乙肝病毒X基因重组腺病毒载体的构建

目的为了探讨HBx基因与肝癌发生的关系,构建HBx基因重组腺病毒载体。方法应用pAdEasyTM腺病毒载体系统,首先从质粒pCDNA3．1-HBx中酶切得到HBx基因,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV中,得到pAdTrack—CMV—HBx,将其PmeI酶切线性化后,转到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中,通过同源重组得到重组腺病毒质粒载体pAd—HBx,经PacⅠ酶切线性化后转染人胚肾293细胞,产生重组腺病毒颗粒Ad—HBx。结果、PCR和酶切鉴定证明重组腺病毒Ad—HBx构建成功,在转染的293细胞中可以观察到绿色荧光蛋白GFP。结论成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体,为后续研究奠定了基础。     

新型Smad7 重组腺病毒载体的构建

目的构建鼠Smad7重组复制缺陷型腺病毒载体(AdSmad7).方法采用常规分子生物学方法,抽提SD大鼠肝脏总RNA,RT PCR获得鼠Smad7 cDNA片段,插入腺病毒穿梭载体质粒pAdDTrack CMV启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack CMV Smad7,线性化后与腺病毒骨架载体质粒AdEasy 1在细菌BJ5183内同源重组,鉴定后在HEK293细胞包装成重组腺病毒AdSmad7.RT PCR检测AdSmad7在HEK293中的表达情况.结果该重组缺陷型腺病毒载体经测序、限制性内切酶酶切分析、PCR等鉴定,与预期结果一致;重组腺病毒质粒转染HEK293细胞后3 d可观察GFP明显表达;RT PCR检测证实Smad7表达增强.结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可快速构建同时表达GFP和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒AdSmad7,为进一步研究TGFβ信号转导和肝纤维化的基因治疗奠定基础.     

人乳头瘤病毒E6E7基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的:利用AdEasy系统构建人乳头瘤-16(HPV-16)E6 E7基因重组腺病毒,并通过Western Blot方法检测E6E7蛋白的表达.方法:将质粒pET-32a( )-E6E7扩增、酶切获得E6E7片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack-CMV的巨细胞病毒(CMV)启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-E6E7,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-E6E7,经人胚肾293细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒Ad-E6E7;用包装后的病毒上清再次感染293细胞,提取细胞中的蛋白,通过Western Blot方法检测E6E7蛋白的表达.结果:连接、重组后通过酶切和测序法筛选出pAd-E6E7;经人胚肾293细胞包装,3 d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)明显表达,氯化铯梯度离心纯化最终获得6.9×1010 pfu/L滴度的重组病毒;用该滴度的Ad-E6E7重新感染人胚肾293细胞3 d后,提取细胞蛋白,Western Blot检测,E6E7有明显表达.结论:利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6E7的重组腺病毒Ad E6E7.     

人DeltaNp73α基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的利用Adeasy腺病毒载体系统构建含人DehaNp73α cDNA的重组腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒。方法从pcDNA3-DeltaNp73α—HA中酶切出DehaNp73α基因，并插入pAdTrack—CMV中构建成腺病毒穿梭质粒；pAdTrack-CMV—DehaNp73α线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的E.coli．BJ5183菌株内同源重组。筛选正确的重组质粒，PacⅠ线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒；并在293T细胞中反复扩增；增强离心法转染树突状细胞，Western blot检测目的蛋白的表达。结果经限制性内切酶酶切鉴定、PCR筛选、基因测序和GFP表达证实成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒；Western blot检测出预期相对分子质量为67×10^3的特异条带。结论成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组病毒。     

人CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:用AdEasy腺病毒载体系统构建CTLA4Ig重组腺病毒,以感染树突状细胞使其递呈抗原至T淋巴细胞功能受阻.方法:双酶切、凝胶回收方法从质粒pCDM8-CTLA4Ig提取目的基因CTLA4Ig,构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CTLA4Ig;经酶切线性化后的pAdTrack-CTLA4Ig与AdEasy-1进行同源重组,经酶切线性化转染入HEK293细胞进行包装.结果:卡那霉素抗性筛选和PacⅠ酶切确证重组腺病毒质粒pAd-CTLA4Ig,PacⅠ酶切产生30 kb和4.5 kb 2个片断为同源重组.重组腺病毒质粒经293细胞包装后可观察到绿色荧光,收获病毒并制备出高滴度重组腺病毒(病毒滴度为1.6×109).结论:成功构建了携带CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体,为利用CTLA4Ig基因转染树突状细胞的基因治疗奠定了基础.     

重组人RAMP-1基因腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带人受体活性修饰蛋白-1（RAMP1）基因的腺病毒表达载体,为进一步深人研究RAMPl的功能奠定基础。方法通过基因工程技术将RAMP1基因克隆到穿梭质粒pShutde—GFP—CMV中;I-CeuI＋I—SceI双酶切穿梭质粒pShuttle—GFP—CMV—RAMPl,将回收的GFP-CMV—RAMP1片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒Ad—RAMP1并进行PCR鉴定及滴度测定。结果构建的重组穿梭质粒pShuttle—GFP—cMVl-RAMP1双酶切后,得到O．8kb（RAMP1）和5．1kb（pShuttle—GFP—CMV）两个片段;重组腺病毒质粒pAdxsi—GFP—CMV—RAMP1用XhoI酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒Ad—RAMP1 PCR鉴定可见阳性扩增条带;病毒滴度检测达4．5×10^11PFU／ml。结论成功构建了携带人RAMP1基因的重组腺病毒载体,为进一步研究RAMPl的功能研究奠定了基础。     

重组复制缺陷型腺病毒AdIL-10构建及其在HSC中的表达

目的利用AdEasy系统构建重组复制缺陷型腺病毒AdIL-10,并观察其在肝星状细胞(HSC)中的表达.方法从SD大鼠脾脏单核细胞中抽提总RNA,通过RT-PCR获得鼠IL-10 cDNA 片段, 插入穿梭质粒pAdTrack巨细胞病毒(CMV)启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-IL-10,线性化后与AdEasy-1电穿孔共转化BJ5183,获得重组腺病毒质粒pAdIL-10.pAdIL-10用Lipofectamin包装转染HEK 293细胞,获得重组腺病毒AdIL-10.将AdIL-10体外感染HSC,3 d后抽提HSC总RNA,以RT-PCR检测IL-10的表达.结果通过酶切和测序法筛选出pAdIL-10;经293细胞包装,3 d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达;AdIL-10感染HSC 3 d后观察到GFP表达,通过RT-PCR可检测到IL-10的表达.结论利用AdEasy系统可制备重组腺病毒AdIL-10;AdIL-10感染HSC后可表达IL-10.     

HIV-1型病毒蛋白R基因表达载体的构建及其在前列腺癌细胞系PC-3中的表达

目的：利用AdEasy腺病毒载体系统构建含HIV-1病毒蛋白R（viral protein R,Vpr）基因的重组腺病毒,使之有效感染靶细胞前列腺癌细胞系PC-3,并在其中表达Vpr。方法：自表达载体pCI—neo—Vpr中扩增出Vpr基因,插入到pAdTrack—CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrack—Vpr,经限制性内切酶Pme I酶切线性化后,利用磷酸钙介导法将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转化到BJ5183大肠埃希菌。挑选同源重组质粒,经Pac I酶切后回收大片段,并将其转染包装细胞AD293。利用荧光显微镜观察AD293细胞中绿色荧光蛋白（GFP）表达。收集第一代重组病毒上清,使之感染AD293细胞得到第二代病毒,如此反复感染AD293细胞3—4轮,使病毒大量扩增。梯度稀释法测定病毒滴度后,分别以感染复数（MOI）为1、5、10的病毒量感染靶细胞PC-3,荧光显微镜观察细胞中GFP表达,并利用RT＋PCR和蛋白质印迹技术分别从mRNA和蛋白水平检测目的基因的转录与表达情况。结果：经限制性内切酶检测、GFP表达和病毒上清液PCR证实成功构建了携带Vpr基因的重组腺病毒,滴度为3．0×10^8efu／ml。以MOI为5的重组腺病毒感染24h后,80％以上的靶细胞能够表达GFP,RT—PCR和蛋白质印迹能够同时检测到目的基因Vpr的转录与表达。结论：成功构建含Vpr基因重组腺病毒,并且病毒能够有效感染PC-3细胞,使得目的基因在其中获得大量表达,为进一步研究Vpr蛋白对PC-3肿瘤细胞的影响及其可能涉及的信号通路奠定了基础。     

沙眼衣原体ompA基因克隆及其在真核细胞中的表达

目的克隆D型沙眼衣原体(Ct)ompA基因,构建真核表达重组质粒,转染真核细胞,为核酸疫苗的研制作准备.方法用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段,重组入pUCm-T克隆载体.将pUCm-T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,进行序列分析和酶切鉴定后,运用脂质体将重组体pcDNA3.1/ompA转染HeLa细胞,免疫组化法观察目的的基因的表达.结果从D型Ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段;序列测定证实与GenBank登陆的D型Ct一致;重组质粒pcDNA3.1/ompA在HeLa中获得表达.结论Ct ompA基因能够在体外真核细胞表达,为进一步研究Ct致病机制及DNA疫苗的研究提供理论依据.     

Ｌｉｍｓ Ｅ：一个新的ＬＩＭ同源域基因的克隆和初步分析

目的:克隆与分析小鼠不同剪切的Lims基因.方法:应用巢式RT-PCR,以小鼠cDNA为模板,扩增Lims基因不同剪切子,构入PinPointTM Xa-1T质粒,测序鉴定.结果:测序表明克隆了新的Lims基因变异剪切体Lims E,该变异剪切体编码区为1 164 bp.编码387个氨基酸.结论:比较基因组学分析显示,成功地克隆了一新的小鼠Liras基因剪切子Lims E,为进一步研究Lims基因在细胞发育中的功能打下了基础.     

哺乳动物性别决定基因的研究进展

目的了解哺乳动物性别决定基因的作用与功能。方法查阅本领域国内外文献并进行综述。结果SRY、SOX9、WT1、SF1、AMH及DAX1等基因都参与哺乳动物性别决定。结论性别决定基因的研究对性分化与发育异常等临床疾病的诊断和治疗具有十分重要的意义。     

穿梭质粒pZH32的构建

以pS189、pSV_2gpt、pMCi5为材料,构建了以EB病毒为基础,以酪氨酸tRNA琥珀突变校正基因SupF为靶基因,以黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因Eco gpt为选择标记基因的穿梭质粒pZH32。pZH32长9.4kb,克服了以SV40为基础的穿梭质粒自发突变率高以及宿主范围局限的缺点。SupF基因遗传背景清楚,长度126bp,便于进行序列分析。gpt基因使转化克隆的筛选更加方便。有利于建立一种化学诱变剂的分子检测系统,研究基因突变的类型和突变机制。     

人B7-1/Sart3融合基因的克隆和表达

目的：构建人共刺激分子CD80(B7-1)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(Sart3)融合基因真核表达载体，并分别在原核和人成纤维细胞中表达。方法：采用RT-PCR技术，从人胎盘组织抽提的总RNA中克隆Sart3基因的部分cDNA序列(第1～1281bp)．此段序列包括已报道的能诱导HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞的抗原表位。然后将不含终止密码子的B7-1 cDNA和Sart3 cDNA共克隆入真核表达载体pEGFP-N1，测定核苷酸序列确定重组成功后，分别转染大肠杆菌和人成纤维细胞，利用流式细胞仪和Western blot检测B7和Sart3的表达。结果：构建人B7、Sart3融合基因真核表达载体B7sart3／pEGFPN。测序结果与GenBank的B7、Sart3相应序列(NM_005191、NM_014706)一致．阅读框无改变。流式细胞仪测定发现在转染的人成纤维细胞表面有明显的荧光增强．免疫印迹发现融合蛋白可以与抗B7抗体反应，融合蛋白分子量与B7-Sart3-EGFP的预测分子量相当。结论：成功构建真核表达载体B7Sart3／pEGFPN，并在人成纤维细胞中表达。为下一步研究将SART3蛋白作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤的生物治疗打下基础。     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因，ｐｌ６基因为目的基因，将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游，构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６，并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

Rh(-)献血者128例基因分型

目的：探讨Rh(-)献血者RhD基因分型的临床意义。方法：采用PCR－－SSP技术检测郑州市128例Rh（－）献血者的RhD基因结构，用氯仿／三氯甲烷法放散检测D^u检测，结果：RhD基因多态性存在3种基本形式，其中外显子完整存在32例（25．00％），全部为D^u型，完全缺失85例（66．41％），部分缺失11例（8．59％），其中2例为D^u型。结论：RhD基因的丰富多态性对于确保输血安全具有指导意义。     

肿瘤特异性报告基因载体的构建

目的：将构建一种能在肿瘤组织中进行肿瘤行异性表达的逆转录病毒载体，增强肿瘤基因治疗的靶向性。方法：PCR法获得HER2基因的启动子片段并将其克隆至逆转录病毒载体P^LXSN中，再将突变型绿色荧光蛋白（mtGFP)基因克隆至该启动子下游。结果：质粒P^LHSN经EcoR I和BamH I酶切后可切出510bp和5.8kb两条片段；质粒P^LHGSN经BamH I酶切可切出520bp和6.7kb两条片段。结论：成功构建了携带HER2基因启动子和mtGFP报告基因的逆转录病毒载体。     

慢性胃炎胃粘膜上皮细胞中bax、fas、p16基因的表达

目的:探讨bax、fas和p16在胃粘膜病变发生发展过程中的作用及意义.方法:应用免疫组织化学方法,检测慢性浅表性胃炎(CSG)和轻、中、重度慢性萎缩性胃炎(CAG)患者胃粘膜上皮细胞中bax、fas(促凋亡基因)和p16(增殖负调控基因)基因蛋白的表达情况.结果:CSG和轻、中、重度CAG胃粘膜中bax的表达率分别为41.75%、72.41%和78.26%,fas的表达率分别为39.81%、65.52%和78.26%,p16的表达率分别为9.71%、24.14%和30.43%.轻、中、重度CAG与CSG比较,bax、fas、p16的表达差异有显著性意义P<0.05～0.01.轻、中、重度CAG间比较,差异无显著性意义.结论:bax、fas和p16的高表达,使得细胞增殖/凋亡的比例失衡,在胃粘膜病变的发生发展中可能有重要意义.     

PTEN基因真核荧光表达载体的构建及其在喉癌细胞株

目的: 构建人PTEN基因的真核荧光表达载体并在Hep-2喉癌细胞中高效表达,阐明PTEN基因在喉癌细胞株中的抑癌效果并为喉癌的基因治疗奠定基础。方法: 从人喉黏膜组织中提取总RNA,经逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）得到PTEN全基因。克隆入PGEM-T easy载体上,经过PCR和酶切鉴定为阳性的克隆,进行测序分析。将所获得的基因定向克隆入Pegfp-C1载体中构建PTEN真核荧光表达载体,并将其转入Hep-2细胞中进行表达,Western blotting检测其表达。结果: 反转录PCR扩增后的产物,在约1 400 bp处可观察到特异性条带,序列分析表明与GenBank中的PTEN基因序列相同。PCI-PTEN真核载体转染Hep-2细胞后的Western Blotting表明表达产物与抗人PTEN单克隆抗体有特异性免疫反应。结论：成功构建出PTEN真核荧光表达载体,诱导产生蛋白经检测证实为PTEN蛋白。