endostatin基因重组腺病毒的构建及在人肺腺癌细胞的表达

目的 利用AdEasy系统构建鼠内皮抑素(ES)基因重组腺病毒Ad.ES,并观察其在人肺腺癌细胞SPCA-1的表达.方法 采用酶切、连接和转化等方法,将质粒pcDNA3.ES中的ES片段插入腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack.CMV,构建重组腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack.CMV.ES,经Pme Ⅰ酶切线性化后与含腺病毒基因骨架的质粒载体pAdEasy-1在细菌BJ5183内进行同源重组得到腺病毒质粒pAd.ES,重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切后,转染人胚肾293细胞包装成腺病毒颗粒Ad.ES,将病毒上清反复感染293细胞获得高滴度病毒,应用氯化铯(CsCl)梯度离心的方法纯化病毒,利用AdEasy系统上的绿色荧光蛋白(GFP)标签测定重组腺病毒的功能滴度.用2 MOI重组腺病毒Ad.ES体外转导SPCA-1细胞48h,流式细胞仪检测GFP表达阳性率,ELISA法测定细胞培养上清液中ES的含量.结果 双酶切证实重组腺病毒穿梭载体pAdTrack.CMV.ES质粒构建正确,卡那霉素抗性筛选和Pac Ⅰ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3d,约20%的细胞表达GEP,回收病毒重复感染293细胞,CsCl梯度离心纯化最终获得约5.6×1010TU/mL滴度的重组病毒.Ad.ES体外转导SPCA-1细胞48h后,细胞GFP阳性率为93%,细胞培养上清液中ES的含量较Ad.GFP感染组和阴性对照组明显增加(P＜0.05).结论 应用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和ES的重组腺病毒,Ad.ES体外感染人肺腺癌细胞SPCA-1可显著提高ES表达,为进一步研究抗血管生成治疗肺癌奠定了基础.     

重组表达乙肝病毒x蛋白的腺病毒构建及在HepG2细胞的表达

目的:构建重组表达HBx的腺病毒,并通过感染细胞建立HBx高表达的细胞模型。方法:首先将HBx基因插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack中,限制性酶切鉴定正确后将其用PmeⅠ酶切线性化,转到BJ5183感受态细菌进行同源重组,重组后的腺病毒载体pAd-HBx经PacⅠ酶切线性化后,转染到QBI-293A细胞中,根据EGFP的表达判断重组腺病毒的包装情况。RT-PCR鉴定重组腺病毒的HBx基因表达。根据GFP的表达检测病毒滴度和感染效率。将病毒感染人肝癌HepG2细胞,48h后收集裂解细胞,Westernblot检测HBx蛋白的表达。结果:重组腺病毒载体pAd-HBx经酶切鉴定确认构建成功。将pAd-HBx转染到QBI-293A细胞,荧光检测提示病毒获得成功包装,RT-PCR检测到细胞中HBx基因的表达。重组病毒感染人肝癌HepG2细胞,Westernblot检测到HBx蛋白表达。结论:成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒,感染肝癌HepG2细胞后检测到了HBx蛋白的表达,提示建立了HBx高表达的细胞模型,为后续的HBx的功能研究奠定了基础。     

HBx和mIL-12双基因重组腺病毒的构建

目的 构建携带双基因HBx和mIL-12的重组腺病毒Ad-HBx-mIL-12.方法 采用酶切、连接的方法分别将基因HBx和mIL-12连接到穿梭质粒载体pAdenoVator-CMV5.将构建正确的穿梭质粒pAdV-HBx-mIL-12经EcoR Ⅰ酶切线性化后,转化于含腺病毒骨架质粒pAdenoVatorΔE1/E3的BJ5183感受态细菌,实现细菌内同源重组.将鉴定正确的重组腺病毒质粒pAd-HBx-mIL-12经Pac Ⅰ酶切线性化后,以脂质体法转染至293细胞,包装并扩增获得携带双基因HBx和mIL-12的重组腺病毒Ad-HBx-mIL-12.结果 经鉴定携带HBx和mIL-12双基因的重组腺病毒构建成功,并可在293细胞中有效表达.结论 成功构建了携带双基因HBx和mIL-12的重组腺病毒Ad-HBx-mIL-12,为探讨其联合抗肿瘤机制及后续基因治疗奠定了基础.     

定点突变重组ING4腺病毒基因转染系统的载体构建及鉴定

目的重组构建hING4（人ING4）氨基酸序列。方法运用定点突变技术,在鼠ING4的基础上,设计两对突变引物P1、P2和P3、P4及全长ING4上下游引物P5、P6,通过四轮PCR,将mING4基因序列进行人源化改造,获得了编码hING4氨基酸的基因序列。将获得酶切目的基因片段,连接到转移载体pAdTrack—CMV上,形成重组转移载体pAdTrack—CMV—ING4。重组转移载体经PmeI酶切后与pAdEasy-1腺病毒载体在BJ5183大肠杆菌中同源重组,得到重组腺病毒载体DAdeasy-1-pAdTrack—CMV—ING4,经PacI酶切后脂质体转染QBI-293A包装细胞,获得重组腺病毒Ad—ING4。结果测序和RT—PCR结果表明hING4基因构建成功。结论hING4基因重组腺病毒载体构建成功。     

Ad-HBx的构建及在肾小球足细胞系的表达

目的 构建携带HBx基因的非复制型重组腺病毒载体,并感染小鼠肾小球足细胞株MPC5,使目的 基因HBx在该细胞株有效表达.方法 由质粒PCI-neo-HBx中扩增目的 基因HBx.插入至pShuttle-CMV(-)穿梭质粒中,而后再与pAdxsi质粒酶切连接为重组腺病毒质粒pAd-HBx,经酶切及测序鉴定正确后,以Pac Ⅰ酶切线性化转染293细胞进行包装扩增得到Ad-HBx.以Ad-HBx感染MPC5细胞,Western blot检测感染后目的 蛋白HBx的表达.结果 重组腺病毒载体经限制性内切酶酶切、电泳和基因测序鉴定,证实Ad-HBx构建成功;当MOI=50时.MPC5细胞即可100%被重组腺病毒感染,且持续至感染后72 h仍有较强水平的表达;感染Ad-HBx的MPC5细胞可稳定表达HBx蛋白.结论 成功构建了Ad-HBx,并能在MPC5细胞中稳定表达,为进一步研究HBx基因在乙型肝炎病毒相关性肾炎发病中的作用奠定了基础.     

重组人RAMP-1基因腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带人受体活性修饰蛋白-1（RAMP1）基因的腺病毒表达载体,为进一步深人研究RAMPl的功能奠定基础。方法通过基因工程技术将RAMP1基因克隆到穿梭质粒pShutde—GFP—CMV中;I-CeuI＋I—SceI双酶切穿梭质粒pShuttle—GFP—CMV—RAMPl,将回收的GFP-CMV—RAMP1片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒Ad—RAMP1并进行PCR鉴定及滴度测定。结果构建的重组穿梭质粒pShuttle—GFP—cMVl-RAMP1双酶切后,得到O．8kb（RAMP1）和5．1kb（pShuttle—GFP—CMV）两个片段;重组腺病毒质粒pAdxsi—GFP—CMV—RAMP1用XhoI酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒Ad—RAMP1 PCR鉴定可见阳性扩增条带;病毒滴度检测达4．5×10^11PFU／ml。结论成功构建了携带人RAMP1基因的重组腺病毒载体,为进一步研究RAMPl的功能研究奠定了基础。     

Betatrophin重组腺病毒过表达载体的构建

［摘要］目的: 应用基因同源重组技术,构建及鉴定携带小鼠betatrophin基因Gm6484(NM_001080940)的复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步研究betatrophin的功能奠定基础。方法: 根据基因库中登录的小鼠betatrophin基因Gm6484(NM_001080940)序列,经化学合成得到含BamHⅠ/ AgeⅠ酶切位点的小鼠betatrophin基因全长cDNA质粒,将其酶切后插入到带有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因的GV314载体CMV MCS 3FLAG SV40 EGFP中,得到重组病毒穿梭质粒pGV314 betatrophin;经BamHⅠ/ AgeⅠ双酶切后,与线性化的pDC315病毒基因组质粒体外同源重组,构建含有目的基因的腺病毒载体Ad betatrophin,酶切线性化重组腺病毒质粒后转染HEK293T细胞包装成重组病毒颗粒,经在HEK293T细胞反复扩增数代后,利用聚合酶链式反应（PCR）、蛋白质印迹法及测序鉴定重组的腺病毒。结果： 阳性克隆质粒Ad betatrophin在HEK293T细胞中成功包装出重组病毒,经PCR、蛋白质印迹及测序检测表明重组腺病毒包装成功。结论： 成功构建了携带小鼠betatrophin基因的复制缺陷型重组腺病毒过表达载体。     

miR-1腺病毒载体的构建及表达分析

目的构建并鉴定microRNA-1(miR-1)的腺病毒表达载体。方法 PCR扩增含大鼠miR-1前体的DNA片断,并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack。pAdTrack经PmeI酶切线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组。重组质粒pAdprecusor-miR-1线性化后,转染293A细胞,进行病毒包装,得到重组腺病毒颗粒Ad-miR-1。Ad-miR-1与Ad-GFP病毒转染培养的乳鼠心肌细胞,通过实时荧光定量PCR方法检测miR-1的表达效率。结果基因测序及酶切鉴定证实重组Adprecursor-miR-1腺病毒载体构建成功;腺病毒Ad-miR-1转染心肌细胞后,实时荧光定量PCR方法证实腺病毒Ad-miR-1能够显著提高心肌细胞内miR-1的表达水平。结论利用同源重组的方法构建的miR-1腺病毒能够提高心肌细胞内miR-1的表达水平。     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建人GST-π基因的重组腺病毒

目的：利用AdEasy腺病毒载体系统构建人谷胱甘肽转移酶-π（GST-π）基因重组腺病毒并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。方法：从质粒中通过PCR的方法扩增出目的基因GST-π并带有适宜的酶切位点，双酶切后连pAdtrackCMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrack-GST-π，经酶切线性化后，采用电穿孔转化到含腺病毒骨架质粒AdEasy1的BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中，挑选同源重组质粒AdEasy-GST-π，酶切线性化重组质粒并转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒，荧光显微镜观察绿色荧光表达。重组病毒上清乒乓交互感染HEK293细胞，荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果：经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带GST-π基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论：成功地构建了携带GST-π基因的重组腺病毒载体，为利用GST-π基因转染造血干细胞的基因治疗奠定了基础。     

腺病毒载体介导的大鼠DNA多聚酶β重组体的构建及其在PC12细胞中的表达

【目的】为探讨DNA多聚酶β在神经细胞损伤中的作用与机制，构建其重组腺病毒载体，并在PC12细胞中表达。【方法】RT—PCR获取大鼠DNA多聚酶β（POLβ）的编码序列，TA克隆测序，酶切POLβ基因并连人穿梭质粒pAdTrack—CMV，电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183。重组腺病毒质粒（pAd—polp）和Lipofectamine2000转染293细胞，用重组腺病毒感染PC12细胞。【结果】10个TA克隆中有3个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLβ cDNA序列完全一致，同源重组检测时30个克隆中有8个含目标条带。DNA序列正确的POLβ重组腺病毒质粒转染293细胞后，感染Ad—polβ的293及PC12细胞荧光显微镜下可见绿色荧光，重组腺病毒Ad—polβPCR鉴定含目标条带，Ad—polβ感染PC12细胞Western Blot检测到POLβ蛋白表达。【结论】成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体并在PC12细胞中表达     

Ad.mda-7/IL-24的构建及在卵巢癌耐药癌细胞株中的感染表达

目的 利用Adeasy 1系统,构建并鉴定人mda-7/IL-24重组腺病毒(Ad.mda-7/IL-24).方法 从质粒pREP4-mda-7中扩增目的基因mda-7/IL-24,亚克隆至pAdTrack CMV穿梭质粒中,与pAdEasy 1质粒在E.coli BJ5183中进行同源重组为腺病毒载体质粒,线形化后转染293细胞进行包装扩增得到Ad.mda-7/IL-24.感染人卵巢癌泰素耐药株OVCAR-8/TR,Western-blot检测感染后MDA-7/IL-24蛋白表达.结果 重组腺病毒载体经测序、酶切电泳及感染后蛋白表达检测均表明成功构建Ad.mda-7/IL-24;病毒感染量为10 μL时,感染OVCAR-8/TR细胞可达100%感染率.细胞感染后可表达MDA-7/IL-24目的蛋白.结论 成功构建了人Ad.mda-7/IL-24,并能有效感染卵巢癌耐药细胞株,为进一步研究mda-7/IL-24基因在卵巢癌耐药中的作用奠定了基础.     

Construction and Expression of Human PTEN Tumor Suppressor Gene Recombinant Adenovirus Vector

Phosphatase and tensin homologue deleted onchromosome10(PTEN)is a newtumor suppres-sor gene and possesses mutation in multiple kindsof tumors which include breast cancer[1].Teng[2]found the incidence for loss of heterozygosity(LOH)in breast cancer speci mens was48%(32/67),and the mutation and inactivation of PTENgene plays a central role in cell migration,growthandinvasion of breast cancer[3].This study ai ms atestablishing a kind of proliferative defective recom-binant adenovirus vector A…     

HBV X-HCV C融合基因重组腺病毒的构建及鉴定与表达

目的:应用重叠区扩增基因拼接法(gene SOEing)获得HBV X-HCV C融合基因,构建HBV X-HCV C融合基因重组腺病毒。方法:应用gene SOEing法扩增HBV X-HCV C融合基因并将其克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-XC,经PmeⅠ酶切线性化后电转化BJ/AdEasy菌,构建重组腺病毒质粒pAd-XC;鉴定正确的pAd-XC经Pac I酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装,扩增,利用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)监测病毒滴度和感染效率,Western-blot法检测目的蛋白的表达。结果:测序结果显示,pAdTrack-CMV-XC构建成功;PCR及Pac I酶切鉴定结果表明pAd-XC构建成功;经Pac I酶切线性化的pAd-XC转染293细胞后24 h即可观察到GFP的表达;回收的病毒可重复感染293细胞,Western-blot法检测到目的蛋白的表达,证实有感染能力且可表达目的蛋白的病毒颗粒包装成功。结论:HBV X-HCV C融合基因重组腺病毒构建成功,为进一步研究HBV X蛋白和HCV C蛋白的生物学功能奠定了基础。     

PSD-95及其突变体的重组腺病毒对皮质神经元的感染

目的构建PSD-95（postsynaptic density-95）及其突变体PSD-95Y523F和PSD-95Y533F（523和533位酪氨酸分别突变成苯丙氨酸）的复制缺陷型重组腺病毒载体,并检测腺病毒颗粒对体外原代培养皮质神经元的感染能力。方法双酶切将PSD-95及其突变体的基因分别从载体peDNA3．1（＋）亚克隆至穿梭载体pAdTrack—CMV中;电穿孔法将穿梭重组体转化到电转感受态细胞BJ5183中,使其与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组;同源重组体经PacI酶切线性化,脂质体法转入HEK293H细胞中进行病毒包装;病毒颗粒分别感染HEK293T细胞和原代皮质神经元,荧光检测或免疫印迹方法检测目的蛋白的表达水平。结果经酶切电泳鉴定和序列测定证明同源重组体中含序列正确的目的基因;重组腺病毒颗粒感染HEK293T细胞后,免疫印迹显示有较高水平的目的蛋白表达;重组腺病毒具有感染原代皮质神经元的能力,在未成熟神经元（体外培养5—9天）中感染率低,而在成熟神经元（体外培养13天）中感染率较高。结论成功构建了PSD-95、PSD-95Y523F、PSD-95Y533F的重组腺病毒载体;获得具有感染能力的重组腺病毒颗粒,易于感染成熟的神经元。     

携带凋亡抑制蛋白Livinα基因的重组腺病毒载体的构建

目的构建携带凋亡抑制蛋白Livinα和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺病毒pAd-Livinα。方法 PCR扩增Livinα基因片段,克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,在人胚肾293细胞中包装扩增得到携带Livinα和GFP基因的重组腺病毒pAd-GFP-Livinα。采用PCR对重组腺病毒进行鉴定。结果经酶切及PCR鉴定证实携带Livinα的重组腺病毒载体构建成功,并可在人胚肾293细胞中表达,病毒滴度2.15×1010 pfu/mL。结论成功构建了携带Livinα和GFP基因的重组腺病毒载体系统,为进一步研究Livinα的生物学特性奠定了基础。     

人FRNK重组腺病毒的构建

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建人FRNK基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。方法:把人FRNK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建腺病毒质粒pAdTrack-CMV-hFRNK,经PmeⅠ内切酶酶切成线性化后,采用电穿孔转化将其转化到含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中,通过卡那霉素筛选获得阳性腺病毒重组质粒。再将获得的腺病毒重组质粒转染到HEK293细胞进行包装,获得人FRNK重组腺病毒pAdhFRNK。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果:经酶切和绿色荧光蛋白表达证明了hFRNK基因的重组腺病毒载体pAdhFRNK构建成功,并制备出高滴度的重组病毒。结论:成功构建携带人FRNK基因的重组腺病毒pAdhFRNK,为研究FRNK的基因治疗奠定了基础。     

小鼠窖蛋白-1 基因重组腺病毒载体的构建

目的应用AdEasy重组腺病毒载体系统,构建携带小鼠窖蛋白-1(caveolin-1)编码区基因的复制缺陷型重组腺病毒载体Ad-caveolin-1。方法将质粒pTRE2-caveolin-1中的小鼠caveolin-1编码序列亚克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV中构建重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-caveolin-1,酶切线性化后转入已含有病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌中进行同源重组。筛得的病毒质粒pAd-caveolin-1经酶切鉴定后,在293细胞中包装成重组腺病毒。荧光显微镜观察绿色荧光表达。扩增并纯化病毒,测定病毒滴度和重组病毒插入片段的序列。结果重组腺病毒质粒经酶切鉴定证实成功构建了携带caveolin-1基因的重组腺病毒载体,转染293细胞后可出现明显的细胞病变效应,并观察到绿色荧光的表达,caveolin-1基因测序鉴定与GenBank中公布序列一致。重组腺病毒的滴度为:2×109pfu/mL。结论应用AdEasy系统成功地构建了重组腺病毒载体Ad-caveolin-1,通过该系统携带的绿色荧光蛋白(GFP)标记基因可直观检测靶细胞转染和外源基因表达的情况,为进一步研究caveolin-1在牙齿发育中的作用奠定了基础。