营养不良性大疱性表皮松解症COL7A1基因诊断及产前诊断

目的 分析2个营养不良性大疱性表皮松解症(DEB)家系致病基因COL7A1基因突变位点,并在此基础上探讨COL7A1基因分析用于产前诊断的可行性.方法 应用全基因捕获新一代测序(NGS)对2013年10月和2014年4月在郑州大学第一附属医院就诊的2个DEB家系中2例先证者COL7A1基因进行全基因突变检测,获得变异序列后,针对所检出变异序列进行PCR扩增后Sanger双向测序对2个DEB家系中2例先证者及其父母和100名健康个体的COL7A1基因序列进行突变验证分析,确定致病突变后,对其中1个家系中的高危胎儿进行孕早期产前诊断.结果 共发现4种COL7A1基因突变:c.5230G ＞T (p.E1744X)、c.5932C ＞T (p.R1978X)、c.5605-10 T＞G(IVS66-10 T＞G)、c.8305-1G＞A(IVS110-1G＞A).其中p.E1744X、IVS66-10 T＞G和IVS110-1G＞A为国际首次报道的突变.家系1中先证者携带COL7A1基因p.E1744X和p.R1978X无义突变,父母分别为杂合突变携带者;家系2中先证者携带COL7A1基因IVS66-10T＞G和IVS110-1G ＞A剪接区突变,父母分别为杂合突变携带者;100名健康个体未检测到上述突变.家系1中产前诊断胎儿携带与其先证者相同的突变为受累胎儿,胎儿父母选择治疗性引产术后,取胎儿标本行基因诊断,结果与产前诊断相同.结论 COL7A1基因突变是该2个DEB家系的致病原因,NGS结合Sanger测序方法可以快速且准确地进行该病的基因诊断和产前诊断.     

Effects of thalidomide on Annexin Ⅱ gene regulation

Objective To investigate the effect of thalidomide on Annexin Ⅱ (AnxA2) gene regula-tion in multiple myeloma cell line RPMI8226 and human microvascular endothelial cell line HMEC-1 cells in vitro, and explore the potential mechanism of thrombosis induced by thalidomide. Methods RPMI8226 and HMEC-I cells were cultivated in vitro. Real time quantitative PCR (RQ-PCR) was used to detect the influ-ence of thalidomide at different concentration on the expression of AnxA2 mRNA, flow cytometry(FCM) and confocal microscopy were used to detect the cell surface protein level after the samples were stimulated with different concentrations of thalidomide. Results AnxA2 mRNA level in RPMI8226 cells treated with thalido-mide at 12.5 μg/ml, 25.0 μg/ml and 50.0 μg/ml was decreased compared with the control group (0.60 ±0. 15, 0.33 ± 0. 14, 0.42 ±0. 16, vs 1.07 ±0. 16, respectively, P <0.05)and did so in HMEC-1 cells (0.21 ±0.20, 0.08 ±0.08, 0.17 ±0. 16 vs 1.16 ±0.24, respectively, P <0.05). The AnxA2 protein lev-el in RPMI8226 cells treated with above mentioned concentrations of thalidomide was also decreased compared with the control (3.39 ± 0.32, 2.82 ± 0.28, 3.21 ± 0.23 vs 5.53 ± 0.32, repectively, P < 0. 05) and that did so in HMEC-1 cells (0.72±0. 11, 0.64 ±0.08, 0.67 ±0.08 vs 1.40 ±0. 15, respectively, P<0.05). Conclusions Thalidomide can inhibit the expression of AnxA2 mRNA and protein in RPMI8226 and HMEC-1 cells, which may be one of the mechanisms for the development of thrombosis induced by thalido-mide in multiple myeloma patients.     

血小板胶原受体糖蛋白Ⅵ体外表达及功能研究

为了深入研究血小板胶原受体糖蛋白Ⅵ(glycoproteinⅥ，GPⅥ)功能及筛选特异性抑制剂，利用基因重组技术体外表达GPⅥ胞外区片段。采用PCR方法扩增GPⅥ胞外区片段eDNA，构建表达载体pET-20b( )-GPⅥ，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，经IPTG诱导表达。表达产物经Ni—NTA Resin纯化、复性：使用Western blot方法鉴定重组蛋白性质；采用胶原结合试验测定重组蛋白的胶原结合能力。结果表明，经测序证明PCR扩增产物与GPⅥ胞外区eDNA序列完全一致；酶切分析证明成功构建了表达载体pET-20b( )-GPⅥ；原核细胞经诱导表达后出现新的相对分子量32kD蛋白条带，诱导产物以包涵体形式存在；Western blot分析表明重组蛋白可与抗Penta—His抗体和抗GPⅥ多抗特异性结合；胶原结合试验表明重组蛋白拥有较好的生物学功能。结论：正确构建了GPⅥ表达载体并成功表达重组蛋白，纯化、复性后的重组蛋白具有良好的抗原性和生物学活性。     

人vW因子A3区基因在大肠杆菌中表达及其生物学流行性的研究

血管性血友病因子(vWF)是介导血小板粘附到细胞外基质的桥梁,在血栓形成过程中发挥重要作用,可通过阻断vWF与细胞外基质的结合而阻断血小板的粘附.本研究目的是研究一种抗血栓形成的新疗法.应用RT-PCR方法从人脐带内皮细胞中克隆vWFA3区基因并在大肠杆菌中表达;应用胶原结合试验及竞争抑制实验分析rvWF-A3蛋白的生物学活性.结果表明表达的重组蛋白量占菌体总蛋白的46%,包涵体经过变性、纯化和复性,获得重组蛋白(rvWF-A3);rvWF-A3具有很好的胶原结合活性,且能竞争性抑制野生型vWF与胶原结合.结论大肠杆菌中高效表达的rvWF-A3具有良好的生物学功能,可作为阻断剂用于干预vWF介导的血小板黏附过程,是一种有开发前景的抗血栓药物.     

过氧化体增殖物激活型受体γ激动剂罗格列酮对β-catenin信号途径的调控研究

目的在细胞和动物模型上,研究了调控β-catenin水平对血管平滑肌细胞分化增殖的影响。方法体外培养大鼠动脉平滑肌细胞,以过氧化体增殖物激活型受体(PPAR)γ激动剂—罗格列酮为刺激药物,观察细胞生长曲线、测定β-catenin及其上、下游基因GSK3β、cyclin D1的表达。另外,以高脂     

胎儿母源性14号染色体未知结构改变1例

本文报道了1例胎儿染色体核型为46,XN,add(14)(p13)mat的产前诊断病例.孕妇核型为46,XX,t(2;4)(q35;q35),add(14)(p13),G3P0,于20周行羊膜腔穿刺术,进行胎儿羊水细胞的CNV-seq和染色体核型分析.胎儿的CNV-seq结果未见异常,染色体核型结果为46,XN,add...     

原位肝移植缺血再灌注损伤对大鼠肾脏组织细胞凋亡的影响

目的对比研究大鼠原位肝移植缺血再灌注损伤对肾脏组织细胞凋亡的影响。方法参照Kamada"二袖套法",建立Wistar大鼠原位肝移植动物模型,并以假手术组大鼠为对照组。分别于术后1、3、6、12、24h处死两组动物,检测血清尿素氮(BUN)和肌酐(CREA)水平变化。应用免疫组化(SP)法检测肾脏凋亡细胞的Fas蛋白表达,应用流式细胞技术检测肾脏细胞凋亡。结果肝移植组及对照组中BUN及CREA从术后1h开始上升,12h时达到高峰。两组肾脏组织细胞术后1h即出现细胞凋亡,12h时达到高峰。结论原位肝移植缺血再灌注损伤可致肾脏细胞凋亡,是肾脏细胞早期死亡的主要形式。     

血友病B家系的基因测序与高危胎儿的产前诊断

目的:对3个血友病B家系进行凝血因子Ⅸ(F9)基因突变分析,并对家系中的4个高危胎儿行产前诊断。方法:采用PCR反应和扩增后DNA直接测序技术对3个家系先证者及其家系成员F9基因的8个外显子进行序列分析,确定先证者及携带者的基因型后取羊水或绒毛进行产前诊断。结果:3个家系患者中均检出了F9基因突变,分别为G79R(c.10487G>A)、17788DelG、IVS2+4A>T(c.6493A>T)突变,其中,17788DelG为国内外首次报道的突变。女性携带者中检测出上述位点的杂合突变。家系1和家系2中行产前诊断的男性胎儿未携带F9基因突变,家系3中女性胎儿携带有IVS2+4A>T杂合突变,出生后随访均证实产前诊断的结果。结论:F9基因G79R、17788DelG、IVS2+4A>T是3个血友病B家系的致病性突变,应用基因测序技术可以对血友病B家系行有效的基因和产前诊断。     

Annexin Ⅱ siRNA对淋巴瘤Jurkat细胞凋亡的影响

目的观察沉默膜联蛋白Ⅱ（annexinⅡ,A2）基因对淋巴瘤Jurkat细胞凋亡的影响。方法采用A2 siRNA转染人淋巴瘤Jurkat细胞后应用RT-PCR和Western blot鉴定干扰效果。Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测其对细胞凋亡的影响。结果Real-time PCR和Western blot检测结果表明,A2基因被成功抑制。流式细胞术检测得A2siRNA组细胞凋亡率为57.47%±2.10%,较阴性对照组（28.68%±1.21%）明显增加,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论A2基因可增强Jurkat细胞抗凋亡作用,A2 siRNA可诱导Jurkat细胞凋亡。