Western blotting结果显示细胞中FoxM1蛋白表达明
显受到抑制,细胞的生长增殖能力明显受限,流式细胞术结果显示FoxM1敲低组细胞凋亡率高于对照组,平板克隆实验结果表
明FoxM1敲低组细胞克隆形成能力下降。结论本研究成功构建了FoxM1 shRNA慢病毒载体,建立了FoxM1敲低稳定前列腺
癌细胞株,抑制细胞内FoxM1的表达能够抑制前列腺癌细胞DU-145的生长增殖、克隆形成能力,并能诱导细胞凋亡。
     

PRL-3基因RNA干扰慢病毒载体的构建及在SW480细胞中的表达

目的 构建PRL-3基因慢病毒干扰载体及建立PRL-3基因稳定干扰的结直肠癌细胞亚系.为PRb-3基因功能研究奠定基础.方法 设计PRL-3基因特异性RNAi靶序列,与pENTRTM/U6线性载体定向连接,构建pENTRTM/U6真核入门表达载体.通过与pENTRTM/U6 entry clone与pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST载体进行重组,获得pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体.利用包装细胞293FT获得重组的慢病毒,感染大肠癌细胞株SW480细胞,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰PRL-3基因的细胞亚系.结果 成功构建PRL-3 pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为6×105U/L.RT-PCR、Western blotting结果 表明,克隆1 PRL-3mRNA及蛋白显著降低.结论 成功构建人PRL-3基因特异性的慢病毒干扰载体,获得PRL-3基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系.     

慢病毒介导人PERK基因修饰对内质网应激介导凋亡的影响

目的构建人蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)慢病毒载体并包装慢病毒颗粒(lentivirus),探讨成肌细胞C2C12中PERK基因慢病毒修饰对内质网应激介导凋亡的作用。方法设计并合成人PERK基因的上、下游引物,采用PCR方法从真核质粒pcDNA3.l(-)-PERK中扩增目的基因。鉴定后与慢病毒载体pWPT-GFP进行重组,再将重组慢病毒载体pWPT-GFP-PERK与慢病毒包装质粒pMD2G、pSPAX2共转入293T细胞中,进一步包装形成PERK慢病毒(LV-PERK);收集转染后48h的细胞上清,体外感染成肌细胞C2C12,观察绿色荧光蛋白(GFP)感染效率,并应用流式细胞仪(FCM)检测内质网应激时重组慢病毒PERK对C2C12细胞增殖凋亡的影响,蛋白质印迹法检测凋亡相关基因Cleaved Caspase-3与Chop蛋白的表达。结果成功构建和包装了滴度为4.2×108 efu/mL的PERK重组慢病毒。FCM检测结果表明,TM+LV-PERK处理组G1期细胞比例为54.37%,低于TM组(77.91%)和LV-GFP组(66.41%);TM+LVPERK处理组S期细胞比例为31.36%,高于TM组(12.14%)和LV-GFP组(16.96%),各组差异均具有统计学意义(P<0.05);此外,TM+LV-PERK处理组细胞凋亡率为25.91%,高于TM组(11.79%)和Ad-GFP组(11.24%),各组差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫印迹检测Cleaved Caspase-3和Chop蛋白的表达与FCM结果一致。结论成功构建和包装LVPERK重组慢病毒颗粒,在内质网应激时,LV-PERK慢病毒可促进C2C12细胞的增殖和凋亡。     

ASIC3-shRNA干扰慢病毒质粒的构建及其效率的鉴定

目的: 构建酸敏感离子通道3(acid sensing ion channels 3, ASIC3)干扰慢病毒质粒并进行效率鉴定。方法: 利用GenBank获取ASIC3基因序列并合成相应干扰序列,通过T4 DNA连接酶将ASIC3基因片段连接至环状Plko.1 Puro载体,将重组质粒转染293T细胞获取慢病毒,用实时荧光定量PCR(qRT PCR)检测病毒滴度;将包装之后的慢病毒感染PC12、BV2、N2a细胞,分别分为ASIC3 shRNA组和EGFP shRNA组(阴性对照),经慢病毒感染后用qRT PCR和免疫印迹技术分别检测ASIC3 mRNA和蛋白表达。结果： 合成的ASIC3干扰序列成功连接至Plko.1 Puro载体;qRT PCR及DNA测序鉴定结果证实,ASIC3 shRNA质粒构建成功;qRT PCR与免疫印迹结果表明,在PC12、BV2、N2a细胞中,与EGFP shRNA组相比,ASIC3 shRNA组ASIC3 mRNA和蛋白表达量均明显下调(P＜0.05)。病毒滴度约为1×109 IU/mL。 结论： ASIC3 shRNA干扰慢病毒质粒构建成功。     

足舟骨、副舟骨痛风性关节炎误诊1例报告

目的 构建人蛋白激酶R样内质网激酶（Protein Kinase R-like ER kinase, PERK）慢病毒载体并包装慢病毒颗粒（Lentivirus）,探讨成肌细胞C2C12中PERK基因慢病毒修饰对内质网应激介导凋亡的作用。方法 设计并合成人PERK基因的上下游引物,从真核质粒pcDNA3.l(-)-PERK中PCR 扩增目的基因。鉴定后与慢病毒载体pWPT-GFP进行重组,再将重组慢病毒载体pWPT-GFP-PERK与慢病毒包装质粒pMD2G、pSPAX2共转入293T细胞中,进一步包装形成PERK慢病毒(LV-PERK);收集转染后48h的细胞上清,体外感染成肌细胞C2C12,观察绿色荧光蛋白（GFP）感染效率,并应用流式细胞仪（FCM）检测ER Stress时,重组慢病毒PERK对C2C12细胞增殖凋亡的影响。结果 成功构建和包装了滴度为4.2×108efu /ml的PERK重组慢病毒。FCM检测结果表明,TM LV-PERK处理组G1期细胞比例54.37 %,低于TM组（77.91 %）和LV-GFP组（66.41%）;TM LV-PERK处理组S期细胞比例31.36 % ,高于TM组（12.14%）和LV-GFP组（16.96%）,各组差异均具有统计学意义（P﹤0.05）;此外,TM LV-PERK处理组细胞的凋亡率为25.91%,高于TM组凋亡率（11.79%)和Ad-GFP组凋亡率（11.24 %）,各组差异具有统计学意义（P﹤0.05）。免疫印迹检测Cleaved Caspase-3和Chop蛋白的表达与FCM结果一致。结论 成功构建和包装LV-PERK重组慢病毒颗粒,在ER Stress时,LV-PERK慢病毒可促进C2C12细胞的增殖和凋亡。     

Id2 shRNA慢病毒载体的构建及其转染后对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的构建能高效敲减分化抑制因子2(Id2)基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,并观察敲减Id2对胶质瘤细胞株U251增殖和凋亡的影响。方法设计并合成特异性针对Id2基因的shRNA序列,将其构建到慢病毒载体pGCSIL-GFP中。以含有Id2基因的质粒为模板,扩增Id2基因cDNA序列的特异性片段,插入真核表达载体pEGFP-N1-3FLAG。构建含Id2基因质粒和不同靶点的RNAi慢病毒载体,共转染入工具细胞293T,筛选出适合浓度慢病毒感染U251细胞株。MTT法检测敲减Id2后胶质瘤细胞增殖的改变,RT-PCR检测Id2敲减后U251细胞caspase 3的表达。结果构建后载体的PCR鉴定及DNA测序结果与预期一致。与对照组相比,转染Id2 shRNA的U251细胞增殖降低,凋亡率升高,caspase3表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建的针对Id2基因的RNA干扰慢病毒载体体外转染可抑制胶质瘤细胞增殖并促进其凋亡。