乙型肝炎病毒纯合子转基因小鼠(adr 1.2)的培育

目的：通过遗传学育种使外源基因整合位点随机的HBV转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠。方法：产生founder小鼠以后,将正常小鼠与转基因小鼠交配,通过PCR,Dot-blotting,Southern-blotting等方法检测 HBV DNA在转基因小鼠体内的整合状况,阳性率达50％左右后,进行近亲交配。结果：共得到了7代HBV转基因小鼠,其中包含有整合HBV基因纯合子的转基因小鼠。结论：外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,并得到了整合有HBV基因的纯合子转基因小鼠。 目的：通过遗传学育种使外源基因整合位点随机的HBV转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠。方法：产生founder小鼠以后,将正常小鼠与转基因小鼠交配,通过PCR,Dot-blotting,Southern-blotting等方法检测 HBV DNA在转基因小鼠体内的整合状况,阳性率达50％左右后,进行近亲交配。结果：共得到了7代HBV转基因小鼠,其中包含有整合HBV基因纯合子的转基因小鼠。结论：外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,并得到了整合有HBV基因的纯合子转基因小鼠。 目的：通过遗传学育种使外源基因整合位点随机的HBV转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠。方法：产生founder小鼠以后,将正常小鼠与转基因小鼠交配,通过PCR,Dot-blotting,Southern-blotting等方法检测 HBV DNA在转基因小鼠体内的整合状况,阳性率达50％左右后,进行近亲交配。结果：共得到了7代HBV转基因小鼠,其中包含有整合HBV基因纯合子的转基因小鼠。结论：外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,并得到了整合有HBV基因的纯合子转基因小鼠。     

转人组织蛋白酶K基因小鼠的Southern杂交鉴定

目的用地高辛标记探针的方法进行Southern杂交，以检测转人组织蛋白酶K基因小鼠外源DNA的整合情况，筛选携带目的基因的阳性小鼠。方法用地高辛标记探针的方法，对转人组织蛋白酶K基因小鼠(FD代)及首建阳性鼠与野生型ICR小鼠交配产生的F1代进行Southern杂交，对F0代和F1代进行筛选。结果经显微注射法，共获得25只转基因小鼠，通过Southern杂交鉴定，1只为阳性，阳性率为4％；对PCR阳性的F1代小鼠35只进行Southern杂交，结果全部为阳性。结论外源基因(人Cathepsin K基因)已整合到小鼠的染色体上，并且能够遗传。     

转人组织蛋白酶K基因鼠系的PCR检测

目的用PCR技术检测转人组织蛋白酶K基因鼠系,筛选携带目的基因的阳性小鼠。方法用PCR技术,对显微注射后出生的转人组织蛋白酶K基因小鼠、首建鼠的F1、F2、F3及F2代与野生型ICR小鼠的回交后代进行检测。结果共检测显微注射后出生的小鼠25只,阳性为1只,阳性率为4%;检测F1、F2、F3代小鼠分别为60、77和69只,阳性仔鼠数为35、56和63只,阳性率分别为550%、727%和913%;对回交后代进行检测,未见纯合的F2代小鼠。结论外源基因(人组织蛋白酶K基因)已经整合到小鼠的染色体上,并且按孟德尔遗传定律中的分离定律进行遗传。     

LRP16转基因小鼠的繁殖与鉴定

目的：繁殖和鉴定携带有外源LRP16基因的转基因小鼠,为体内研究LRP16的生物学功能提供动物模型。方法首先将构建好的LRP16转基因重组质粒转染到293T细胞,鉴定该质粒是否可以有效表达目的蛋白,随后利用原核显微注射方法将线性化的重组质粒注射入品系为FVB的小鼠受精卵中,获得F0代小鼠。应用PCR方法对F0代小鼠进行鉴定,并将阳性F0代小鼠继续繁殖。结果 LRP16转基因重组质粒在293T细胞中可以有效表达,经PCR鉴定获得3只阳性F0代小鼠,阳性率为6.23%,选取其中1只整合有LRP16基因的F0代雄鼠,通过其与野生型FVB小鼠杂交获得7只F1代子鼠,其中4只为阳性鼠,阳性率为57.14%。从F1代中再次选取其中1只阳性雄鼠与野生型小鼠杂交繁殖获得5只F2代子鼠,PCR鉴定结果显示2只为阳性,阳性率为40%。结论 LRP16基因成功整合到小鼠基因组中,并且能够稳定遗传,为后续在动物整体水平研究LRP16的功能奠定了基础。     

用精原细胞介导法制备乙肝病毒X基因转基因小鼠的实验研究

目的：探讨精原细胞介导法制备乙肝病毒X基因转基因小鼠的可行性。方法：构建乙肝病毒X基因表达载体pcDNA3-X;应用微量注射针将脂质体包裹的pcDNA3-X表达载体直接注入C57BL／6N雄性小鼠睾丸的曲细精管内，于第一次注射后6周，与雌鼠交配，用PCR法和免疫组化法检测仔鼠基因组中的外源DNA和肝组织中表达的pX蛋白。结果：测序结果与文献报道一致，并且X基因在Hela细胞中表达；共产仔鼠16只，其中1只为阳性仔鼠，阳性率为6．25％。结论：初步证明用精原干细胞介导法制备X基因转基因小鼠是可行的。     

庚型肝炎病毒全基因转基因小鼠的制备与遗传

目的：利用显微注射方法产生整合庚型肝火病毒（HGV）全基因的转基因小鼠，并研究HGV基因的遗传特性。方法：将含有HGV全长基因的载体线性化后，将目的基因DNA溶于显微注射用缓冲液，依常规方法进行显微注射，得到仔鼠后用PCR及基因组DNA Southern印迹法鉴定。阳性小鼠即为建立者（founder)上鼠，将founder小鼠与正常小鼠交配得到1代小鼠，随后将F1代阳性鼠与正常小鼠交配得到F2代小鼠。结果：共得到5只founder小鼠，其中4只与正常小鼠交配，得到F1代小鼠共41只，其中29只为阳性，阳性率为71％。F2代小鼠共21只，其中16只为阳性，阳性率为76％。结论：得到了整合有HGV全长基因的转基因小鼠，并证明HGV基因可以在转基因小鼠体内稳定传递。     

人SR-AI转基因小鼠遗传与繁育的研究

目的探讨被转入的人SR-AI基因的整合与复制情况及其对小鼠繁育的影响.方法采用类似系祖建系的方法,对人SR-AI转基因小鼠的2、3534、3560、3638、3639五个系列进行了繁育.并用PCR和Southermblot的方法,检测五个系列小鼠尾组织的DNA样品.结果五个系列小鼠共产仔431只,PCR检出阳性小鼠178只,阳性率为41.2%.在3639系的F1、F2、F3代及纯合子转基因鼠中PCR阳性率分别为47.8%、71.3%、75%和100%.结论人SR-AI基因在子代鼠中能稳定遗传,且对生殖和发育无明显影响.     

TNNI2突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNI2突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-tnni2转基因构件，TNNI2基因的第175个氨基酸缺失，通过原核显微注射法。把线性化、纯化后的外源基因pEGFP-tnni2注射入BDF1小鼠受精卵中。胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠，获得子代小鼠。用PCR和Southern方法检测子代鼠尾DNA鉴定基因型。通过RT-PCR方法检测tnni2基因表达。结果移植注射胚胎115枚给4只假孕小鼠共出生了23只后代鼠。经PCR和Southern方法检测得到4只阳性小鼠。对其子代进行RT-PCR检测，tnni2基因在肌肉、心脏内表达。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-tnni2（TNNI2基因的第175个氨基酸缺失）在小鼠基因组中得到整合，建立了转pEGFP-tnni2的转基因小鼠模型。     

Plunc序列启动子转基因小鼠模型的建立

目的 利用携带有鼻咽组织相对特异性启动子plunc构建的载体建立转基因动物模型。方法 将plunc—EGFP质粒用XhoI酶切线性化，胶回收线性化片段，稀释浓度4μg／ml。采用显微注射法将外源基因注射入小鼠受精卵细胞内。结果 产13只小鼠。PCR检测基因整合，其中阳性12只，阳性率92．30％；Southernblot检测阳性3只，阳性率23％。结论 鼻咽组织相对特异性启动子plunc可有效地将外源基因整合入小鼠体内。     

共刺激分子配体B7-DC转基因小鼠模型的建立

目的建立共刺激分子配体B7-DC转基因小鼠模型。方法利用RT-PCR方法从来自小鼠胸腺的mRNA中扩增出B7-DC cDNA,继而将B7-DC基因插入到真核表达载体PEF6/V5-His中得到含B7-DC和V5-His融合蛋白的PEF6-B7-DC/V5-His。注射外源基因PEF6-B7-DC/V5-His至FVB小鼠原核,注射胚胎移植到同期发情的假孕受体,所生仔鼠经PCR和Southem-blot检测获得阳性转基因小鼠。结果共注射移植胚胎87枚,出生小鼠39只,检测出阳性小鼠3只,并稳定遗传至F2代。结论成功建立了B7-DC转基因小鼠模型。     

fat-1转基因小鼠的构建与鉴定

目的构建和鉴定携带有外源fat-1基因的转基因小鼠。方法将fat-1基因的cDNA与动物表达载体pEF—neo连接，构建pEF-fat-1重组质粒，酶切、测序鉴定正确后，以显微注射法把线性化重组质粒注射到小鼠受精卵的雄原核中，并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中产出转基因小鼠，通过PCR、Southern blot杂交等方法确立阳性整合有目的基因的G0代小鼠。结果成功构建了pEF-fat-1重组质粒，将其显微注射到小鼠受精卵中，得到G0代小鼠，PCR、Southern blot杂交确立了4只整合有fat-1基因的首建鼠。结论fat-1基因可整合到小鼠体内，得到的转基因小鼠为研究fat-1基因的生物学功能提供了动物模型。     

两种含SV40T不同区段的基因构建及其转基因小鼠的建立

目的　为解决SV4 0T转基因小鼠高发瘤难保种的问题 ,构建了两种含有SV4 0T不同区段的外源基因 :Rb结合域点突变的SV4 0T基因 (SV4 0T DRb)和无p5 3结合域的SV4 0T基因 (SV4 0T Dp5 3)。方法　利用分子生物学的基因克隆手段 ,将改造的SV4 0T基因片段克隆测序 ,最终将这两个改造后的基因克隆进乳腺特异性的真核表达载体p2 0 5C3中 ,运用雄原核显微注射法制备转基因小鼠。结果　利用PCR方法检测出 6只双阳性转基因 (同时检测到SV4 0T DRb和SV4 0T Dp5 3两种基因 )小鼠 ,为避免检测结果中假阳性的发生 ,应用Southern blot方法检测出 1只双阳性转基因小鼠。结论　本试验的结果证明 ,构建的两种含SV4 0T不同区段的策略是成功的 ,其建立的阳性转基因小鼠确实是弱化了SV4 0T转基因小鼠高发瘤的特性。     

人bcl-xL基因在转基因小鼠中的整合和表达

目的研究人bcl—xL基因在显微注射所产生的子代小鼠中的整合、转录和表达情况。方法采用PCR和Southern blot方法检测人bcl—xL基因在小鼠体内的整合；RT—PCR方法检测它们的bcl—xL mRNA水平；用Western blot及免疫组化法检测目的蛋白的表达情况。结果在显微注射所产生的转基因小鼠中，有4只为Southern blot检测阳性，并且在这4只小鼠及其子代中均检测到人bcl—xL的mRNA和过表达的目的蛋白。结论由于在这些小鼠中既有外源基因的整合，又有其mRNA和蛋白质的表达，所以，它们是真正的转基因动物。     

纯合子NEOr转基因小鼠品系的建立及鉴定

目的　建立清洁级Neor 转基因小鼠纯合子品系。方法　通过胚胎移植生物净化方法获得 1 0只清洁级NeorF1 小鼠 ,按孟德尔遗传法则交配 ,用PCR、Southernblot杂交和交配实验检测相结合的方法筛选纯合子。结果　选育出 4只纯合子 ,并建系。该纯合转基因小鼠与野生型小鼠交配制备的胎儿成纤维细胞具有G4 1 8抗性 ,可作为ES细胞基因打靶培养中的饲养层细胞。结论　通过微生物学和遗传学上对Neor 转基因小鼠进行质量控制 ,使Neor 转基因小鼠达到了清洁级 ,并建立纯合子品系。     

实时荧光定量PCR法检测转基因小鼠拷贝数

目的利用实时荧光定量PCR法鉴定转基因小鼠外源基因插入拷贝数。方法以TG-CARK转基因首见鼠为研究对象,选取小鼠的高度保守基因Fabpi为内参,利用绝对定量的实时荧光PCR法鉴定转基因小鼠拷贝数,并与传统的Southern blot方法的定量结果进行比较。结果实时定量PCR鉴定的转基因拷贝数与Southernblot法完全一致,三只TG-CARK首见小鼠的拷贝数分别为1,7,45。结论实时定量PCR技术具有高准确性、高稳定性、高通量和低成本的优点,是比传统杂交技术更好的鉴定小鼠转基因拷贝数的方法。     

严密型四环素调控系统调控的表达HCV-C基因双转基因小鼠模型的建立

目的 制备严密型四环素调控系统调控下表达丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-C)基因的双转基因小鼠,为进一步阐明核心蛋白Core与HCV感染所致的疾病以及与肝细胞癌发生的关系奠定基础.方法 严密型四环素调控部分(ApoE-rtTA-tTS)转基因阳性鼠和反应部分(TRE-HCV-C)转基因阳性鼠交配产生仔鼠,经PCR和Southcm blot分析筛选出阳性鼠.免疫组织化学检测HCV-C蛋白双转基因小鼠肝组织内表达情况及其肝脏的病理变化.结果 得到了2只携带有两种基因(tTS和HCV-C)的双转基因小鼠,成功制备了严密型四环素调控系统的HCV-C双转基因小鼠.结论 结果表明,所建立的严密型四环素调控系统在动物模型中是可行的和有效的,它消除了普通四环素调控系统存在的本底泄漏表达的缺点,是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具.     

5-脂氧化酶转基因小鼠模型的制备

目的研究SD大鼠两种繁殖方式对生产性能的影响,提供客观、科学的数据,为大鼠的规模化生产,选择合适的繁殖方法。方法在SPF级屏障设施饲养环境下,对SD大鼠的雌雄6：1循环交配法和雌雄1：1长期同居法进行比较对妊娠率、初生仔鼠重、平均窝产仔数、离乳仔鼠均重、离乳存活率和胎次间隔等生产性能指标的统计分析。结果SD大鼠两种不同繁殖方法的同胎次间的比较：离乳存活率呈极显著性差异（P〈0．01）;初生仔重,窝产仔数,离乳仔重,胎次间隔没有显著性差异（P〉0．05）。结论雌雄6：1循环交配法,可有效提高离乳存活率,提高种鼠的生产效率：同时,能有效控制动物种群数量和生产数量,适宜于大鼠的规模化生产。     

人突变型p53和EB病毒LMP1转基因小鼠的建立

目的：建立含突变型p53和EB病毒LMP1基因的双转基因小鼠模型，为研究突变型p53和EB病毒LMP1基因在鼻咽癌前病变中的交互作用提供有力的工具．方法：通过分子克隆技术构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1-p53mt；采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核中，然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管；取其产3wk龄子代鼠进行PCR初选，再通过Southern杂交进一步确证；利用HE染色法观察4mo龄转基因小鼠不同组织病理变化．结果：将转基因载体进行了707枚小鼠受精卵的显微注射，然后植入30只假孕母鼠的输卵管中，其中26只母鼠怀孕，移植成功率为86．67％；共出生子代鼠179只；PCR检测显示179只子代小鼠中有9只整合了p53mt和LMP1基因，转基因阳性小鼠比例为5．03％（9／179），Southem杂交结果进一步证实了9只基因组整合了外源基因的首建者小鼠；随机抽取其中的1只转基因阳性小鼠鼻腔黏膜、鼻咽、食管表现炎症，鼻咽黏膜上皮灶性增生．结论：成功建立整合人突变型p53和LMP1的转基因小鼠，且表现鼻咽黏膜上皮灶性增生，可为鼻咽癌前病变机制的研究提供手段．     

Establishment of transgenic mouse lineages containing copies of an integrated pSPORT1 plasmid

Themutationtestsystemoftransgenicmicehasbecomeoneofthecentersofintensivestudyinthefieldsofgeneticsandgcnotoxicsinrecentyears.ItnotonlyallowstheinductionofDNAdamage,repair,nlutagcncsisandcarcinogenesistobestudiedinoneanlnlalsystenl;butalsoprovidesanefficientanimalmodelforconlparativcstudiesofgenemutationsinvariousorgansandtissuesforthefirsttime.Thelanlhdaphagevector--based-/transgenlcmousellncagcs,suchasBigBI..(y?..dM.,.M....{qjh...beensuccessfullyappliedtothestudyofgenenlutatlonsI)]a)I~oan…