鼠源性抗HBV-TP可变区抗体基因的克隆及原核表达

目的:扩增鼠源性抗HBV末端蛋白(HBV-PT)mAb轻、重链可变区(VL,VH)基因,构建sFv原核表达载体并于大肠杆菌中表达.方法:从鼠源抗HBV末端蛋白杂交瘤细胞(E3)中提取细胞总RNA,逆转录成cDNA,以鼠源简并性引物PCR扩增抗体的VL和VH基因,克隆到pGEM-T Easy载体,测序并对其结构进行分析.选择序列正确的克隆,分别构建VL及VH的PBV220原核表达载体,42℃诱导表达,Western blot鉴定表达产物.结果:经测序证实,所克隆的VL基因为363 bp,VH基因为375 bp,两者序列与鼠抗体的同源性均大于80%.构建了鼠抗HBV-PT抗体基因VL及VH的PBV220原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达.表达产物经SDS-PAGE及Western印迹分析与羊抗鼠IgG产生特异反应.结论:抗HBV末端蛋白轻、重链可变区基因的克隆及表达为进一步探讨HBV感染患者的免疫治疗奠定了基础.     

抗人膀胱癌单克隆抗体轻链可变区基因的克隆及其原核表达载体的构建

目的 克隆抗人膀胱癌单克隆抗体轻链可变区基因(VL)，并构建其原核表达载体。方法 从能分泌抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞BDI-1中提取总RNA，通过RT-PER扩增出VL cDNA。用HindⅢ和Xho Ⅰ酶切纯化的RT-PER产物和原核表达载体pET28a( )，在LDNA连接酶作用下室温连接，重组质粒经酶切鉴定，阳性克隆测序并进行序列分析。结果 扩增出VL cDNA片段，大小约为340bp，重组质粒的酶切鉴定结果与预期一致。VL基因序列长度为324bp，编码108个氨基酸。VL基因属于鼠免疫球蛋白κ轻链Ⅳ亚类。结论 成功克隆出抗人膀胱癌单克隆抗体轻链可变区基因．并成功构建其原核表达载体。     

抗人CD14新克隆ZCH-7-2F9单抗轻重链可变区基因克隆与序列分析

目的:获取抗人CD14单克隆抗体(单抗)ZCH-7-2F9(简称2F9)轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因,为2F9单链抗体(ScFv2F9)的构建奠定基础。方法:复苏2F9和NS-1细胞株,并亚克隆2F9细胞株,从其最佳克隆93A10提取总RNA,RQ1 RNase-Free DNase处理污染的DNA,与NS-1细胞进行同步对照,通过RT-PCR,扩增获得2F9单抗VL基因和VH基因,分别克隆入pGEM○R-T Easy载体,然后转化DH5α细菌,酶切鉴定并纯化阳性重组子,测序后进行在线核苷酸序列分析。结果:2F9单抗VL基因全长321 bp,编码107个氨基酸,归属于小鼠Ig的Vκ基因,氨基酸序列分析结果显示,VL含有明确的4个框架区(FR)和3个抗原决定簇互补区(CDR),在第23位和第88位为半胱氨酸,是与抗体二硫键形成有关的两种特征性氨基酸;其VH基因全长360 bp,编码120个氨基酸,归属于小鼠Ig的VH基因,氨基酸序列分析结果显示,VH含有明确的4个框架区和3个抗原决定簇互补区,在第22位和第96位为半胱氨酸,是与抗体二硫键形成有关的两种特征性氨基酸。结论:经核苷酸序列分析证明所克隆的基因分别是2F9单抗的VL和VH基因,为2F9基因工程抗体研究奠定了坚实的基础。     

抗转铁蛋白受体单链抗体原核表达载体的构建和表达

目的 构建抗转铁蛋白受体(TfR)单链抗体原核表达载体，为进一步研究其效应奠定基础。方法 从抗TfR单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆载体pGEM-T-VH和pGEM-T-VL中扩增重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因，用重叠延伸PCR的方法，在VH和VL基因间引入连接短肽(Linker)，构建VH-Linker-VL的单链抗体(single chain Fv，scFv)基因。经NcoⅠ和NotⅠ酶切后亚克隆到原核分泌型表达载体pUCl9／119上，转化和筛选后，阳性细菌经IPTG诱导表达。间接免疫荧光法(IFA)及抗体封闭试验鉴定其抗体活性。结果 凝胶电泳可见重叠延伸PCR扩增产物约700bp条带，SDS-PAGE鉴定表达产物的分子量为27kD左右，与scFv的理论值一致，IFA及抗体封闭试验证明表达产物有抗人TfR的活性。结论 本研究成功地构建并表达了抗人TfR scFv，为抗人TfRscFv的应用奠定了基础。     

抗鼻咽癌单克隆抗体BAC5单链抗体原核表达载体的构建和表达

[目的]构建抗鼻咽癌单克隆抗体BAC5单链抗体的原核表达载体并观察其表达,为开展抗鼻咽癌单链抗体的进一步研究奠定基础.[方法]应用RT-PCR技术,扩增出鼻咽癌单克隆抗体BAC5的轻链、重链可变区基因,通过一段编码肽的序列进行连接,构建BAC5单链抗体表达载体pET22b-scFv,导人BL21(DE3)表达菌,并进行诱导表达.SDS-PAGE凝胶电泳鉴定融合蛋白的表达.[结果]克隆基因序列符合小鼠轻、重链可变区基因特征;pET22b-scFv表达质粒拼接正确;表达产物以包涵体形式为主.[结论]成功构建了能表达BAC5单链抗体的原核表达载体.     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF原核表达载体的构建及表达

目的 克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF基因,构建原核表达载体并鉴定表达。方法 从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA,PCR扩增OprF羧基端,克隆至原核表达载体pET28b中,构建重组表达载体pET28b-F。重组质粒经酶切和序列测定后,转化E.coli BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,进行SDS-PAGE检测。经Ni-NTA亲和层析柱纯化后OprF蛋白免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤方法制备相应单克隆抗体并用ELISA方法进行鉴定。结果 pET28b-F原核表达载体构建成功。重组表达质粒经IPTG诱导后表达外膜蛋白OprF。获得4株高分泌型特异性单克隆细胞株,其中2株单克隆抗体可用于制备双抗体夹心法ELISA试剂盒,检测铜绿假单胞菌。结论 成功克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF羧基端基因片段并在大肠杆菌中进行表达,筛选出特异性抗OprF单克隆抗体。     

日本血吸虫抗独特型抗体NP30重链6×CDR3/IL-2融合基因构建及表达

目的:构建日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链可变区6×CDR3基因/IL-2融合基因,以观察其对动物的抗血吸虫感染保护作用。方法:通过PCR方法体外扩增NP30 6×V_HCDR3和IL-2基因,经测序后先后重组入原核表达质粒pET-28a(+)相应的位点上,将构建正确的6×V_HCDR3/IL-2-pET-28a(+)表达质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导表达。结果:构建的6×V_HCDR3/IL-2融合基因中,6×V_HCDR3和IL-2序列均正确,融合基因经IPTG诱导表达重组蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析分子质量约为30ku,表达量约占菌体总蛋白的20％。结论:成功构建并原核表达了NP30 6×V_HCDR3/IL-2融合基因。     

丙型肝炎病毒F蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的:构建丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)F蛋白的原核表达载体,表达pET32a(+)-HCVF融合蛋白.方法:根据丙型肝炎病毒F基因的全序列设计引物,以HCV1a型cDNA质粒H/FL为模板,通过PCR方法扩增得到F基因的编码区序列,将其定向克隆于含有6×His tag的原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌JM109,经菌落PCR筛选,双酶切和测序鉴定阳性克隆后,转化大肠杆菌BL21,采用IVTG诱导表达融合蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测鉴定,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化.结果:F基因以正确的方式插入到pET32a(+)载体中,重组质粒转化大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达,出现了与预期分子量相符的蛋白条带,该蛋白通过Western blot检测具有6×His tag蛋白的免疫学活性.结论:成功构建了丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达载体pET32a(+)-HCVF并表达和纯化出重组融合蛋白,为进一步研究F蛋白的生物学功能奠定了基础.     

乙型肝炎病毒全-X基因的克隆及原核表达

目的:构建乙型肝炎病毒全-X基因原核表达载体并在细菌中表达、纯化. 方法:利用基因重组技术,将全-X基因定向克隆于原核表达载体pET-32a( )多克隆位点中,限制性酶切和测序鉴定. 细菌表达产物及纯化后的产物经SDS-PAGE和Western免疫印迹分析. 结果:经限制性酶切分析及测序鉴定,证实成功构建全-X原核表达质粒. SDS-PAGE和Western免疫印迹分析表明重组质粒在大肠杆菌中表达. 结论:本研究将全-X基因定向克隆于原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达、纯化. 为进一步研究全-X的功能及制备相应抗体奠定了基础.     

抗DR5单链抗体的构建与表达

目的:构建抗DR5单链抗体的真核表达载体,以实现真核表达。方法:RT-PCR法从分泌抗DR5抗体的杂交瘤细胞中合成第一链cDNA,用通用引物钓取单克隆抗体的轻、重链可变区基因。经测序和BLAST比对,证实为一株新的鼠源性抗体基因。利用overlapping PCR方法构建单链抗体真核表达载体pCMV-express-scFv,Lipofectamine2000法转染宿主细胞293T,72 h后ELISA法检测细胞培养上清,检测抗体表达。结果:经序列鉴定和BLAST比对证实克隆的抗体轻、重链可变区基因为新鼠源抗体基因。ELISA实验结果显示抗体有效表达在细胞培养上清中。结论:成功得到抗体轻、重链可变区基因,实现了抗DR5单链抗体的真核表达,为进一步的研究和开发奠定了基础。     

抗VWF-A3区特异性单抗SZ-123单链抗体的构建和表达

目的以能与vWF-A3区特异结合的单克隆抗体SZ-123为模板,构建其单链抗体,为深入研究vWF-A3结构与功能的关系提供有力的工具。方法通过逆转录及多聚酶链反应,扩增并克隆单抗SZ-123的可变区基因VH、VL,经测序后加入连接肽,构建成SZ-123单链抗体（SZ-123 ScFV）,并在大肠杆菌中进行表达。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和Western blot方法验证SZ-123 ScFV的免疫原性。结果 VH、VL可变区基因符合小鼠抗体可变区特征,SZ-123 ScFV基因拼接正确。表达产物除少量为分泌型外,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体蛋白的20%。经过变性和复性后,获得具有生物活性的高纯度单链抗体片段。结论成功表达了SZ-123单链抗体,该小分子抗体具有特异结合vWF-A3区的能力。     

抗人AFP单链抗体基因的构建和在大肠杆菌中的表达

目的　构建抗人 AFP单链抗体 (Sc Fv)的基因并转入大肠杆菌 BL - 2 1(DE3)中诱导表达。分离纯化Sc Fv并鉴定其生物活性。方法　用 RT- PCR方法从能分泌特异性抗人 AFP单克隆抗体的杂交瘤细胞中分离纯化抗体 VH和 VL基因。用重叠延伸 PCR方法将 VH和 VL拼接在一起 ,构建抗人 AFP单链抗体的基因。将 Sc Fv基因克隆至 p GEM- T载体构建 ,用限制性内切酶切以及测序鉴定。将 Sc Fv基因连接到 p ET32 (a )质粒 ,转化 BL - 2 1(DE3)细菌。抗性生长的克隆用异丙基硫代 -β- D-半乳糖苷 (IPTG)诱导 4 h。溶解细菌并纯化 Sc Fv,通过 SDS-PAGE电泳及竞争抑制 EL ISA实验检测其活性。结果　获得的 VH含 339bp,来自小鼠 Ig Gγ链 ,VL含 312 bp,来自小鼠κ链。 VH和 VL通过编码 (G4 S) 3连接肽的 4 5 bp序列连接在一起构成含 6 96 bp的 Sc Fv基因。 BL - 2 1(DE3)中表达的 Sc Fv抗体与融合蛋白 (Trx A)融合在一起并以包涵体的形式存在。 Trx A- Sc Fv相对分子质量约 4 0× 10 3,Sc Fv相对分子质量约 2 4× 10 3。竞争 EL ISA实验显示 :Trx A - Sc Fv可抑制 4 1%的 Mc Ab与抗原结合 ,而Sc Fv抗体则可抑制 5 3%的 Mc Ab与抗原结合。结论　我们成功构建了由 6 96个碱基组成的抗人 AFP单链抗体的基因 ,并在大肠杆菌获得了     

胱抑素C原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

目的：构建胱抑素C（cystatin C,Cys-C）原核表达载体并表达、纯化、鉴定目的蛋白。方法根据GeneBank报道的Cys-C基因序列,采用RT-PCR技术从人胚肾细胞系HEK293中获得Cys-C的cDNA序列,经PCR、酶切及测序确认最终获得重组载体pET-30a（＋）-CysC,转化大肠埃希菌Rosetta,通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalac-topyranoside,IPTG）诱导表达、经镍柱亲和层析法纯化获得Cys-C融合蛋白。结果序列分析表明,人Cys-C基因成熟肽编码区编码122个氨基酸;与GeneBank（NM-000099.2）中已报道的序列有100%的同源性。经IPTG诱导表达, SDS-PAGE电泳和ELISA分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的20%,重组蛋白相对分子质量约为20000,经Ni2＋-NTA agarose纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带并与商品化的人Cys-C单抗呈特异性反应。结论在大肠埃希菌中获得了Cys-C的表达,并经镍柱亲和层析得到较纯的胱抑素。     

抗人血管内皮生长因子单链抗体的构建和表达及其活性鉴定

目的 对能与人血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）特异结合,并对体内有抑瘤活性的单克隆抗体（Ｅ１１）进行基因工程改造,构建小分子的单链抗体（ＳｃＦｖ）,为临床应用奠定基础。方法 通过逆转录及多聚酶链式反应,扩增并克隆Ｅ１１的可变区基因片段。用一编码亲水肽接头的ＤＮＡ片段将Ｅ１１轻、重链可变区基因连接,克建表达载体ＰＥＴ－１５ＹＶ,并导入大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中进行表达。表达产物经变性及复性后,用免疫组     

重组创伤弧菌溶细胞素单克隆抗体的制备

目的：制备重组创伤弧菌溶细胞素（recombinant Vibrio vulnificus cytolysin,rVVC）鼠源性单克隆抗体,并对其特异性及免疫球蛋白类型进行鉴定,为创伤弧菌溶细胞素（Vibrio vulnificus cytolysin,VVC）致病机制的后续研究及创伤弧菌引起的食品污染中溶细胞毒素快速检测试剂盒的研发奠定基础。方法：IPTG诱导含pET28a（＋）-vvhA的大肠杆菌表达rVVC,将rVVC纯化、复性后经甲醛脱毒作为抗原免疫BALB/c小鼠。SDS-PAGE检测蛋白纯化后效果。采用杂交瘤技术和ELISA法制备并筛选分泌rVVC单克隆抗体的杂交瘤细胞株,有限稀释法对阳性孔克隆化培养。采用免疫双扩法鉴定单克隆抗体类型,ELISA法、免疫双扩法鉴定单克隆抗体的特异性。结果：将纯化复性后的rVVC作为抗原免疫小鼠后,经ELISA检测,血清有效稀释度达1：12800。共获得2株可持续分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为B2C7和E3F4株,其抗体类型均为IgG1,且具有较高特异性,与多种其他细菌蛋白不发生免疫反应。结论：本研究成功免疫BALB/c小鼠,获得B2C7和E3F4两株可持续稳定分泌rVVC鼠源性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体类型为IgG1型。     

人源性噬菌体抗体库中抗CEA单抗的筛选与初步鉴定

目的：探讨利用噬菌体抗体库技术制备抗CEA的人源性单抗的可行性。方法：以纯化的CEA为抗原，应用噬菌体表面呈现技术，通过3轮亲和 富集及2轮淋巴细胞吸附实验，从已构建好的人源性噬菌体抗体库中筛选出抗CEA的人源性单抗，随机挑出10株单克隆在大肠杆菌中进行表达，并采用ELISA 、SDS－PAGE及基因测序进行初步鉴定。结果：ELISA显示有9株单抗具有与CEA特异性结合的能力，挑选其中2株具有较高亲和力的单克隆，经12％SDS－PAGE蛋白电泳，在分子量约为25kd处可见一新增蛋白带，与基因编码蛋白的理论计算相符合，基因测序结果与Gene Bank等相比对具有较高的序列同源性。结论：噬菌体抗体库技术是研制人源性单抗的有效途径。     

黄热病毒单克隆抗体的制备及免疫反应特性鉴定

目的 制备黄热病毒单克隆抗体并对其生物特性进行鉴定.方法 通过动物免疫、细胞融合、阳性克隆筛选等方法制备黄热病毒单克隆抗体,免疫Balb/c小鼠收集腹水,得到扩大制备的单抗,辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水.IFA法检测单抗与黄热病毒(YFV)、乙脑病毒(JEV)、登革病毒1-4型(DENV1-4)、西尼罗病毒(WNV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)的特异性反应,并对纯化前后的腹水进行效价分析;ELISA方法进行单抗的亚型分类.结果 获得8株黄热病毒的单克隆抗体,均与YFV有特异性反应,1株与JEV有交叉反应,余7株与其它4种虫媒病毒无交叉反应.抗体分型大部分为IgG;纯化后单抗蛋白含量大多在30 mg/ml以上.纯化后的4株单抗效价在1∶25600,3株在1∶12800,仅1株效价较低.结论 本研究目前获得了几株特异性好、效价高的黄热病毒单克隆抗体,为建立黄热病毒快速检测系统奠定了基础.     

Selection of humanized antibody against HBsAg and analysis of gene encoding its heavy chain

Themethod'combinatorlalimmunoglobulinlibraries'forthegenerationofmAbhasbeendevelopedsinceitwasreportedfirstlyin19891'.Asthe'phagedisplaytechnology'2comingout,'phageantibodylibrary'waswidelyusedtoisolatespecificantibodyfragmentsfromlargeantibodygenepoolsbyphagedisplay.Comparingwithconventionalhybridomatechnology,humanphageantibodytechnologyhasmoreadvantages:1.Theprocessisefficient,andarelativelylargenumberofantibodiesareproduced.2.Ithasprovenpossibletomimicthekeyfeaturesofthehumoralimmunesyste…     

特异性抗SSA/Ro噬菌体抗体的制备及其基因序列分析

目的　由已构建的人源单链可变区噬菌体抗体库中制备出抗SSA/Ro单克隆抗体 ,并对这些抗体的基因序列进行分析。方法　将冻存的抗体库菌种复苏制备噬菌体抗体库。用PCR、基因序列分析及酶切的方法对其进行鉴定。以组织培养皿法对该噬菌体抗体库进行富集筛选 ,用ELISA方法对富集后次级抗体库进行鉴定。制备单克隆抗体并鉴定其特异性 ,对单克隆抗体的可变区基因序列进行测序分析。结果　所制备的噬菌体抗体库的滴度为 1 6× 10 12 cfu/ml,外源基因的插入重组率为 80 % ,插入片断为人抗体可变区基因 ,且该抗体库具有良好的多样性。富集筛选回收的噬菌体数逐渐增加 ,富集后的抗SSA/Ro噬菌体抗体次级库吸光度 (A)值为富集前的 2 8倍 ,且该次级库有良好的抗SSA/Ro特异性。经富集制备出 5个特异性抗SSA/Ro单克隆抗体 ,这些单克隆抗体重链及轻链可变区基因分别与VH1、VH3、VH4、Vκ1、Vκ2、Vκ3基因家族有高度同源性。结论　本实验室构建的scFv噬菌体抗体库可以用于特异性抗体的筛选及单克隆抗体的制备。制备出的抗SSA/Ro单克隆抗体可变区基因序列与人胚系基因比较有突变 ,为研究相关疾病的发病机理开创了新的途径