雷帕霉素对未成熟树突状细胞RelB表达的影响研究

目的:研究雷帕霉素(rapamycin,RAPA)对未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)RelB表达的影响,为回输RAPA处理的imDC(RAPA-imDC)诱导移植耐受的机制研究提供实验依据。方法:分离诱导imDC、RAPA-imDC、成熟树突状细胞(mature dendritic cell,mDC),光镜和电镜观察其形态,流式细胞仪检测其CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达,用免疫荧光法检测其RelB表达。结果:①电镜结果显示imDC与RAPA-imDC形态相似,呈未成熟状态,树突少、粗短;mDC树突较多,细长。②mDC表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达显著高于imDC和RAPA-imDC(P<0.05);而imDC的表达也明显高于RAPA-imDC(P<0.05)。③免疫荧光法检测结果显示imDC、RAPA-imDC RelB表达量无显著变化,而mDC表达量高。结论:雷帕霉素能降低imDC表面的CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达,但对其RelB表达没有明显影响。     

大鼠骨髓来源树突状细胞外泌体的提取及功能研究

目的:探讨在不同成熟状态下树突状细胞(dendritic cell,DC)分泌的外泌体(exosomes,Dex)的制备、提取及体外功能鉴定。方法:F344大鼠骨髓来源DC培养6后分为2组,一组为未成熟树突状细胞组(immature DC,imDC):直接收集上清;一组为成熟树突状细胞组(mature DC,mDC):每孔加入终浓度为1μg/ml的LPS培养48h后,收集上清。然后用多步离心法分离得到Dex,流式细胞术检测两组Dex的表型,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测两组Dex与Wistar大鼠骨髓来源的imDC共培养上清的白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素12(IL-12p70)的含量,混合淋巴细胞实验(MLR)检测共培养DCs刺激T细胞增殖能力。结果:与mDC分泌的exosomes相比,imDC分泌的exosomes表面中度表达MHC-Ⅱ类分子、低表达CD80、CD86、CD40共刺激分子,而且与Wistar大鼠骨髓来源的imDC共培养后刺激IL-12p70分泌能力较低(P<0.05),刺激T淋巴细胞增殖的能力也较mDC分泌的exosomes组弱(P<0.05)。结论:不同成熟状态下的DC分泌...     

慢性乙型肝炎患者外周血Treg细胞对DC细胞的抑制作用

目的 检测慢性乙型肝炎患者外周血中Treg细胞的比例,并探讨其对DC细胞的免疫抑制作用.方法 抽取慢性乙型肝炎(CHB)患者和正常对照组的外周血,流式细胞术检测CD4+CD25+Treg细胞的比例以及DC细胞表面CD80和人白细胞(位点)DR抗原(HLA-DR)的表达;在DC培养的不同时间内加入不同比例CHB患者的Treg细胞,检测DC对淋巴细胞增殖功能的影响;检测DC培养的不同时间内加入不同比例CHB患者的Treg细胞后培养上清中细胞因子白细胞介素-10(IL-10)和肿瘤转化因子-β(TGF-β)的表达.结果 正常人外周血中Treg(CD4+CD25+Foxp3+)细胞的比例为(4.12±1.36)％,CHB患者外周血中Treg细胞的比例为(10.54±3.27)％,CHB患者外周血中的Treg细胞比例明显高于正常组,差异有统计学意义;CHB患者表面分子CD80的表达为(60.12±5.23)％,HLA-DR的表达为(61.21±4.28)％;而正常组的CD80的表达为(84.13±4.33)％,HLA-DR的表达为(86.57±3.82)％,CHB患者DC细胞表面分子CD80和HLA-DR的表达均显著低于正常组,差异有统计学意义;经Treg细胞处理后,DC细胞刺激淋巴细胞的增殖能力下降,淋巴细胞增殖的抑制率较正常组均显著升高;Treg细胞与DC细胞比例为1∶1、1∶10以及1∶100时,IL-10和TGF-β的表达均显著高于正常组,并且随着Treg细胞的比例增高,细胞因子的水平也相应增高,差异有统计学意义.结论 CHB患者外周血中Treg细胞比例增高,可能是通过诱导IL-10和TGF-β的表达抑制DC细胞的免疫功能.     

过敏性哮喘患者树突状细胞对原始T细胞活化的影响

目的　探讨过敏性哮喘病人和正常人外周血单个核细胞 (PBMC)来源树突状细胞(DC)表达表面分子 (CD1a、CD83、CD4 0、CD86 )和细胞因子 (IL -1 2 )的差异及其对Th1和Th2型细胞因子平衡的影响。方法　分别取哮喘患者和正常人外周血经Ficoll和不连续密度梯度离心法获取贴壁细胞 ,加入细胞因子 (GM CSF和IL 4)体外培养为不成熟DC(iDC) ,给予LPS刺激使其发育为成熟DC(mDC)。另取脐血同上方法获得非贴壁细胞 ,分别加CD4单抗和CD4 5RA单抗及磁珠分离得到原始T淋巴细胞 ,分别将两组mDC和原始T细胞共培养。使用流式细胞仪 (FACS)检测树突状细胞表面共刺激分子CD1a、CD83、CD4 0、CD86的表达 ,通过ELISA法检测mDC分泌的IL -1 2及T细胞分泌的IFN -γ和IL- 4的含量。结果　 (1 )哮喘组PBMC来源DC表达CD86分子比对照组显著升高(P <0 . 0 1 )。 (2 )哮喘组DC产生IL- 1 2及其亚单位p4 0均较正常对照组显著减少 (P值均 <0 . 0 1 ) ;(3)混合淋巴细胞反应中 ,哮喘组T细胞释放Th1型细胞因子IFN -γ较对照组减少 (P <0 . 0 5 ) ,Th2型细胞因子IL -4较对照组显著增多 (P <0 . 0 1 ) ;(4)哮喘组CD86表达水平与IL 4浓度呈正相关(r=0 5 4 87,P <0 . 0 5 ) ;(5 )哮喘组IL- 1 2水平与IFN -γ水平呈正相关 (r =0 . 75 81 ,P <0 . 0     

HBV无症状携带者树突状细胞的分化及功能研究

目的 研究HBV无症状携带者树突状细胞的分化及功能.方法 抽取健康对照者(A组)、HBV无症状携带者(B组)外周静脉血,经密度梯度离心法分离获得PBMC,用TNF-α、IL-10分别和rhIL-4、rhGM-CSF刺激培养,获得:成熟树突状细胞(mDC)、不成熟树突状细胞(imDC).rhIL-4、rhGM-CSF刺激培养获得树突状细胞(DC)作组内对照.imDC组加入TNF-α刺激,检验imDC的稳定性.流式细胞仪检测各组反映树突状细胞成熟度的各种分子.结果 A、B组内mDC细胞膜表达HLA-DR,HLA-ABC分子,分泌的IL-12p70与imDC、DC、imDC+TNF-α组相比明显增加;A、B组间mDC的HLA-DR,HLA-ABC表达无显著性差异,IL-12p70分泌差异有统计学意义(P<0.01).imDC的HLA-ABC、HLA-DR低表达,IL-12p70分泌也较低,与本组内DC比较结果差异有统计学意义(P<0.01);A、B组间imDC的HLA-DR,HLA-ABC低表达,IL-12p70分泌差异无统计学意义.imDC加入TNF-α后HLA-ABC、HLA-DR仍低表达,IL-12p70分泌低于本组内DC,结果差异有统计学意义(P<0.01);A、B组间结果无显著性差异.结论 在A、B组,TNF-α均有效促进DC成熟为mDC,IL-10均抑制DC的成熟,不受A、B组细胞来源影响.mDC分泌大量IL-12p70,并在B组低于A组,说明B组mDC存在一定的功能不足.     

高乳酸血症对脓毒症小鼠树突状细胞功能的影响及作用机制

背景 树突状细胞(dendritic?cell,DC)功能障碍是脓毒症发生发展的重要原因之一.乳酸作为无氧糖酵解重要中间代谢产物,对多种免疫细胞包括DC具有明显的抑制效应.目的 探讨脓毒症小鼠高乳酸血症对DC功能的影响及作用机制.方法 C57BL/6小鼠随机分为假伤组及脓毒症组.采用盲肠结扎穿孔术构建小鼠脓毒症模型,通过血气分析仪检测小鼠外周血乳酸浓度.抗小鼠CD11c+免疫磁珠分离脾树突状细胞,流式细胞仪检测DC表面分子CD80、CD86及主要组织相容性复合体-Ⅱ(major?histocompatibility?complex-Ⅱ,MHC-Ⅱ)表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、IL-4、IL-12及γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)细胞因子表达;激光共聚焦显微镜观察自噬体的形成及数量.结果 脓毒症组小鼠外周血乳酸浓度较假伤组明显升高,且在术后24?h及48?h较为显著[24?h:(2.61±0.54)?mmol/L?vs(1.43±0.58)?mmol/L,P<0.01;48?h:(2.12±0.51)?mmol/L?vs?(1.32±0.53)?mmol/L,P<0.01].脓毒症组小鼠DC表面分子CD80及MHC-Ⅱ表达在24?h时较假伤组明显升高(CD80:61.40％ ± 9.20％?vs?7.94％±1.01％,P<0.05;MHC-Ⅱ:79.91％±8.32％?vs?30.34％±2.47％,P<0.05),并能有效刺激T细胞IFN-γ分泌,诱导T细胞向Th1极化,而脓毒症组小鼠48?h时DC功能出现明显抑制,并诱导T细胞向Th2极化(IFN-γ/IL-4:0.41±0.06?vs?1.00±0.00,P<0.01).乳酸体外刺激可显著抑制DC功能,导致其表面分子表达及刺激T细胞分泌能力显著下调[脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)组vs乳酸组.CD80:5.11％±0.52％?vs?0.09％±0.02％,P<0.01;MHC-Ⅱ:96.89％±0.16％?vs?95.96％±0.20％,P<0.05;CD86:67.26％±1.23％?vs 32.45％±2.95％,P<0.01;IL-2:(3.12±1.25)?pg/mL?vs?(0.44±0.14)?pg/mL,P<0.05],LPS联合乳酸刺激DC呈现出相同的趋势,且与乳酸组差异无统计学意义(P>0.05).脓毒症暴露和乳酸刺激均可诱导DC自噬过度活化,分别予以3-MA及Bafilomycin干预自噬均可有效逆转乳酸对DC功能的抑制效应.结论 脓毒症小鼠高乳酸血症可能是DC功能紊乱的重要原因,乳酸可通过诱导过度细胞自噬的方式介导DC应答障碍.     

小鼠骨髓源半成熟树突状细胞的培养与初步鉴定

目的探索培养与鉴定小鼠骨髓来源半成熟树突状细胞(smDC)的可行方法。方法分离、纯化6周龄C57BL/6小鼠骨髓单核细胞,以含10%胎牛血清、2 ng/ml重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和20ng/ml重组小鼠白细胞介素(IL)-4的RPMI-1640培养基培养9 d;再以肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(40 ng/ml)刺激24 h获得smDC,同时以脂多糖(1μg/ml)刺激和不加刺激培养24 h获得成熟DC(mDC)和未成熟DC(iDC)。扫描电子显微镜、流式细胞术、ELISA检测iDC、smDC和mDC的形态、细胞表面标志及细胞因子的表达。建立体外淋巴细胞反应模型,采用细胞计数试剂盒检测smDC对异基因淋巴细胞的活化作用。结果smDC的体积介于iDC和mDC之间、多呈类圆形或圆形,胞体直径约为15μm,树突长度多在5~10μm。smDC、iDC与mDC均高表达CD11c,smDC表达CD40、CD80、CD86及MHC-Ⅱ介于iDC和mDC之间。smDC分泌IL-1β、IL-6和IL-12显著低于mDC(P<0.01)、分泌IL-12显著低于iDC(P<0.05),分泌IL-1β、IL-6与iDC比较差异无显著性(P>0.05);smDC、iDC与mDC分泌IL-10差异无显著性(P>0.05)。smDC对异基因淋巴细胞激活作用显著低于mDC和阳性对照(P<0.01),而与阴性对照和iDC差异无显著性(P>0.05)。结论smDC可能是一个功能和形态上相对独立的DC亚群,体外利用GM-CSF、IL-4和TNF-α诱导骨髓单核细胞是获得smDC的有效方法。     

Smad3小干扰RNA在转化生长因子β1作用下对树突状细胞成熟及功能的影响

目的 研究通过RNA干扰技术阻断外周单核细胞来源的树突细胞(DC)内的Smad3,并在转化生长因子β1(TGF-β1)作用下对DC的成熟和免疫抑制作用的影响.方法 设计针对Smad3特异性小干扰RNA(siRNA),利用RNAiMAX转入DC,并用RT-PCR检测转染效果.实验分Control-DC组、TGF-β1-Control-DC组、TGF-β1-Negative siRNA-Smad3 DC组和TGF-β1-siRNA-Smad3 DC组.流式检测各组DC成熟表型的变化,ELISA检测各组DC上清白细胞介素12(IL-12)的水平,CCK-8法检测DC刺激同种异体T细胞增殖的能力.结果 TGF-β1-siRNA-Smad3 DC组表面成熟标志CD80、CD83、CD86、HLA-DR及IL-12分泌水平明显高于TGF-β1-Control-DC组和TGF-β1-Negative siRNA-Smad3 DC组(P＜0.05),且TGF-βNegative siRNA-Smad3 DC组刺激同种异体T细胞增殖的能力显著增强.结论 通过阻断DC的Smad3表达,可以逆转TGF-β1对DC成熟和免疫功能的抑制.     

肝癌组织中浸润树突状细胞的数量和表面分子表达的临床意义

目的:研究人肝癌组织中浸润树突状细胞(DC)的数量和表面分子表达的临床意义.方法:原发性肝细胞癌(肝癌)术后组织标本30例,采用免疫组化方法(即用型两步法SupervisionTM)检测肝癌组织中DC标志蛋白S-100的表达;从肝癌组织中分离浸润性单个核细胞,流式细胞术检测DC的表面分子表达,并用RT-PCR技术检测肝癌组织IL-10、TGF-β1和VEGF-AmRNA.结果:肝癌组织中DC的数量少,高分化肝癌组织中DC浸润数量[(27.22±15.38)个/HPF]高于低分化肝癌[(11.92±8.56)个/HPF](P＜0.01);肝癌组织中浸润DC的表面分子如CDla、HLA-DR、CD80、CD86和CD54等MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子,共刺激分子和黏附分子存在低表达或不表达,与肝癌的分化程度密切相关.在mRNA水平上,IL-10、TGF-β1和VEGF-A基因在肝癌组织中的表达显著高于正常肝组织(P＜0.001,P＜0.05).结论:肝癌组织中浸润DC的数量减少并存在功能缺陷,与肝癌分化程度密切相关.     

大鼠骨髓树突状细胞的体外分离培养及生物学特性研究

目的 探讨体外分离培养大鼠骨髓来源树突状细胞(DC)的方法并对其生物学特性进行研究.方法 应用粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4诱导培养从大鼠管状骨中提取的骨髓细胞5 d后,将细胞分成脂多糖(LPS)刺激组和未刺激组(对照组),48 h后进行形态学观察,用流式细胞仪检测组织相容性复合体Ⅱ(MHC-Ⅱ)和CD80的表达,用ELISA法测定培养上清中IL-6和IL-12的含量.结果 培养的大鼠骨髓细胞具有树突状突起,具有DC的典型形态.培养7 d后,对照组MHC-Ⅱ、CD80表型表达阳性率分别为5713%和29.1%,LPS刺激组MHC-Ⅱ、CD80表型表达阳性率分别为70.9%和73.5%;LPS刺激组IL-6和IL-12含量高于未刺激组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 成功建立了大鼠DC体外分离培养和诱导成熟的方法;在分化成熟过程中,DC在表型和细胞因子分泌功能上均发生了变化.     

结肠癌细胞总RNA电穿孔法体外转染成熟树突状细胞

目的：探讨结肠癌细胞总RNA电穿孔法转染成熟树突状细胞（mDCs）的转染效率及对树突状细胞(DCs）特征和功能的影响,为DCs核酸肿瘤疫苗的制备及其在临床应用奠定基础。方法： 用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白细胞介素4（rhIL-4）将人外周血单核细胞(PBMC)诱导成未成熟树突状细胞（imDCs）,肿瘤细胞坏死因子-α（TNF-α）作用24 h刺激其成熟。实验设为imDCs组和mDCs组。Trizol法提取特异表达癌胚抗原(CEA)的结肠癌细胞SW480总RNA,电穿孔法将总RNA转染mDCs,设为RNA转染DCs组。流式细胞术检测各组细胞表面分子标志变化和转染DCs组的CEA蛋白表达情况。ELISA法检测各组细胞IL-12分泌水平。结果：rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α能将PBMC诱导成具有典型毛刺样突起形态学特征的DCs。imDCs组DCs表面CD1a表达呈阳性,CD80弱阳性,CD83阴性。mDCs组DCs表面CD1a、CD83、CD80表达均呈阳性。RNA转染DCs组DCs表面CD1a、CD83、CD80表达均呈阳性。总RNA转染mDCs后4 h检测到CEA蛋白表达。mDCs组、RNA转染DCs组IL-12分泌量与imDCs组比较均显著升高（P＜0.01), 而mDCs组与RNA转染DCs组比较差异无显著性（P>0.05)。结论：结肠癌细胞总RNA可通过电穿孔法转染mDCs并表达CEA蛋白,电穿孔不改变mDCs的表面分子特征及功能。     

负载NY-ESO-1多肽的树突状细胞激发特异性细胞毒性T淋巴细胞反应

目的:探讨以NY-ESO-1为靶抗原、树突状细胞(dendritic cell,DCs)为抗原载体激发特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)反应的能力,以明确特异性CTLs的抗肿瘤免疫功能.方法:在临床前实验基础上选择2014年11月至2015年10月于中国医学科学院肿瘤医院治疗的符合入选标准的15例Ⅱ～Ⅲ期HLA-A0201+NY-ESO-1+胃癌患者外周血,分离单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)和外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes,PBLs),并诱导出成熟DCs (mature dendritic cell,mDCs);将人工合成的NY-ESO-1多肽负载mDCs后通过流式细胞仪(flow cytometry,FCM)分析细胞表型,检测体外反复致敏PBLs后负载NY-ESO-1的DCs激发特异性CTLs的能力以及CTLs对NY-ESO-1+胃癌细胞的体外杀伤活性,同时患者回输CTLs细胞,每2周1次,共回输2次,检测回输前后患者外周血细胞因子和特异性CTLs水平变化.结果:采用FCM分析DCs细胞表型显示HLA-DR+ CD11c+细胞为93.6％±1.2％,其中CD80+细胞为87.3％±3.6％,CD83+细胞为82.8％±2.5％,CD86+细胞为93.4％±6.4％.患者外周血分离的PBLs经NY-ESO-1多肽负载的DCs反复诱导后,细胞不断增殖,其中未负载多肽的DCs也能促进PBLs增殖,但细胞增殖指数(proliferation index,PI)明显低于负载多肽的DCs,两者比较差异有统计学意义(P＜0.05).负载NY-ESO-1多肽DCs诱导的NY-ESO-1多肽特异性的CTLs比例较未负载NY-ESO-1多肽DCs诱导的对照组明显升高(5.2％±1.2％vs0.4％±0.1％,P＜0.05),且致敏后CTLs对NY-ESO-1+胃癌细胞及负载NY-ESO-1+多肽T2靶细胞的杀伤率明显高于对照组.输注CTLs细胞后,患者体内血清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-12水平较治疗前显著升高[(132.9±10.2)μg/Lvs.(46.4±3.1)μg/L;(101.3±6.4) μg/Lvs.(26.7±1.2) μg/L;(51.3±2.6) μg/Lvs.(26.4±1.1) μg/L;P均＜0.05],且患者外周血特异性CTLs细胞比例明显升高.结论:负载NY-ESO-1多肽的DCs体内外均具有激发特异性CTLs反应的能力,可诱导明显的抗肿瘤免疫效应.     

结直肠癌组织中树突状细胞标志物CD1a和CD83的表达及意义

目的：探讨结直肠癌组织中不同分化阶段树突状细胞（DCs）形态、数量和表型的差异,阐明DCs在结直肠癌发生和发展中的作用。方法：收集结直肠癌标本20例(结直肠癌组),同时选取癌旁正常组织（距癌>5 cm）20例作为正常对照组,应用免疫组织化学法检测不同分化阶段DCs的分布、形态和数量。应用Western blotting法检测DCs表面标志物CD1a和CD83的表达。结果：免疫组织化学法,2组DCs均分布于腺体和血管间;2组CD1a+未成熟型DCs（imDCs）均呈圆形和卵圆形,树突状突起依稀可见,结直肠癌组CD1a+imDCs的数量较正常对照组明显增多（P<0.01）;2组CD83+成熟型DCs（mDCs）形态均不规则,有多个突起,呈分枝状,结直肠癌组CD83+mDCs的数量较正常对照组明显减少（P<0.01）。Western blotting法,与正常对照组比较,结直肠癌组CD1a蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,而CD83蛋白表达
水平明显降低（P<0.01）。结论：CD1a+imDCs在结直肠癌的发生发展中可能具有促进作用,而CD83+mDCs在结直肠癌的发生发展中可能具有抑制作用。
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T-cell proliferation is inhibited by the induction of indoleamine 2,3-dioxygenase in spleen-derived dendritic cells in rat

Background  Increasing evidence suggests that, by the production of indoleamine 2, 3-dioxygenase (IDO), dendritic cells (DC) may reduce the activity of T lymphocytes and inhibit T lymphocyte proliferation-induced immune tolerance. One promising way is inspired by increasing IDO expression in DC cells for immune tolerance after transplantation. The aim of this work was to examine the effect of interferon-γ (IFN-γ) on the expression of IDO by DC.

Methods  Spleen-derived rat DCs were cultured and induced by cytokines, and the expression of OX62 and surface molecules CD80 and CD86 were measured with flow cytometry. After the DCs were induced by IFN-γ at different concentrations (0, 100, 300, 500 U/ml), the expression levels of IDO mRNA were measured with real-time PCR, and the expression levels of IDO protein in DCs were measured with Western blotting. The allogeneic mixed lymphocyte reaction (MLR) was used to test the effects of DCs incubated with different concentrations of IFN-γ on allogeneic T lymphocyte proliferation.

Results  Under the microscope, the DCs induced by IFN-γ showed a typical dendritic morphology. The expression rate of OX62 was above 80% and the positive expression rates of CD80 and CD86 were both about 80%. The expressions of IDO mRNA and IDO protein increased gradually with the increase of IFN-γ concentration, showing statistical significance in the differences between the groups (P <0.05). Compared with the control DC, the DC incubated with IFN-γ had a notable decrease in allostimulatory activity (P <0.05). With the increasing IFN-γ concentration, the T lymphocyte proliferation decreased, and the difference between the groups was also statistically significant (P <0.05).

Conclusions  The highly purified spleen derived rat DCs can be successfully acquired through the improved adhesion in-vitro method. IFN-γ can induce increased expression of IDO in spleen-derived rat DCs and reduce the spleen DCs’ capacity to stimulate the proliferation of allogeneic T cells.

     

他克莫司对小鼠髓样树突状细胞成熟及抗原呈递的干预作用研究

目的 研究他克莫司（Tacrolimus, FK506）对小鼠骨髓来源的树突状细胞（bonemarrow-derived dendritic cells, BM-DCs）成熟分化以及抗原呈递功能的影响。 方法 分离诱导imDCs、mDCs 和 FK-DCs;显微镜下观察细胞形态,流式细胞术检测表面分子 CD80、CD86、CD40 和 MHC II 的表达,ELISA 检测培养上清中 IL-12、IL-6 及 TNFα 的分泌水平,CFSE细胞增殖试剂盒检测 FK506 对 mDCs 刺激同种异型的 T 细胞增殖的影响。结果 与 vehicle组相比,FK-DCs 光镜下形态未见明显改变; mDCs CD80、CD86、CD40 和 MHC II 表达均有明显下调,差异有统计学意义（p 〈 0.05）;细胞因子的分泌水平明显降低,差异有统计学意义（p 〈 0.05）;FK-DCs 刺激同种异型 T 细胞增殖水平有明显降低（1﹕10 和 1﹕30 组）,差异有统计学意义（p 〈 0.05）。 结论 FK506 在体外可显著抑制 LPS 刺激的 DC 成熟和抗原呈递功能。     

In vitro induction of specific anti-tumoral immunity against laryngeal carcinoma by using human interleukin-12 gene-transfected dendritic cells

Background  Objective evaluation of the antitumor effect of interleukin-12 (IL-12) gene-transfected dendritic cell (DC) vaccine on laryngeal carcinoma requires in vivo and in vitro tests. The aim of this study was to investigate the function of IL-12 gene transfected DC at initiating specific immune response to laryngeal carcinoma in vitro．

Methods  Recombinant adenovirus with IL-12 gene was constructed. DCs were isolated from the peripheral blood of patients with laryngeal carcinoma, pulsed with tumor lysate of laryngeal carcinoma cells (DC⁺Ag), and transfected with IL-12 (DC-IL-12⁺Ag). The cells pheotypes including CD83, CD86 and HLA-DR on surface of DCs were assayed by flow cytometry (FCM). The concentration of IL-12 in culture supernatant of DCs and interferon γ (IFN-γ) in culture supernatant of T cells cocultured with DCs were quantified by ELISA. Methyl thiazolys tetrazolium (MTT) was used to evaluate proliferation of autologous T lymphocytes and activation of cytotoxic T lymphocytes (CTL) stimulated by IL-12-transfected DCs pulsed with tumor lysate against laryngeal carcinoma cells.

Results  The recombinant adenovirus expressing IL-12 gene was constructed successfully. Gene-transfected DC plused with tumor lysate with IL-12 (DC-IL-12⁺Ag) expressed higher level of CD83, CD86 and produced higher level of IL-12 than untransfected DCs (DC⁺Ag) (CD83: (60.2±1.8)% vs. (50.7±1.2)%, P <0.05; CD86: (88.9±2.1)% vs. (78.2±3.9)%, P <0.05; IL-12: (262.5±3.0) ng/L vs. (103.8±5.1) ng/L, P <0.05). The proliferation of autologous T lymphocytes and production of IFN-γ stimulated by DC transfected with IL-12 were more obviously than untransfected DCs. Cytotoxicity of CTL stimulated by IL-12-transfected DC pulsed with tumor lysate against laryngeal carcinoma cells were significantly stronger than stimulated by untransfected DC.

Conclusion  It is a promising approach for IL-12-transfected DC pulsed with tumor lysate to increase the antitumoral effect.

     

GITRL在脂多糖所致树突状细胞免疫麻痹中的作用

目的观察脂多糖所致脓毒症小鼠树突状细胞GITRL表达及免疫功能的改变。方法以10 ng/mL脂多糖刺激体外诱导小鼠树突状细胞模拟脓毒症免疫麻痹体系,利用流式细胞术和Brd U细胞增殖反应试剂盒分别检测树突状细胞表面分子CD11c、CD80和GITRL表达、混合淋巴细胞增殖反应及CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg水平。结果脂多糖引起树突状细胞标志分子CD11c、CD80和负调控分子GITRL的表达分别由6.97%、2.61%和22.39%增加到16.02%、13.35%和49.74%,差异均有统计学意义(P0.01)。平均荧光密度值由4.81增加到17.95,差异有统计学意义(P0.01)。然而抗原特异性混合淋巴细胞反应OD值由0.532减少为0.419,差异有统计学意义(P0.01),并且GITRL激活的CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg由5.71%增加到8.31%,差异有统计学意义(P0.05)。结论脂多糖所致脓毒症小鼠树突状细胞表达高水平的免疫共抑制GITRL分子,通过GITRL-GITR激活Treg细胞抑制T细胞增殖和功能,引起免疫麻痹状态。     

丹参多酚酸盐负性调节小鼠骨髓来源树突状细胞成熟及其部分免疫功能

目的:观察丹参多酚酸盐对小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDC)成熟及其部分免疫学功能的影响。方法:小鼠BMDC体外培养时加入促成熟剂脂多糖(DCLPS)或同时加入脂多糖及丹参多酚酸盐(DCSV),其中丹参多酚酸盐设3个浓度:低浓度50μg/ml(SVL)、中浓度100μg/ml(SVM)、高浓度200μg/ml(SVH)。流式细胞仪分析各组细胞表面MHC-Ⅱ分子及共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达;FITC-Dextran内吞实验分析各组DC抗原吞噬功能;酶联免疫吸附实验(enzyme linked i mmunosorbent assay,ELISA)检测各组DC培养液上清白细胞介素(interleukin,IL)-12 p40水平。[3H]-TdR掺入法检测各组DC体外混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reactions,MLR)刺激同种反应性T细胞的增殖能力;ELISA法测定MLR上清IL-10、IL-2、干扰素(interferon,IFN)-γ水平。结果:与DCLPS相比,SVL、SVM、SVH细胞表面M...     

耐受性树突状细胞对哮喘小鼠气道变应性炎症反应的抑制作用

目的: 用卵白蛋白(OVA)刺激的未成熟树突状细胞(immature dendritic cell, imDC)免疫小鼠,观察其对小鼠OVA激发的气道过敏性炎症反应的抑制作用,探讨耐受性树突状细胞疫苗诱导免疫耐受的可能机制,为临床防治哮喘提供新的思路.方法: 制备BALB/c小鼠髓性imDC.其余BALB/c小鼠分4组,10只/组:其中两组于第-7天分别注射无菌PBS(PBS组)、OVA刺激的imDC(imDC组),第三组于第13～20天注射地塞米松(地塞米松组),第四组不作任何处理(健康对照组);除健康对照组外,其余各组诱导哮喘反应:第0天和第9天分别注射OVA致敏,14～20天每日予OVA气雾攻击.第21天每组处理5只小鼠,检测肺部炎症细胞浸润及嗜酸性粒细胞比例、气道黏液分泌、脾细胞Th1/Th2型细胞因子表达及脾细胞中CD4 CD25 细胞比例;第49天,处理剩余动物,观察哮喘预后.结果: mDC注射组肺部炎症浸润较轻,脾细胞表达白细胞介素(IL)-13、4降低而γ-干扰素(IFN-γ)无显著影响,脾细胞中CD4 CD25 细胞比例较高,气道黏液分泌则少于PBS组,且预后良好. 结论: 过敏原特异性imDC疫苗注射可在一定程度上缓解哮喘小鼠气道的变应性炎症反应.     

一种改良的小鼠诱导多功能干细胞(iPS)向树突状细胞(DC)分化的方法

 目的  建立一种简便经济的小鼠诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cell, iPS)向树突状细胞(dendritic cell, DC)分化的方法。方法  采用三段式培养法,将iPS细胞培养于op9细胞上,使用添加细胞因子GM-CSF(10 ng/mL)和 IL-4(10 ng/mL)的培养液,经过17天的培养收集到iPS诱导的DC,通过显微镜及细胞涂片观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面分子,抗原吞噬实验和混合淋巴细胞培养实验等对其形态、表面分子及细胞功能进行检测及评估。结果  本研究获得的iPS-DC在细胞形态上表现出明显的树突状特征;细胞表型上呈CD11b、CD11c双阳性;未经脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激的细胞呈未成熟DC的状态:细胞表面的第一信号分子MHCⅡ及第二信号分子CD40、CD80、CD86低表达,具有很强的抗原吞噬能力;经LPS刺激后细胞具有成熟DC的特征:MHCⅡ、CD40、CD80、CD86的表达均增高,同时具备对初始T细胞的激活能力。结论  本研究改良了小鼠iPS 细胞向DC分化的方法,缩短了培养时间,节省了培养成本。