重组狗凝血因子Ⅷ的慢病毒介导体外表达的研究

本研究的目的是制备携带狗凝血因子Ⅷ（cFⅧ）基因的慢病毒载体,探讨慢病毒载体能否介导cFⅧ在体外的有效表达。用构建携带cFⅧ基因的慢病毒载体pTK161（含PUB启动子）和pTK162（含2OH1启动子）,同时构建含绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒载体pTK161′（含PUB启动子）和pTK162′（含2OH1启动子）的方法,分别与包装质粒ΔNRF、包膜蛋白质粒VSV-G共转染293T包装细胞,将包装好的病毒颗粒再感染293T细胞,检测病毒滴度和培养细胞上清中cFⅧ活性。结果显示：经限制性酶切鉴定,成功构建了pTK161、pTK162、pTK161′和pTK162′正向连接载体;pTK161′和pTK162′的病毒滴度分别为1.54×10^6U/ml和2.83×106U/ml;pTK161、pTK162感染靶细胞后24小时细胞上清中即可检测到cFⅧ的表达,72小时表达量达高峰。pTK162载体cFⅧ表达活性接近正常狗血浆FⅧ活性,而且明显高于pTK161（p〈0.05）,6周后cFⅧ表达活性仍达最高值的1/4。结论：构建的自身失活慢病毒载体可携带较大片段的cFⅧ基因,并在体外可获得有效表达;本研究为慢病毒载体介导的血友病A的基因治疗研究提供实验依据。     

趋化因子受体7基因绿色荧光慢病毒载体构建及在未成熟树突状细胞中的表达

背景：趋化因子受体7（chemokine receptor-7,CCR7）是树突状细胞从外周迁移至淋巴系统发挥作用的最重要的启动和调节者,但未成熟树突状细胞表面不表达CCR7,因此利用携带CCR7基因的未成熟树突状细胞可以更好地诱导免疫耐受。目的：构建携带小鼠CCR7基因的绿色荧光蛋白重组慢病毒载体,观察其在未成熟树突状细胞中的表达。方法：采用RT-PCR扩增小鼠CCR7基因并克隆至pCR-Blunt载体。将CCR7DNA片段及IRES-GFP连入慢病毒转移质粒LV-Lac,生成重组慢病毒质粒LV-CCR7。采用脂质体转染法将慢病毒系统3质粒（重组慢病毒质粒LV-CCR7、包装质粒ΔNRF及包膜质粒pVSVG）共转染包装慢病毒,重组慢病毒感染未成熟树突状细胞,光学显微镜观察细胞状态,流式细胞术鉴定CCR7蛋白的表达。结果与结论：实验成功扩增出小鼠CCR7DNA片段并克隆至pCR-Blunt载体,亚克隆构建慢病毒表达载体LV-CCR7,经3质粒包装系统感染293FT细胞后,24h于荧光显微镜下均观察到绿色荧光蛋白阳性表达,病毒滴度为108U/L以上,获得携带CCR7基因的重组慢病毒。慢病毒颗粒可有效感染未成熟树突状细胞,荧光显微镜可见大量GFP蛋白表达,阳性细胞达50%,流式细胞术检测到CCR7蛋白表达,LV-CCR7基因修饰的未成熟树突状细胞仍保持在未成熟状态。结果证实,实验成功构建携带小鼠CCR7基因绿色荧光慢病毒载体LV-CCR7,并可在未成熟树突状细胞细胞中表达。     

慢病毒介导的B区缺失的人凝血因子Ⅷ在NOD/SCID小鼠中的持续表达

近年来,基因治疗作为一种新的治疗方法给血友病A的治疗提供了新的思路.本研究旨在探讨在体外和NOD/SCID小鼠中应用慢病毒载体介导的血友病A基因疗法的可能性.构建含有B区缺失的人凝血因子Ⅷ(BDDhFⅧ)基因和IRES-eGFP编码序列的慢病毒表达载体pXZ9/BDDFⅧ.通过3质粒共转染293FT包装细胞,包装后感染293FT,HLF,Chang-liver和人骨髓间充质干细胞.在感染后分别通过酶联免疫吸附试验(ELISA),一期法,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和聚合酶链反应(PCR)法检测凝血因子Ⅷ(FⅧ)活性,FⅧ抗原,FⅧ的mRNA转录和基因整合情况.超速离心收集病毒颗粒,并通过门静脉注射感染NOD/SCID小鼠.ELISA分析小鼠血浆FⅧ抗原,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,转导后1个月RT-PCR分析小鼠肝脏人FⅧ的转录情况.结果表明:成功制备高浓度的重组慢病毒,并能在体外高效转导靶细胞.感染后72 h能检测到高水平的FⅧ活性和FⅧ抗原.RT-PCR和PCR法能敏感检测到人FⅧ基因特录和整合至感染后的细胞中.在所有接受重组慢病毒颗粒注射后的NOD/SCID小鼠肝脏中均能检测到人FⅧ基因的转录,同时重组慢病毒也能在体内高效转导小鼠肝细胞.在感染后72 h小鼠血浆中人FⅧ水平为(49±6) mU,1周后为(54±8) mU,1个月后为(23±4) mU.结论:携带BDDhFⅧ基因的慢病毒颗粒在体内外能高效转导靶细胞,且所有被转导的靶细胞都能有效的分泌人FⅧ.经过门静脉注射慢病毒颗粒的NOD/SCID小鼠可以持续表达人FⅧ.     

趋化因子受体7基因绿色荧光慢病毒载体构建及在未成熟树突状细胞中的表达

背景:趋化因子受体7(chemokine receptor-7,CCR7)是树突状细胞从外周迁移至淋巴系统发挥作用的最重要的启动和调节者,但未成熟树突状细胞表面不表达CCR7,因此利用携带CCR7基因的未成熟树突状细胞可以更好地诱导免疫耐受。目的:构建携带小鼠CCR7基因的绿色荧光蛋白重组慢病毒载体,观察其在未成熟树突状细胞中的表达。方法:采用RT-PCR扩增小鼠CCR7基因并克隆至pCR-Blunt载体。将CCR7DNA片段及IRES-GFP连入慢病毒转移质粒LV-Lac,生成重组慢病毒质粒LV-CCR7。采用脂质体转染法将慢病毒系统3质粒(重组慢病毒质粒LV-CCR7、包装质粒ΔNRF及包膜质粒pVSVG)共转染包装慢病毒,重组慢病毒感染未成熟树突状细胞,光学显微镜观察细胞状态,流式细胞术鉴定CCR7蛋白的表达。结果与结论:实验成功扩增出小鼠CCR7DNA片段并克隆至pCR-Blunt载体,亚克隆构建慢病毒表达载体LV-CCR7,经3质粒包装系统感染293FT细胞后,24h于荧光显微镜下均观察到绿色荧光蛋白阳性表达,病毒滴度为108U/L以上,获得携带CCR7基因的重组慢病毒。慢病毒颗粒可有效感染未成熟树突状细胞,荧光显微镜可见大量GFP蛋白表达,阳性细胞达50%,流式细胞术检测到CCR7蛋白表达,LV-CCR7基因修饰的未成熟树突状细胞仍保持在未成熟状态。结果证实,实验成功构建携带小鼠CCR7基因绿色荧光慢病毒载体LV-CCR7,并可在未成熟树突状细胞细胞中表达。     

CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞的诱导培养及鉴定

背景:新近发现CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞在参与免疫负向调控机制和临床治疗上有潜在的意义。目前对于健康人骨髓来源的调节性树突状细胞的体外诱导培养及鉴定的研究较少。目的:体外培养正常人骨髓来源的具有CD11clowCD45RBhigh表型的调节性树突状细胞,从细胞形态、免疫表型、吞噬功能及刺激T淋巴细胞增殖能力等方面对其进行鉴定。方法:分离正常人骨髓单个核细胞分别在不同的培养体系中进行体外诱导培养,实验分3组:①调节性树突状细胞组,在含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素10,转化生长因子β1的1640培养基中培养7d后,用脂多糖刺激24h。②未成熟树突状细胞组,用含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素4的1640培养基培养8d。③成熟树突状细胞组,用含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素4的1640培养基培养7d后,予脂多糖刺激24h,使其成熟。光镜和扫描电镜观察树突状细胞的形态,流式细胞仪检测其免疫表型以及吞噬能力,CCK-8法检测其刺激异基因淋巴细胞增殖能力。结果与结论:①人骨髓源单个核细胞在联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,白细胞介素10,转化生长因子β1培养8d后获得的细胞具有调节性树突状细胞的典型特征和免疫表型,说明该实验建立的培养调节性树突状细胞的方法是切实可行的。②CD11clowCD45RBhigh调节性树突状细胞这种新亚群具有较强的吞噬能力,刺激T淋巴细胞增殖的能力较弱,为调节性树突状细胞诱导免疫耐受的进一步研究奠定实验基础。     

被动型Heymann肾炎脂质过氧化损伤及谷胱甘肽的防治作用

作为人类膜性肾炎的动物模型之一———被动型Ｈｅｙｍａｎ肾炎（ｐａｓｉｖｅＨｅｙｍａｎｎｎｅｐｈｒｉｔｉｓ，ＰＨＮ），其病理过程中动态测定脂质过氧化物少见报告。本实验在复制大鼠ＰＨＮ模型后检测了大鼠血清及肾皮质匀浆中的超氧化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄ...     

小鼠异基因造血干细胞移植中清髓照射对供者来源内皮祖细胞归巢的影响

目的 研究异基因造血干细胞移植预处理因素--清髓照射对供者来源内皮祖细胞(EPCs)归巢的影响. 方法 密度梯度离心和差速贴壁法获取小鼠骨髓单个核细胞,EGM-2培养基培养,5～7 d检测CD133+CD31+CD45low表面标记及吸食Dil-Ac-LDL和结合FITC-UEA-1鉴定,并行羟基荧光素=醋酸盐琥珠酰亚胺酯(CFSE)标记.实验分组:正常组,正常+EPCs移植组,照射组,照射+EPCs移植组.流式细胞术(FCM)分析外周血、脾脏和骨髓中内皮细胞(ECs)、EPCs和CFSE阳性细胞比例;病理、电镜和免疫荧光分析各组织的损伤情况及CFSE标记EPCs的分布. 结果 流式细胞术鉴定内EPCs为CD45lowCD133+CD31+;Dil-ac-LDL+、FITC-UEA-1+.照射后短时间内循环中ECs即开始升高,第5 d达高峰,持续到第7 d,与正常组相比差异有统计学意义 (P<0.05);循环中EPCs照射后短时间内也增加,于第4 d达到峰值,随后下降至正常水平,其增加与正常组相比差异有统计学意义 (P<0.05).照射后3 d光镜下肝脏弥漫性的炎症浸润,小肠大量炎症细胞浸润;电镜下肝脏中血小板聚集到内皮下暴露的胶原上,小肠中ECs和基底膜间被损坏.照射+EPCs移植组,荧光显微镜下观察,移植后3 h见CFSE阳性细胞归巢至损伤的肝脏和小肠,细胞少且不连续; 36 h细胞较多,且呈连续性.结论 移植预处理中的清髓照射可引起严重的内皮损伤, 该损伤启动了EPCs的动员,并驱动外源性EPCs归巢至损伤比较重的组织中.     

猪伴侣蛋白10基因克隆和鉴定

目的克隆猪伴侣蛋白 10 (chaperonin 10 ,cpn10 )基因并比较其在不同种属间的序列同源性。方法利用抑制消减杂交技术 (SSH)、DNA序列测定技术、表达序列标记 (EST)拼接技术、生物信息学分析、RT -PCR等进行研究。结果首次成功获得全长的猪cpn10cDNA序列。与人、牛、大鼠、小鼠的cpn10相比 ,在核苷酸水平上的同源性分别为 94 %、94 %、88%、88% ,在氨基酸水平上的同源性分别为 10 0 %、10 0 %、99%、96 %。功能区分析发现 ,猪cpn10蛋白由 10 2氨基酸组成 ,分子量为 10 930 .97,等电点为 8.90 ,无N端信号肽序列 ,C端无核定位信号 (NLS)。RT -PCR结果显示 ,在未灭活补体人血清 (C -HS)作用下 ,猪内皮细胞cpn10基因表达上调。结论cpn10是进化上高度保守的基因 ,可能与猪到人异种移植排斥反应相关。     

小鼠造血干细胞移植后移植物抗宿主病与内皮细胞损伤的关系

目的 探讨异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病(GVHD)与内皮细胞损伤的关系.方法 以C57BL/6小鼠为供者、Balb/c小鼠为受者,分4组进行异基因造血干细胞移植,每组受者15只:对照组(仅输入磷酸盐缓冲液)、单纯骨髓移植组(仅输入骨髓单个核细胞)、GVHD组(输入骨髓单个核细胞和脾细胞)、GVHD减轻组(在GVHD组基础上加用环孢素A).分别于移植后不同时间观察受者的表现,检测外周血中内皮细胞及组织病理学变化.结果 术后第5天,各组受者均无典型的GVHD表现及组织病理学改变;术后第9天,GVHD组受者出现明显的GVHD的表现及病理学改变,并于15 d内全部死亡.术后第5天,单纯移植组、GVHD组和GVHD减轻组受者的外周血中内皮细胞数分别为(11.51±7.40)、(7.34±1.26)和(7.36±0.16)个/μl,三组间差异均无统计学意义(P＞0.05);术后第9天,内皮细胞数分别为(10.49±5.61)、(153.64±35.35)及(47.82±4.69)个/μl,三组间差异均有统计学意义(P＜0.05).术后第5天,单纯移植组、GVHD组、GVHD减轻组受者GVHD靶器官组织病理学评分分别为3.33±0.58、4.33±1.53及4.0±1.73,三组间差异均无统计学意义(P＞0.05);术后第9天,评分分别为3.33±1.15、10.0及4.33±0.58,三组间差异均有统计学意义(P＜0.05);术后第14天,评分分别为2.33±1.25、10.33±2.58和3.33±1.15,三组间差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 GVHD的发生再次引起内皮的损伤,同时损伤的内皮加重了GVHD.

Abstract：

Objective To study the relationship between graft-versus-host disease (GVHD) and endothelium injury following hematopoietic stem cells transplantation in mice. Methods C57BL/6 mice as donors and Balb/c mice as recipients were randomly divided into 4 groups: control group, bone marrow transplantation group, GVHD group, GVHD mitigation group. The clinical manifestations,circulating endothelial cells and tissue pathological changes were observed at different time points after transplantation. Results No manifestations of GVHD were found in each group at the day 5, while those were found in GVHD group at the day 9 and all died within 15 days. The counts of endothelial cells in peripheral blood showed no significant difference at the day 5 between GVHD group (7. 34 ±1.26 cells/μl) and bone marrow transplantation group (11.51 ± 7. 40 cells/μl) or GVHD mitigation group (7. 36 ± 0. 16 cells/μl), while among three groups there was statistically significant difference at the day 9 (GVHD group: 153. 64 ± 35. 35 cells/μl vs bone marrow transplantation group: 10. 49 ±5. 61 cells/μl and GVHD mitigation group: 47. 82 ± 4. 69 cells/μl). The scores of pathological aGVHD had no significant difference at the day 5 between GVHD group (4. 33± 1. 53) and bone marrow transplantation group (3. 33 ± 0. 58) or GVHD mitigation group (4. 00 ± 1.73), while among three groups there was statistically significant difference at the day 9 (GVHD group: 10. 0 vs bone marrow transplantation group: 3. 33 ± 1.15 or GVHD mitigation group: 4. 33 ± 0. 58) and at the day 14 (GVHD group: 10. 33 ± 2. 58 vs bone marrow transplantation group: 2. 33 ± 1.25 or GVHD mitigation group 3. 33 ± 1.15). Conclusion Occurrence of GVHD causes endothelial damage again and injured endothelium worsens the GVHD.