大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向神经细胞样细胞分化

目的：研究大鼠骨髓问充质干细胞(MSCs)离体分离和培养方法,诱导MSCs向神经细胞样细胞分化。方法：通过梯度离心从大鼠骨髓中分离有核细胞,进行培养,去除不贴壁的细胞,分离纯化MSCs,对其生长特性进行分析。分别用硫代甘油和β-巯基乙醇对MSCs诱导分化,观察细胞形态变化,免疫组化检测分化细胞中nestin,神经元特异性烯醇化酶(NSE),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,进行鉴定。结果：用含15％胎牛血清(FCS)的L—DMEM培养MSCs,原代细胞贴壁生长,细胞形态均一,为纺锤形,有克隆形成。传代培养时,形态变为成纤维细胞样,生长特征呈“S”形,有较强的增殖能力,于第10代以后开始出现衰老征象。MSCs经硫代甘油和巯基乙醇诱导分化后,细胞形态发生改变,nsetin,NSE和GFAP阳性,分化为神经元或胶质细胞样细胞。结论：大鼠MSCs可以离体分离,培养,并能诱导向神经细胞样细胞分化。     

成鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养和向神经元样细胞分化的能力.方法:利用Percoll分离液(1.073×103g/L)梯度分离成年大鼠MSCs,采用3种不同的方法对其诱导分化,免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、星形胶质细胞特异性标志(GFAP)和神经前体细胞(Nestin)的表达.结果:成功进行了成年大鼠MSCs的原代和传代培养,3种诱导方法均能使MSCs分化为神经元样细胞,都能表达NSE、NF和Nestin,而不表达GFAP.结论:MSCs能在体外分离、扩增、传代,并能向非间充类细胞分化.     

六味地黄丸诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究

目的:观察滋补肝肾中药六味地黄丸体外诱导大鼠BMSCs分化为神经元样细胞的作用,为进一步探索获得较高比例神经元样细胞的诱导方法打下基础。方法:采用全骨髓贴壁分离法分离、培养SD大鼠BMSCs,鉴定后的第3代细胞经bFGF预诱导24 h后按空白组、bFGF组、六味地黄丸组进行诱导,观察细胞形态变化,诱导培养7 d,采用免疫细胞化学染色法检测相关标志物巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果与结论:bFGF组、六味地黄丸组部分细胞逐渐伸出突起,多为2~3极,呈现较典型的神经元样细胞形态;均有Nestin、NSE、GFAP阳性表达,六味地黄丸组Nestin、NSE表达阳性率高于bFGF组,差异有统计学意义(P0.05)。结果说明:(1)全骨髓贴壁分离法分离、培养的骨髓间充质干细胞能逐渐纯化,细胞活性较高,生物学性状稳定,适于做进一步研究;(2)六味地黄丸能诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向分化,可继续探讨六味地黄丸和碱性成纤维细胞生长因子联合诱导是否可获得更高比例的神经元样细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞在体外向神经元样细胞的分化

目的探讨2-ME与BHA对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为神经元样细胞的作用。方法大鼠股骨中分离MSCs,贴壁法体外扩增、传代。以二巯基乙醇（2-ME）预诱导,再加入2-ME、3-叔丁基-4羟基茴香醚（BHA）诱导。免疫细胞化学染色检测巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管联合蛋白-2（MAP-2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、乙酰胆碱酯酶（AchE）、1-氨基丁酸（GABA）、酪氨酸羟化酶（TH）的表达,以鉴定分化细胞的表型特征。尿嘧啶脱氧核苷（BrdU）作为细胞分裂标记检测MSCs增殖特性。结果细胞诱导后具有神经细胞的形态,并被BrdU标记,nestin、NSE、MAP-2、AchE、GABA表达阳性,而GFAP、TH表达为阴性。结论2-ME和BHA在体外能够有效的诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

清脑灵诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成神经元样细胞

目的观察清脑灵煎剂是否能诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞。方法通过贴壁法分离获得大鼠骨使髓间充质干细胞,体外扩增培养,用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。用浓度为1mg/mL的清脑灵煎剂诱导MSCs,分别于5h、12h、1d、3d、7d在倒置显微镜下观察细胞形态变化,用免疫细胞化学方法观察被诱导细胞巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果流式细胞仪检示MSCs不表达CD11b、CD45,诱导后细胞的免疫细胞化学示nestin阳性细胞、NSE阳性细胞和GFAP阴性细胞。结论清脑灵能诱导MSCs分化神经元样细胞。     

脑源性神经营养因子体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的探讨脑源性神经营养因子(BDNF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞的作用及其对诱导后的神经元样细胞保护作用，为治疗神经系统疾病提供更优良的细胞。方法体外培养MSCs至第5代后，分别用BDNF、β-巯基乙醇(β-ME)诱导MSCs，诱导后的第1、3和6小时计算两组神经元样细胞数，对各时间点两组神经元样细胞阳性率进行了比较；诱导后行神经细胞标记抗体的免疫细胞化学、RT-PCR及蛋白质印迹鉴定。结果两组诱导剂诱导后的细胞均呈神经元样细胞的形态；BDNF组诱导分化后细胞的存活时间远较β-ME组长；BDNF组在诱导后6h近于诱导高峰，而β-ME在诱导2h即达高峰，但随后神经元样细胞渐死亡。免疫细胞化学结果显示在两组诱导后细胞的巢蛋白(Nestin)、神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、神经丝蛋白(NF)表达均呈阳性，而胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达呈阴性；RT-PCR显示NSE、NFL，MAP-2的mRNA表达阳性，GFAP有较弱的表达；蛋白质印迹可见两组诱导剂诱导的细胞均表达神经元的特异性标记抗体NSE。结论BDNF能单独诱导MSCs分化形成神经元样细胞．而且分化后细胞的存活时间长．有望用于治疗脑缺血、神经变性等疾病。     

大鼠胎血间充质干细胞的体外扩增及诱导分化为神经元样细胞的研究

目的：研究大鼠胎血间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的分离、扩增及向神经元样细胞分化的可能性,为进一步的动物实验研究打下基础。方法：无菌条件下采集15只孕20d大鼠的胎血,Ficoll-hvpague分离液分离出单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)后,置于含10％胎牛血清的DMEM／LG培养传代。细胞化学染色法检测MSCs的细胞化学特征,流式细胞仪检测其免疫表型。取扩增第5代的MSCs向神经元样细胞定向诱导,免疫细胞化学法鉴定其特异性标志。结果：大鼠胎血MSCs可大量扩增,细胞化学染色示其α-丁酸萘酚酯酶(NBE)阳性,碱性磷酸酶(ALP)阴性,流式细胞仪检测显示其表达CD44、CD54,不表达CD11b、CD45。诱导后MSCs形态学观察类似于神经元,免疫细胞化学检测发现其巢蛋白(Nestin)和特异性烯醇化酶(NSE)阳性,胶原纤维酸性蛋白(GFAP)阴性。结论：大鼠胎血能够分离、扩增培养出MSCs,在适当条件下可向神经元样细胞定向诱导分化,大鼠胎血可作为MSCs的来源进一步做动物实验。     

当归诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的：研究当归体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的作用。方法：通过贴壁法分离大鼠MSCs，体外扩增培养。MSC用20μl当归注射液／ml含10％胎牛血清的L—DMEM为预诱导条件，预诱导24h后用当归注射液100μl/ml不含胎牛血清的L—DMEM进行诱导。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。当归诱导3h后大部分MSCs转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE及nestin呈阳性、GFAP性。结论:大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

目的：探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)向神经细胞体外定向诱导分化的条件。方法：从正常SD大鼠骨髓中分离获取MSC,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,采用丁羟茴醚(BHA)和二甲亚砜(DMSO)对传至3～5代的细胞进行体外诱导分化,采用免疫细胞化学对诱导后的细胞进行鉴定。结果：诱导1h、2h、3h后有部分细胞表达神经干细胞标志蛋白nestin,且随诱导时间延长呈下降趋势;诱导5h后,大部分细胞具有典型神经元形态,表达神经元标志物,神经元特异性烯醇化酶(NSE),少部分细胞呈星型胶质细胞状,表达胶质细胞标志物—胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结论：骨髓间充质干细胞可以在体外培养扩增并诱导成为神经元样细胞和星型胶质样细胞。     

脑源性神经营养因子体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的 探讨脑源性神经营养因子(BDNF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞的作用及其对诱导后的神经元样细胞保护作用,为治疗神经系统疾病提供更优良的细胞。方法 体外培养MSCs至第5代后,分别用BDNF、β-巯基乙醇(β-ME)诱导MSCs,诱导后的第1、3和6小时计算两组神经元样细胞数,对各时间点两组神经元样细胞阳性率进行了比较;诱导后行神经细胞标记抗体的免疫细胞化学、RT-PCR及蛋白质印迹鉴定。结果 两组诱导剂诱导后的细胞均呈神经元样细胞的形态;BDNF组诱导分化后细胞的存活时间远较β-ME组长;BDNF组在诱导后6h近于诱导高峰,而β-ME在诱导2h即达高峰,但随后神经元样细胞渐死亡。免疫细胞化学结果显示在两组诱导后细胞的巢蛋白(Nestin)、神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、神经丝蛋白(NF)表达均呈阳性,而胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达呈阴性;RT-PCR显示NSE、NFL,MAP-2的mRNA表达阳性,GFAP有较弱的表达;蛋白质印迹可见两组诱导剂诱导的细胞均表达神经元的特异性标记抗体NSE。结论 BDNF能单独诱导MSCs分化形成神经元样细胞,而且分化后细胞的存活时间长,有望用于治疗脑缺血、神经变性等疾病。     

胎儿心脏间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的建立胎儿心脏间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)的分离培养方法,并检测其表面标志及多向分化潜能。方法取胎龄4~5月水囊引产胎儿心脏,用1.073 g/mL的Percoll密度梯度离心分离低密度细胞,MSC培养基纯化贴壁细胞,用流式细胞术检测其表面标志,成脂肪及成骨诱导鉴定多向分化潜能,并与胎儿骨髓MSC对比,研究其增生及生长特征。结果流式细胞术证明,胎心MSC表达干细胞标志,具有间充质细胞的特征及多向分化能力。原代及传代培养显示,同胎儿骨髓MSC一样,胎儿心脏MSC具有活跃增生的能力。结论胎儿心脏中可成功地分离MSC,为组织工程的种子细胞和基因工程的载体细胞提供了新的可行的来源。     

胎儿肝脏与骨髓间充质干细胞的分离鉴定

目的：建立胎儿肝脏与骨髓间充质干细胞(MSCs) 的分离培养方法,并对两种来源细胞的生物学特性加以鉴定。方法：取胎龄4或5月水囊引产胎儿肝脏和骨髓,用1.073 g·mL^-1的percoll密度梯度离心分离低密度细胞,MSCs培养基纯化贴壁细胞,用流式细胞术检测其表面标志,成脂肪及成骨诱导鉴定多向分化潜能,对比两种来源的MSCs增殖及生长特征。 结果：胎儿肝脏及胎儿骨髓MSCs CD29、CD44、CD73（SH-3,4）、CD105（SH-2）、CD166、HLA-ABC阳性,CD35、CD45、HLA-DR阴性,均能成脂肪及成骨诱导分化,随MSCs 数量增加,其对外周血T 淋巴细胞转化的抑制作用增强。结论：胎儿肝脏和骨髓中可成功分离MSCs。     

人脐血间充质干细胞的分离培养与向神经元样细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨来源于人脐血的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分化成神经元样细胞的可行性，以及在体外分离、纯化和扩增的条件。方法 无菌条件下收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血，经肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞，以偏酸性的Mesencult^TM作为培养基进行培养和纯化，获得贴壁细胞，取扩增第三代后的MSCs向神经元样细胞诱导分化。用免疫荧光标记方法检测神经元特异性标记物。结果 来源于脐血的单个核细胞种植于特定的培养基中后，可产生贴壁细胞，主要表现为破骨样和间充质样细胞；传3代后，这些细胞可得到纯化、扩增；免疫组化标记显示经诱导后的MSCs表达神经丝蛋白(NF)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)。结论 源于脐血的MSCs在体外可以培养、扩增，并向神经元样细胞分化，可作为神经干细胞的来源而用于实验研究和临床。     

体外诱导小鼠胎肝间充质干细胞向胰岛B样细胞分化的研究

目的:体外分离和定向诱导小鼠胎肝间充质干细胞向胰岛B样细胞分化.方法:无菌条件下从正常C57BL/6J胎鼠肝中分离出间充质干细胞,体外培养传3代后用高浓度葡萄糖培养基以及碱性纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和尼克酰胺诱导分化,观察胎肝间充质干细胞诱导前后形态变化;用RT-PCR检测细胞诱导前后胰十二指肠同源异型基因盒1(pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1)、胰岛素原1(proinsulin-1,INS-1)、葡萄糖转运子2(glucose transporter-2,GLUT-2)表达情况;胰岛素免疫细胞化学染色鉴定诱导后细胞胰岛素的表达;在形成胰岛样细胞簇后,用双硫腙做胰岛B细胞特异性染色.结果:RT-PCR显示诱导5 d后PDX-1、INS-1、GLUT-2均有表达,而诱导前的细胞则没有检测到表达;胰岛素免疫细胞化学表明细胞簇内的细胞胰岛素染色强阳性;细胞簇双硫腙染色阳性(每个T-25培养瓶有80～120个).结论:从胎肝中分离出的间充质干细胞在体外可以定向诱导分化为胰岛B样细胞.     

人骨髓间充质干细胞体外定向分化为心肌细胞的实验研究

目的：建立人骨髓间充质干细胞（MSCs）体外定向分化为心肌细胞的实验模型。方法：取6个月水囊引产胎儿股骨骨髓,Percoll分离液分离,取单个核细胞层在人MSCs专用MSCGM培养基中体外培养。将第3代生长状态良好的MSCs用10μmol／L 5-氮胞苷孵育诱导24h,继续向心肌细胞诱导分化。结果：用Percoll分离液（1．073g／ml）分离得到的单个核细胞48～72h呈纺锤形、梭形、多角形的多型性改变;经5-氮胞苷孵育24h,细胞逐渐向梭形心肌细胞样形态转变,胞浆中可见棕黄色颗粒。结论：MSCs在体外经5-氮胞苷孵育24h,可被定向诱导分化为心肌形态的细胞。     

OECs无血清上清液体外诱导UB-MSCs向神经细胞分化

目的:观察大鼠嗅鞘细胞无血清上清液诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化的作用。方法:采用差速贴壁联合阿糖胞苷抑制法获得较高纯度的嗅鞘细胞,在最佳状态细胞无血清培养后取上清液。收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,采用差速贴壁法纯化间充质干细胞,传第三代后用上述收集的嗅鞘细胞无血清上清液诱导,观察诱导分化过程,免疫组化鉴定分化结果。结果:用差速贴壁和阿糖胞苷抑制法可获得纯度高达95%的嗅鞘细胞,使用无血清嗅鞘细胞上清液培养脐血间充质干细胞后,发现能诱导脐血间充质干细胞向神经细胞形态分化,胞体呈椭圆形,伸出长突起。诱导7天后相差显微镜下可观察到神经干细胞、神经元和胶质细胞形态的细胞,与NSE、GFAP细胞免疫组化结果一致。结论:大鼠嗅鞘细胞无血清上清液有明显诱导脐血间充质干细胞分化为神经细胞的作用。     

鼠胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

目的：分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨鼠胶质瘤细胞上清液对其向神经元样细胞的诱导分化。方法：利用Percoll梯度分离法,培养人MSCs。采用鼠胶质瘤细胞上清液对MSCs进行诱导分化。观察人MSCs经诱导后细胞的形态变化,采用免疫细胞化学方法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。 结果：诱导24 h后,细胞胞体收缩呈锥形或球形,有突起长出,细胞间突起相互连接,交错成网,为典型的神经元样形态。免疫细胞化学结果显示,经诱导培养后的神经元样细胞的胞体及部分突起NSE和NF染色呈强阳性表达,而GFAP 染色呈阴性。诱导组出现NSE阳性的细胞率为(79.5±3.2)%,而对照组出现NSE阳性的细胞率为(12.1±2.0)%,两组之间比较差异有显著性 (P<0.01)。诱导组出现NF阳性的细胞率为(41.2±2.4)%,而对照组为阴性。结论：鼠胶质瘤细胞上清液可以诱导MSCs向神经元样细胞分化。     

筛选后的巢蛋白阳性细胞流式鉴定及诱导分化

目的观察胎儿胰腺来源的巢蛋白阳性细胞(符合医学伦理学)是否具有与间充质干细胞类似的表面标志以及多向分化的潜能.方法从胎儿胰腺中分离的巢蛋白阳性细胞筛选后进行扩增,用流式细胞仪分析表面标志,并探讨这类细胞的成脂和成骨的分化潜能.结果筛选纯化后的巢蛋白阳性细胞的表面标志与骨髓间充质干细胞表面标志相似:此类细胞可在体外诱导为脂肪细胞或骨细胞.结论筛选纯化的胎儿胰腺来源的巢蛋白阳性细胞具有一定间充质干细胞的特性.     

体外诱导人脐带血间充质干细胞为软骨细胞的初步研究

目的探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)体外诱导人脐带血间充质干细胞(MSCs)向软骨细胞分化的可能性。方法由人脐静脉获得MSCs,纯化培养后用含100ng/ml IGF-1的培养基诱导,扫描电镜鉴定诱导后细胞。结果来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现形态学上可见间充质样的细胞,间充质样细胞为类似成纤维样的细胞形态。IGF-1诱导16天后,MSCs开始呈现软骨细胞特点。结论人脐带血MSCs可在体外经IGF-1诱导为软骨细胞。     

人血小板裂解液替代胎牛血清促进骨髓间质干细胞的增殖

目的探讨人血小板裂解液(human platelet lysates,HPL)对骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖以及生物学特性的影响。方法通过对机采血小板反复冻融获得HPL,采用密度梯度离心法从骨髓中分离MSCs,分别用10%胎牛血清(feotal calf serum,FCS)和LD-DMEM添加不同浓度的HPL进行培养,以确定最佳HPL浓度。分离6株人源MSCs,从原代开始分别用添加胎牛血清和最佳HPL浓度的LD-DMEM进行培养,对两种培养体系下6株不同来源的MSCs的增殖能力,表面标记表达量以及细胞周期进行研究,并利用t-test进行统计学分析,P<0.05视为有统计学差异。结果研究发现HPL中含有MSCs生长所必需的4种生长因子,PDGF-AB(人血小板衍生生长因子AB),bFGF(成纤维细胞生长因子),IGF-1(胰岛素样生长因子1),TGF-β1(转化生长因子β1),浓度分别为:(0.53±0.06)ng/ml,(37.5±4.31)pg/ml,(0.15±0.06)mg/ml,(5150±463)pg/ml。适合MSCs增殖的最佳HPL浓度为7.5%。两种培养条件下的细胞形态无明显区别,均为长梭形。8代以前,细胞增殖能力没有显著性差异(P>0.05),两种培养条件下的MSCs均表达CD105,CD106以及粘附分子CD29和CD44,不表达CD34,CD45,且其表达量没有显著性差异(P>0.05)。两种培养体系下绝大多数细胞处于G0-G1期,FCS培养的MSCs其G0-G1期占(96.97±0.95)%,7.5%的HPL培养的MSCs其G0-G1期占(94.58±1.56)%,两种培养条件下不同周期没有显著性差异(P>0.05)。结论本研究适合MSCs增殖的最佳HPL浓度为7.5%,HPL可以替代胎牛血清体外培养扩增人骨髓间质干细胞,并保持其生物学特性基本不变。