转人组织蛋白酶K基因鼠系的PCR检测

目的用PCR技术检测转人组织蛋白酶K基因鼠系,筛选携带目的基因的阳性小鼠。方法用PCR技术,对显微注射后出生的转人组织蛋白酶K基因小鼠、首建鼠的F1、F2、F3及F2代与野生型ICR小鼠的回交后代进行检测。结果共检测显微注射后出生的小鼠25只,阳性为1只,阳性率为4%;检测F1、F2、F3代小鼠分别为60、77和69只,阳性仔鼠数为35、56和63只,阳性率分别为550%、727%和913%;对回交后代进行检测,未见纯合的F2代小鼠。结论外源基因(人组织蛋白酶K基因)已经整合到小鼠的染色体上,并且按孟德尔遗传定律中的分离定律进行遗传。     

异种移植动物模型-转入CD59 cDNA首建小鼠的培育

目的：培育转人CD59cDNA首建小鼠，以进一步研究异种移植，并为建立鼠系奠定基础。方法：构建转基因结构pEGF-C1-OMT-CD59，限制性内切酶切除质粒载体，回收、纯化包括人CD59cDNA、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因及各自动启动子的约3.3kb的基因片段，用显微注射法将此片段注人小鼠受精卵，提取F0低小鼠尾组织DNA，用PCR法初选，再用Southern杂交对PCR阳性鼠进一步筛选，确定阳性转基因首建小鼠。结果：共注射590枚受精卵，移植于24只受体母鼠中，出生F0代小鼠73只；PCR初选有8只呈阳性（6♂：2♀），Southern杂交有2只呈阳性（1♂：1♀）；经粗略估算，整合外源基因拷贝数分别为3和10。结论：成功地培育出转人CD59cDNA首建小鼠，用PCR和Southern杂交法证实了外源片段的整合。     

异种移植动物模型-转人CD59 cDNA首建小鼠的培育

目的　培育转人CD5 9cDNA首建小鼠 ,以进一步研究异种移植 ,并为建立鼠系奠定基础。方法　构建转基因结构pEGFP -C1-OMT -CD5 9,限制性内切酶切除质粒载体 ,回收、纯化包括人CD5 9cDNA、绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein ,GFP)基因及各自启动子的约 3 .3kb的基因片段 ,用显微注射法将此片段注入小鼠受精卵 ;提取F0 代小鼠尾组织DNA ,用PCR法初选 ,再用Southern杂交法对PCR阳性鼠进一步筛选 ,确定阳性转基因首建小鼠。结果　共注射 5 90枚受精卵 ,移植于 2 4只受体母鼠中 ,出生F0 代小鼠 73只 ;PCR初选有 8只呈阳性(6♂∶2♀ ) ,Southern杂交有 2只呈阳性 (1♂∶1♀ ) ;经粗略估算 ,整合外源基因拷贝数分别为 3和 10。结论　成功地培育出转人CD5 9cDNA首建小鼠 ,用PCR和Southern杂交法证实了外源片段的整合     

人β2m转基因小鼠的制备、筛选及鉴定

目的:制备人β2m转基因小鼠,研究HLA-B2704的表达.方法:应用显微注射将人β2m基因注入C57BL/6×昆明鼠和昆明鼠×昆明鼠F1代受精卵,出生动物及其后代经PCR筛选,采用斑点杂交和Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本行进一步鉴定和测定整合拷贝数,利用RT-PCR检测阳性鼠中人β2m转基因的表达.结果:6只原代仔鼠及7只它们的下一代(F1)带有人β2m基因.由微注射基因后移卵出生的86只小鼠中,C57BL/6×昆明鼠杂交仔鼠35只,其中4只阳性(11.4%),昆明鼠×昆明鼠杂交仔鼠51只,其中2只阳性(3.9%),含有人β2m基因的原代鼠×昆明鼠杂交仔鼠20只,其中7只阳性.整合的转基因均为单拷贝.Southern杂交证实上述阳性鼠确有转基因整合.阳性鼠的皮肤、结肠、睾丸和脾脏组织中均有人β2m转基因mRNA的表达.结论:在转基因动物制备中,C57BL/6×昆明鼠F1代明显优于昆明鼠×昆明鼠F1代.与人HLA-B2704基因相比,人β2m基因不易整合,其整合率与整合拷贝数均较低.得到的人β2m转基因小鼠能够将人β2m基因传给下一代并可与人HLA-B2704转基因鼠交配.     

fat-1转基因小鼠的构建与鉴定

目的构建和鉴定携带有外源fat-1基因的转基因小鼠。方法将fat-1基因的cDNA与动物表达载体pEF—neo连接，构建pEF-fat-1重组质粒，酶切、测序鉴定正确后，以显微注射法把线性化重组质粒注射到小鼠受精卵的雄原核中，并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中产出转基因小鼠，通过PCR、Southern blot杂交等方法确立阳性整合有目的基因的G0代小鼠。结果成功构建了pEF-fat-1重组质粒，将其显微注射到小鼠受精卵中，得到G0代小鼠，PCR、Southern blot杂交确立了4只整合有fat-1基因的首建鼠。结论fat-1基因可整合到小鼠体内，得到的转基因小鼠为研究fat-1基因的生物学功能提供了动物模型。     

异种肝移植转基因小鼠模型的建立

目的 通过显微注射法产生用于异种移植研究的表达人CD59蛋白的转基因小鼠模型。方法 实验中利用OMT作为目的基因hCD59cDNA的启动子，CMV作为报告基因GFP的启动子，构建重组质粒pGOC。通过显微注射法，把CMV—GFP—OMT-CD59基因片断注射入昆明种白小鼠受精卵。结果 产生出86只F0代转基因小鼠。鼠尾基因组DNA经PCR法检测，12只阳性，进一步用Southern blot法检测1只阳性。结论 通过显微注射法，外源基因hCD59cDNA在小鼠基因组中得到整合，产生出了阳性转人CD59蛋白基因小鼠，可用于进一步异种移植研究。     

hApoE7转基因小鼠纯合子的培育和鉴定

目的：载脂蛋白E(apoE)是血浆中参与脂质代谢的重要蛋白质，并且与迟发型早老性痴呆(AD)相关。为从整体水平研究人突变ApoE基因剂量与效应的关系，我们拟培育C57BL/6-hApoE7纯合子转基因小鼠。方法：将经Southern杂交鉴定为阳性的F1代小鼠进行互配，仔代经PCR初筛，再行Southern杂交鉴定，杂交结果经扫描定量分析以确定hApoE7基因整合的拷贝数，纯合子小鼠的拷贝数为杂合子的两倍。经此法鉴定的纯合子小鼠与正常C57 BL/6小鼠进行侧交以进行进一步的鉴定。结果：Southern杂交鉴定出F1代转基因小鼠6只，F2代转基因小鼠7只，其中纯合子3只。将所得到的纯合子小鼠与正常的C57 BL/6小鼠交配，仔代鼠经PCR鉴定结果全部为阳性。结论：通过培育C57 BL/6-hApoE7纯合子转基因小鼠，发现人ApoE7基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传，转基因的遗传特征符合常染色体单位点整合。     

LRP16转基因小鼠的繁殖与鉴定

目的：繁殖和鉴定携带有外源LRP16基因的转基因小鼠,为体内研究LRP16的生物学功能提供动物模型。方法首先将构建好的LRP16转基因重组质粒转染到293T细胞,鉴定该质粒是否可以有效表达目的蛋白,随后利用原核显微注射方法将线性化的重组质粒注射入品系为FVB的小鼠受精卵中,获得F0代小鼠。应用PCR方法对F0代小鼠进行鉴定,并将阳性F0代小鼠继续繁殖。结果 LRP16转基因重组质粒在293T细胞中可以有效表达,经PCR鉴定获得3只阳性F0代小鼠,阳性率为6.23%,选取其中1只整合有LRP16基因的F0代雄鼠,通过其与野生型FVB小鼠杂交获得7只F1代子鼠,其中4只为阳性鼠,阳性率为57.14%。从F1代中再次选取其中1只阳性雄鼠与野生型小鼠杂交繁殖获得5只F2代子鼠,PCR鉴定结果显示2只为阳性,阳性率为40%。结论 LRP16基因成功整合到小鼠基因组中,并且能够稳定遗传,为后续在动物整体水平研究LRP16的功能奠定了基础。     

异种肝移植模型-转入CD59蛋白基因小鼠的建立

目的 通过显微注射法产生用于异种移植研究的表达人CD59蛋白的转基因小鼠模型。方法 实验中利用OMT作为目的基因hCD59 cDNA的启动子．CMV作为报告基因GFP的启动子．构建重组质粒pGOC。通过显微注射法，把CMV-GFP-OMT-CD59基因片断注射入昆明白小鼠受精卵。结果 产生出86只F0代转基因小鼠。鼠尾基因组DNA经PCR法检测，12只阳性．进一步用Southern blot法检测1只阳性。结论 通过显微注射法，外源基因hCD59 cDNA在小鼠基因组中得到整合，产生出了阳性转人CD59蛋白基因小鼠。可用于进一步异种移植研究。     

血管内皮细胞组织特异性表达人CD59基因转基因小鼠传代及表达检测

探讨外源基因在转基因动物中的遗传规律。方法：将血管内皮细胞组织特异性表达人CD59基因转基因昆明种雄性小鼠，与普通昆明种雌性小鼠交配。Southern-blot杂交确定子一代外源基因整合阳性转基因小鼠。RT-PCR方法用于子一代转基因小鼠人CD59转录水平筛选。以流式细胞术检测人CD59基因在子一代转基因小鼠蛋白质水平表达。结果：产子14只。7只外源基因整合阳性，其中雄性4只，雌性3只。转录水平检测发现3只出现所需的条带。继而对上述3只转录水平阳性的F1代小鼠白细胞行流式细胞术检测，白细胞膜表面人CD59表达均阳性。结论：转基因动物的遗传规律复杂，基因沉默可能是导致子代转基因动物不表达的重要因素。     

严密型四环素调控系统调控的表达HCV-C基因双转基因小鼠模型的建立

目的 制备严密型四环素调控系统调控下表达丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-C)基因的双转基因小鼠,为进一步阐明核心蛋白Core与HCV感染所致的疾病以及与肝细胞癌发生的关系奠定基础.方法 严密型四环素调控部分(ApoE-rtTA-tTS)转基因阳性鼠和反应部分(TRE-HCV-C)转基因阳性鼠交配产生仔鼠,经PCR和Southcm blot分析筛选出阳性鼠.免疫组织化学检测HCV-C蛋白双转基因小鼠肝组织内表达情况及其肝脏的病理变化.结果 得到了2只携带有两种基因(tTS和HCV-C)的双转基因小鼠,成功制备了严密型四环素调控系统的HCV-C双转基因小鼠.结论 结果表明,所建立的严密型四环素调控系统在动物模型中是可行的和有效的,它消除了普通四环素调控系统存在的本底泄漏表达的缺点,是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具.     

庚型肝炎病毒全基因转基因小鼠的制备与遗传

目的：利用显微注射方法产生整合庚型肝火病毒（HGV）全基因的转基因小鼠，并研究HGV基因的遗传特性。方法：将含有HGV全长基因的载体线性化后，将目的基因DNA溶于显微注射用缓冲液，依常规方法进行显微注射，得到仔鼠后用PCR及基因组DNA Southern印迹法鉴定。阳性小鼠即为建立者（founder)上鼠，将founder小鼠与正常小鼠交配得到1代小鼠，随后将F1代阳性鼠与正常小鼠交配得到F2代小鼠。结果：共得到5只founder小鼠，其中4只与正常小鼠交配，得到F1代小鼠共41只，其中29只为阳性，阳性率为71％。F2代小鼠共21只，其中16只为阳性，阳性率为76％。结论：得到了整合有HGV全长基因的转基因小鼠，并证明HGV基因可以在转基因小鼠体内稳定传递。     

人乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立

目的 建立人乙型肝炎病毒ｘ（ＨＢｘ）基因转基因小鼠模型。方法 用显微注射法制备转基因小鼠,用分子杂交法鉴定转基因小鼠ＨＢｘ的整合与表达。结果 建立了人ＨＢｘ的基因转基因小鼠模型。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定得到１７只转基因首建鼠。逢肝脏提取总ＲＮＡ进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交,结果显示１７只首建鼠肝脏中均有ＨＢｘ表达。结论 为从整体水平研究慢性乙肝炎患者诱发肝癌的作用机制及ＨＢｘ的反式激活作用机制提供了     

人bcl-xL基因在转基因小鼠中的整合和表达

目的研究人bcl—xL基因在显微注射所产生的子代小鼠中的整合、转录和表达情况。方法采用PCR和Southern blot方法检测人bcl—xL基因在小鼠体内的整合；RT—PCR方法检测它们的bcl—xL mRNA水平；用Western blot及免疫组化法检测目的蛋白的表达情况。结果在显微注射所产生的转基因小鼠中，有4只为Southern blot检测阳性，并且在这4只小鼠及其子代中均检测到人bcl—xL的mRNA和过表达的目的蛋白。结论由于在这些小鼠中既有外源基因的整合，又有其mRNA和蛋白质的表达，所以，它们是真正的转基因动物。     

人SR-AI转基因小鼠遗传与繁育的研究

目的探讨被转入的人SR-AI基因的整合与复制情况及其对小鼠繁育的影响.方法采用类似系祖建系的方法,对人SR-AI转基因小鼠的2、3534、3560、3638、3639五个系列进行了繁育.并用PCR和Southermblot的方法,检测五个系列小鼠尾组织的DNA样品.结果五个系列小鼠共产仔431只,PCR检出阳性小鼠178只,阳性率为41.2%.在3639系的F1、F2、F3代及纯合子转基因鼠中PCR阳性率分别为47.8%、71.3%、75%和100%.结论人SR-AI基因在子代鼠中能稳定遗传,且对生殖和发育无明显影响.     

检测Cre位点特异重组酶活性的双报告转基因小鼠建立

目的建立用于检测Cre位点特异重组酶活性的双报告转基因小鼠.方法采用显微注射方法,将携带lacZ和人碱性磷酸酶(human alkaline phosphatase,hAP)报告基因的ZAP载体导入近交C57BL/6小鼠554枚受精卵;利用PCR,Southern blotting技术对其仔鼠进行基因整合鉴定;应用X-gal染色方法,对转基因小鼠胚胎进行转基因表达检测.结果存活的398枚受精卵被移入21只假孕受体小鼠输卵管;13只受体怀孕产下68只后代.合子存活率和出生率分别为71%(398/554)和17%(68/398).在68只小鼠中,5只雄性和4只雌性小鼠整合有双报告基因.转基因整合率和有效率分别为13%(9/68)和1.6%(9/554).9只首建鼠与正常C57 BL/6小鼠杂交产生F1代小鼠.F1代小鼠转基因的传递符合孟德尔规律,X-gal染色仅在3只首建鼠的13.5 d龄胚胎中观察到.结论检测Cre位点特异重组酶活性的双报告转基因小鼠已建立.     

人突变的载脂蛋白E对转基因小鼠学习与记忆能力的影响

目的 研究突变的人载脂蛋白Ｅ（ａｐｏＥ）对大脑皮层功能的影响。方法 以Ｆ１代ａｐｏＥ４与ａｐｏＥ７转基因小鼠为研究对象,分别用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹分析及ＥＬＩＳＡ检测人ａｐｏＥ基因在Ｆ１代小鼠染色体上的整合与在血中的表达;以主动回避实验检测小鼠的学习能力和短期与长期记忆能力的变化,同时用酶法测定Ｆ１代小鼠的血脂水平。结果 （１）人ａｐｏＥ４和ａｐｏＥ７基因稳定地整合于Ｆ１代小鼠染色体上并高效表达于     

PCR检测细粒棘球蚴及DIG标记DNA杂交诊断技术的建立

目的：该项研究旨在探讨聚合酶链反应（PCR）技术在细粒棘球蚴检测和诊断中的应用，同时建立Digoxinum(DIG）标记DNA杂交诊断技术。方法：根据细粒棘球蚴基因片断克隆与序列分析，设计了一对特异性引物，P15‘－GGAATGGAGAGAAGTTAC－3‘，P25’－GCAACCTCCGGAACTTGC－3’。以棘球蚴的囊液、子囊及原头蚴为模板，经PCR扩增获得471bp特异性区带。将扩增产物纯化后，用DIG标记DNA，制备成功特异性核酸探针并用于细粒棘球蚴检测。结果：经对大肠杆菌、痢疾杆菌、结核分枝杆菌、猪囊尾蚴、健康人白细胞进行PCR扩增和DIG标记DNA探针斑占交，只有细粒棘球蚴出现单一471bp特异性区带。PCR的灵敏性为可检出单个原头蚴及100-10fg水平的DNA，而斑点杂交的特异性为2500fg。异源性DNA即使提高点膜量，亦不呈现阳性反应。结论：配以DIG标记的PCR技术在细粒棘球蚴的检测中具有特异、敏感、快速、准确的特点。为包虫病的早期诊断和流行病学调查可提供科学依据。